松茸蟲草乳酸菌發(fā)酵物及其衍生化妝品、制法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，涉及松茸蟲草乳酸菌發(fā)酵物及其衍生化妝品、制法和 用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 松茸作為一種珍稀野生食藥用菌，屬國家二級瀕危物種，是世界性稀缺瀕危資源。 松茸是亞洲特有種，在我國主要分布在東北地區(qū)、云貴川地區(qū)和臺灣地區(qū)。松茸具有豐富的 營養(yǎng)價值和藥理作用，據(jù)研究表明松茸有抗腫瘤、抗糖尿病、抗突變、抗輻射、抗菌、增強免 疫力、保肝、促進胃腸功能和美白護膚、延緩衰老、延年益壽等多種有益作用。近年來，松茸 的美白和抗衰功效已經(jīng)越來越多地在化妝品中應(yīng)用。
[0003] 《中國藥典》記載，冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲 上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體。以下簡稱蟲草，性味甘，平。歸肺、腎經(jīng)。補腎益肺，止血 化痰。用于腎虛精虧，陽痿遺精，腰膝酸痛，久咳虛喘，勞嗽咯血?！侗静菥V目拾遺》記載："冬 蟲夏草性溫，補精益髓，此物保肺氣"?！侗静輳男隆酚涊d："蟲草甘、平，保肺益腎、止血、化痰、 止勞嗽"。冬蟲夏草在臨床上已被廣泛應(yīng)用于免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤、心、腦血管病、呼吸系統(tǒng)、 糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，還能預防疾病，有利于抗疲勞、延緩衰老、強身 健體。把蟲草的提取物加入化妝品中具有很高的營養(yǎng)價值和護膚作用。
[0004] 乳酸菌是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌，是發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽 孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱，絕大部分都是人體內(nèi)必不可少且具有重要生理功能的菌 群，廣泛存在于人體的腸道中。乳酸菌在工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)、食品和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān) 的重要領(lǐng)域應(yīng)用價值非常高。乳酸菌的主要發(fā)酵產(chǎn)物乳酸是皮膚中天然保濕因子NMF的組 成部分，同時乳酸的酸性可以應(yīng)用于化妝品行業(yè)中用于ph值的調(diào)節(jié)。目前，乳酸菌在美白保 濕化妝品中均有所應(yīng)用。
[0005] 但松茸、蟲草和乳酸菌均未見有曬后修護和抗敏等功效的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是以"生物轉(zhuǎn)化理論"為指導，采用松茸、蟲草與乳酸菌 的液體發(fā)酵體系提供一種具有曬后修護、抗過敏、抗衰功效的產(chǎn)品。
[0007] 本發(fā)明所解決的第一個技術(shù)問題是提供松茸蟲草與乳酸菌的液體發(fā)酵所得的松 茸蟲草液體發(fā)酵物。
[0008] 本發(fā)明松茸蟲草液體發(fā)酵物，以松茸、蟲草和水組成培養(yǎng)基，然后接種乳酸菌發(fā)酵 所得的液體發(fā)酵混合物；其中，培養(yǎng)基中以生藥計，松茸、蟲草的重量配比為1:9~9:1;松 茸、蟲草合計占液體發(fā)酵混合物的重量百分比為5~20%;乳酸菌的接種量為1.0X104~ 1.0X108cfu/ml〇
[0009] 上述技術(shù)方案中，培養(yǎng)基中松茸、蟲草的重量配比為9:1。
[0010]上述技術(shù)方案中，培養(yǎng)基中松茸、蟲草以生藥計，優(yōu)選松茸、蟲草合計占液體發(fā)酵 混合物的重量百分比為10%。
[0011]上述技術(shù)方案中，所述松茸為松茸的子實體，所述蟲草為麥角菌科真菌冬蟲夏草 菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體。
[0012] 上述技術(shù)方案中，乳酸菌的接種量優(yōu)選為1.0X106cfu/ml。
[0013] 本發(fā)明所解決的第二個技術(shù)問題是提供本發(fā)明松茸蟲草液體發(fā)酵物的制備方法， 包括以下步驟：
[0014] A、以松茸、蟲草和水組成培養(yǎng)基，
[0015] B、接種乳酸菌，接種量為1 ·0X104~1 ·0X108cfu/ml;
[0016] C、于30°C~40°C和0~200rpm的條件下培養(yǎng)1~5天，即得松茸蟲草液體發(fā)酵物。
[0017] 上述技術(shù)方案中，松茸、蟲草的重量配比為1:9~9:1。優(yōu)選的，松茸、蟲草的重量配 比為9:1。
[0018] 上述技術(shù)方案中，以生藥計，培養(yǎng)基中添加松茸、蟲草合計占液體發(fā)酵混合物的重 量百分比為5~20%;優(yōu)選，培養(yǎng)基中添加松茸、蟲草合計占液體發(fā)酵混合物的重量百分比 為 10%〇
[0019]上述技術(shù)方案中，步驟B乳酸菌的接種量優(yōu)選為1.OX106cfu/ml。
[0020]上述技術(shù)方案中，步驟C溫度優(yōu)選37°C。
[0021 ] 上述技術(shù)方案中，步驟C轉(zhuǎn)速優(yōu)選50rpm。
[0022] 上述技術(shù)方案中，步驟C培養(yǎng)時間為5天。
[0023] 上述技術(shù)方案中，步驟B接種采用的乳酸菌菌種可以選擇使用目前由各種常用方 式培養(yǎng)得到的菌種，如用于制造泡菜、酸奶的乳酸菌種等。
[0024]其中，一種優(yōu)選的菌種培養(yǎng)方式為：
[0025]將復蘇后的乳酸菌接種到乳酸菌液體培養(yǎng)基中，在30°C~40°C和0~200rpm的條 件下培養(yǎng)1~5天得到乳酸菌。
[0026] 上述技術(shù)方案中，所述的乳酸菌液體培養(yǎng)基中含有乳酸菌常規(guī)發(fā)酵的碳源、氮源、 微量元素和/或無機鹽成分，其中：碳源成分為液體培養(yǎng)基總重量的0.5%~10%，氮源成分 為0.5 %~3 %，微量元素和/或無機鹽成分為0.01 %~1 %，其余為水，滅菌即可。其中所說 的碳源、氮源都可以選擇目前通用培養(yǎng)基中的常用成分，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、牛肉膏、酵 母膏等常規(guī)培養(yǎng)基組成成分。進一步優(yōu)選所述滅菌為經(jīng)115~121°C滅菌15~30min。培養(yǎng)條 件為:在30°C~40°C和0~200rpm的條件下培養(yǎng)1~3天;優(yōu)選培養(yǎng)條件為:在37°C和50rpm的 條件下培養(yǎng)1天。
[0027] 本發(fā)明所解決的第三個技術(shù)問題是提供本發(fā)明松茸蟲草液體發(fā)酵物的用途，具體 表現(xiàn)為本發(fā)明松茸蟲草液體發(fā)酵物具有明顯的曬后修護、抗過敏、抗衰作用。
[0028] 本發(fā)明所解決的第四個技術(shù)問題是提供采用本發(fā)明松茸蟲草液體發(fā)酵物或其提 取物為活性成分，加入化妝品上可接受的輔料制備而成的化妝品。
[0029] 本發(fā)明制備的化妝品可為爽膚水、乳液、精華液、面霜、面膜、眼膜等常見的化妝 品。
[0030] 采用本發(fā)明松茸蟲草液體發(fā)酵物用于肌膚的護理，較單獨采用松茸提取物、蟲草 提取物或乳酸菌發(fā)酵物能夠明顯減輕UVB誘導HaCaT細胞的光損傷，具有明顯的抗皮膚光老 化作用，因此具有曬后修護作用；能夠降低DNCB誘導的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)，具有明 顯的抗過敏作用；能夠有效清除DPPH自由基和羥基自由基，具有良好的抗氧化作用，從而具 備明確的抗衰功效。本發(fā)明松茸蟲草液體發(fā)酵物按常規(guī)方法制備的化妝品也具有明確的曬 后修護、抗過敏、抗衰功效。
【具體實施方式】
[0031]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說 明，說明但不限制本發(fā)明。
[0032] ( - )液體培養(yǎng)基對乳酸菌的生長適應(yīng)性影響試驗
[0033] (1)按1.0X105cfu/ml接種量將乳酸菌分別接種于松茸、蟲草重量配比為1:9、5: 5、9:1(均以生藥計，合計的重量百分比為10%)的液體培養(yǎng)基中，于37°〇和50印!11條件下培 養(yǎng)5天，采用平板涂布法檢測發(fā)酵液中的乳酸菌菌落數(shù)。結(jié)果如表1所示。
[0034] 表1結(jié)果顯示，當松茸蟲草配比為9:1時，乳酸菌的長勢最佳，因此在液體發(fā)酵培養(yǎng) 基中，松茸、蟲草的最佳配比為9:1。
[0035] 表1松茸、蟲草配比對乳酸菌培養(yǎng)的影響
[0037] (2)按1.0X105cfu/ml接種量將乳酸菌分別接種于含有5.0%、10.0%、15.0%、 20.0%松茸蟲草(均以生藥計，松茸、蟲草重量配比為9:1)的液體培養(yǎng)基中，于37°C和50rpm條件下培養(yǎng)3~5天，采用平板涂布法檢測發(fā)酵液中的乳酸菌菌落數(shù)。結(jié)果如表2所示。
[0038]表2結(jié)果顯示，當松茸和蟲草的總含量為10.0%時，乳酸菌的長勢佳，且基本一致； 當培養(yǎng)基中松茸蟲草的濃度大于10%以后，乳酸菌的生長受到抑制。因此在液體發(fā)酵基中， 松茸和蟲草總含量的最適含量為10%。
[0039]表2松茸蟲草總含量和發(fā)酵時間對乳酸菌培養(yǎng)的影響
[0041]由表2結(jié)果還可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，乳酸菌的菌落數(shù)逐漸增加，從生產(chǎn) 成本考慮，確定本發(fā)明中乳酸菌的發(fā)酵時間為120h，S卩5天。
[0042] (3)按1.OX104、1.OX105和1.OX106cfu/ml接種量將乳酸菌分別接種于含有10% 松茸蟲草的液體培養(yǎng)基中，于37°C和50rpm條件下培養(yǎng)5天，采用平板涂布法檢測發(fā)酵液中 的乳酸菌菌落數(shù)。結(jié)果如表2所示
[0043]表3接種量對乳酸菌培養(yǎng)的影響
[0045] 由表3結(jié)果可以看出，發(fā)酵液中的活菌數(shù)隨著接種量的增加而增加，因此，確定本 發(fā)明中的接種量為1. 〇Xl〇6cfu/ml。
[0046] (二)本發(fā)明松茸蟲草液體發(fā)酵物的功效試驗及刺激性試驗
[0047] 以上述由以生藥重量計的松茸蟲草配比為9:1，合計含量按10.0%的百分比加入 培養(yǎng)基中，按1 .〇Xl〇6cfu/ml的量接種乳酸菌后，在37°C和50rpm條件下培養(yǎng)5天得到所說 的松茸蟲草液體發(fā)酵物，進行下述的功效試驗及刺激性試驗。
[0048] 1、UVB誘導的HaCaT細胞光損傷試驗
[0049] 松茸蟲草液體發(fā)酵物、松茸提取物、蟲草提取物冷凍干燥后用MEM完全培養(yǎng)基溶 解，濃度為lmg/ml，調(diào)節(jié)pH值至7.0，0.22μπι孔徑濾膜過濾除菌，4°C保存，臨用時以MEM完全 培養(yǎng)基稀釋成實驗所需濃度。將對數(shù)期HaCaT細胞接種于96孔板，37°C、5 %C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 待細胞貼壁后，分為正常對照組，模型對照組，松茸蟲草液體發(fā)酵物高、中、低劑量組（?〇〇μ g/ml，50yg/ml，25μg/ml)，松鸞組(50μg/ml)，蟲草組(50μg/ml)，乳酸菌液體發(fā)酵物組(50μ g/ml)，每組設(shè)6個復孔。培養(yǎng)24h，給予60mJ/cnf2UVB照射，培養(yǎng)24h。采用ΜΤΤ法對細胞活性進 行測定，向每孔（含180yL培養(yǎng)基）加入20yL濃度為5mg·mL-1的ΜΤΤ，孵育4h，棄上清，加入 150yLDMS0，置恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)振蕩lOmin，酶標儀測定各孔在492nm處吸光值(0D值），計 算細胞活性。取各組細胞培養(yǎng)液，進行LDH活性檢測，按LDH試劑盒說明書進行操作。
[0050] 表4各樣品對HaCaT細胞活性的影響
[0052] 注:與正常對照組比較廣P〈0.01;與模型對照組比較，#P〈0.05，##P〈0.01
[0053]試驗結(jié)果如表4所示，從試驗結(jié)果可知，與正常對照組比較，