[0131] 作為上述糖苷水解酶混合物中含有的上述耐熱性木糖苷酶之外的其他糖苷 水解酶，只要是具有木質(zhì)纖維素水解活性的酶即可，沒有特別的限制。作為上述糖苷水解酶 混合物中含有的上述β-木糖苷酶之外的其他糖苷水解酶，例如可列舉木聚糖酶等半纖維 素酶、纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶、或內(nèi)切葡聚糖酶等。作為本發(fā)明的糖苷水解酶混合 物，除了上述耐熱性β-木糖苷酶之外，還優(yōu)選含有半纖維素酶和內(nèi)切葡聚糖酶中的至少 一種糖苷水解酶的混合物，更加優(yōu)選含有半纖維素酶和內(nèi)切葡聚糖酶這兩種糖苷水解酶的 混合物。其中，除上述耐熱性β-木糖苷酶之外，還優(yōu)選含有選自由木聚糖酶、β-木糖苷 酶、纖維二糖水解酶及內(nèi)切葡聚糖酶構(gòu)成的組中的至少一種糖苷水解酶的混合物，更加優(yōu) 選含有木聚糖酶、β-木糖苷酶、纖維二糖水解酶及內(nèi)切葡聚糖酶全部這些糖苷水解酶的混 合物。
[0132] 上述糖苷水解酶混合物中含有的上述耐熱性木糖苷酶之外的其他糖苷水解 酶優(yōu)選為至少在85°C具有糖苷水解酶活性的耐熱性糖苷水解酶，更加優(yōu)選為在70~90°C 具有糖苷水解酶活性的耐熱性糖苷水解酶。通過使上述糖苷水解酶混合物含有的全部酶為 耐熱性的（例如酶活性的最適溫度或酶蛋白的熱變性溫度為70°C以上），能夠在高溫條件 下高效進(jìn)行基于上述糖苷水解酶混合物的木質(zhì)纖維素構(gòu)成的材料的分解反應(yīng)。即，上述糖 苷水解酶混合物僅含有耐熱性糖苷水解酶時(shí)，通過將上述糖苷水解酶混合物用于由木質(zhì)纖 維素構(gòu)成的材料的糖化處理，使得可以在糖化溫度為70~90°C的高溫環(huán)境下進(jìn)行木質(zhì)纖 維素水解反應(yīng)（高溫糖化：hightemperaturehydrolysis)。通過此高溫糖化，可以顯著減 少酶量和糖化時(shí)間，大幅降低糖化成本（hydrolysiscost)。
[0133][木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制備方法]
[0134] 本發(fā)明的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制備方法為包括利用本發(fā)明的耐熱性β-木糖 苷酶將由木聚糖酶水解半纖維素生成的低聚糖、或者由纖維二糖水解酶水解纖維素生成的 低聚糖水解為單糖，從而得到木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的方法。
[0135]另外，此處所述"木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物"是指通過例如木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的材料、 例如包含半纖維素或纖維素的木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的材料、優(yōu)選包含具有β木糖苷鍵的低 聚糖或具有β糖苷鍵的低聚糖的材料中的β木糖苷鍵或β糖苷鍵的斷開而生成的產(chǎn)物。 具體可列舉葡萄糖和木糖等單糖。
[0136] 具體而言，通過使木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的材料、例如包含半纖維素或纖維素的木質(zhì) 纖維素所構(gòu)成的材料、優(yōu)選包含具有β木糖苷鍵的低聚糖或具有β糖苷鍵的低聚糖的材 料與本發(fā)明的耐熱性β-木糖苷酶、本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體、利用本發(fā)明的耐熱性β-木糖苷酶的 制備方法制得的耐熱性β-木糖苷酶、或者本發(fā)明的糖苷水解酶混合物接觸，生產(chǎn)半纖維 素或纖維素分解產(chǎn)物，具體為生產(chǎn)通過β木糖苷鍵或β糖苷鍵的斷開而生成的產(chǎn)物。
[0137] 本發(fā)明的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制備方法的另一方面為如下方法，通過使木質(zhì) 纖維素所構(gòu)成的材料、例如包含半纖維素或纖維素的木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的材料、優(yōu)選包含 具有β木糖苷鍵的低聚糖或具有β糖苷鍵的低聚糖的材料與本發(fā)明的耐熱性木糖 苷酶、本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體、或者利用本發(fā)明的耐熱性木糖苷酶的制備方法制得的耐熱性 木糖苷酶接觸，主要生產(chǎn)通過半纖維素、優(yōu)選為具有β木糖苷鍵的低聚糖的β木糖苷 鍵部位的斷開而生成的產(chǎn)物，或者通過纖維素、優(yōu)選為具有β糖苷鍵的低聚糖的β糖苷鍵 部位的斷開而生成的產(chǎn)物（例如葡萄糖和木糖等單糖）。
[0138] 本發(fā)明的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制備方法的又一方面為如下方法，通過使木質(zhì)纖 維素所構(gòu)成的材料、例如包含半纖維素或纖維素的木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的材料與本發(fā)明的糖 苷水解酶混合物接觸，生產(chǎn)通過半纖維素或纖維素的β糖苷鍵部位的斷開而生成的產(chǎn)物 (例如葡萄糖和木糖等單糖）。
[0139] 作為木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的材料、例如包含半纖維素或纖維素的木質(zhì)纖維素所構(gòu)成 的材料、優(yōu)選包含具有β木糖苷鍵的低聚糖或具有β糖苷鍵的低聚糖的材料，只要含有半 纖維素或纖維素、優(yōu)選含有具有β木糖苷鍵的低聚糖或具有β糖苷鍵的低聚糖即可，沒有 特別的限制。作為上述材料，例如可列舉雜草或農(nóng)業(yè)廢棄物等纖維素類生物質(zhì)、或者廢紙 等。優(yōu)選在使上述材料與本發(fā)明的耐熱性木糖苷酶接觸前，先進(jìn)行破碎或切碎等物理 處理、利用酸或堿等的化學(xué)處理、或者浸漬或溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液中的處理等。
[0140] S卩，本發(fā)明的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制備方法還可以進(jìn)一步包括，在使上述材料 與本發(fā)明的耐熱性β-木糖苷酶接觸前，進(jìn)行物理處理、化學(xué)處理、或者浸漬或溶解于緩沖 液中的處理。
[0141] 利用本發(fā)明的耐熱性木糖苷酶進(jìn)行上述木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的材料的水解反 應(yīng)的反應(yīng)條件只要是使上述耐熱性β-木糖苷酶表現(xiàn)出纖維寡糖水解活性的條件即可。例 如優(yōu)選在60~90°C、ρΗ5. 0~9. 0的條件下進(jìn)行反應(yīng)，更加優(yōu)選在70~90°C、ρΗ5. 0~9. 0 的條件下進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)一步優(yōu)選在70~90°C、ρΗ6. 0~8. 5的條件下進(jìn)行反應(yīng)。上述水解 反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間可考慮供水解的上述材料的種類、預(yù)處理方法、或者用量等進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào) 整。例如進(jìn)行10分鐘~100小時(shí)，在分解纖維素類生物質(zhì)的情況下，能夠以1~100小時(shí) 的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行上述水解反應(yīng)。
[0142] 在上述木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的材料的水解反應(yīng)中，除了本發(fā)明的耐熱性β-木糖苷 酶之外，優(yōu)選還同時(shí)或者分別使用至少一種其他糖苷水解酶。作為其他糖苷水解酶，可以 使用與上述糖苷水解酶混合物中含有的糖苷水解酶一樣的糖苷水解酶，優(yōu)選的是，至少在 85°C、優(yōu)選至少在70~90°C具有糖苷水解酶活性的耐熱性糖苷水解酶。此外，上述木質(zhì)纖 維素分解產(chǎn)物的制備方法的一個(gè)方面為使用本發(fā)明的耐熱性β-木糖苷酶、本發(fā)明的轉(zhuǎn)化 體、或者利用本發(fā)明的耐熱性木糖苷酶的制備方法制得的耐熱性木糖苷酶，另一方 面為使用上述糖苷水解酶混合物。
[0143] 實(shí)施例
[0144] 下面示出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施 例。
[0145][實(shí)施例1]來自于溫泉土壤的新耐熱性β-木糖苷酶的克隆
[0146] 〈1>來自于溫泉土壤的DNA提取與全基因組序列（WholeGenomeSequence,WGS)
[0147] 以在70~90°C表現(xiàn)出活性的新耐熱性β-木糖苷酶的基因探索為目的，從中性~ 弱堿性溫泉采集土壤DNA，進(jìn)行構(gòu)成這些土壤的微生物群的基因組DNA的堿基序列解碼。
[0148] 作為中性~弱堿性溫泉土壤樣本，從在野外有噴出高溫溫泉的日本國內(nèi)的3處的 5個(gè)地點(diǎn)（宏基因組DNA樣本Ν2、AR19、AR15、0J1和Η1)采集含有土壤、泥、生物墊的溫泉 水。這些溫泉土壤樣本在采集溫度58~78°C、ρΗ7. 2~8的范圍內(nèi)。
[0149]使用DNA提取試劑盒（ISOILLargeforBeadsver. 2,NIPPONGENE社制），從所 采集的溫泉土壤樣本各l〇g中提取DNA。利用羅氏診斷（RocheDiagnostics)社制GSFLX Titanium454和Illumina社制測(cè)序儀HiSeq2000,對(duì)所提取的DNA進(jìn)行宏基因組DNA的鳥 槍法測(cè)序。在454測(cè)序儀中使用5yg所提取的DNA，在HiSeq2000測(cè)序儀中，使用由基因 組DNA擴(kuò)增試劑盒（GenomiPhiV2DNA擴(kuò)增試劑盒，GE醫(yī)療社制）擴(kuò)增的產(chǎn)物，進(jìn)行宏基 因組DNA的序列解碼。在利用HiSeq2000進(jìn)行的測(cè)序中，使用Illumina社制cBot，將DNA 文庫和試劑注入流動(dòng)槽（flowcell)，在流動(dòng)槽內(nèi)由DNA1分子自動(dòng)形成具有同一序列的基 因簇。使用HiSeq2000進(jìn)行l(wèi)Olbp的配位末端測(cè)序，得到宏基因組序列數(shù)據(jù)。
[0150] 對(duì)溫泉土壤樣本AR19進(jìn)行宏基因組DNA的序列解碼，在454測(cè)序儀中，得到平均 解碼長(zhǎng)度（readlength)為 396bp、總解碼數(shù)（totalreadnumber)為 2, 766, 332 個(gè)、總基 因組解碼量為1，106, 243, 280bp，在HiSeq2000測(cè)序儀中，得到配對(duì)末端的平均解碼長(zhǎng)度 為92. 65bpbp、總解碼數(shù)為894, 238, 096個(gè)、總基因組解碼量為83, 112, 168, 755bp，共計(jì) 84. 2Gbp的全基因組序列（WGS)數(shù)據(jù)集。
[0151] 〈2>溫泉宏基因組數(shù)據(jù)的拼接與統(tǒng)計(jì)量
[0152] 對(duì)于用454測(cè)序儀和HiS印測(cè)序儀讀取的堿基序列，使用CLCbio社制CLC GenomicsWorkbench(CLC高通量數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，5. 5. 1版）進(jìn)行質(zhì)量過濾和Denovo拼接。 在質(zhì)量過濾后，由454測(cè)序儀得到的解碼的總解碼長(zhǎng)度變?yōu)?, 766, 328bp，由HiSeq2000測(cè) 序儀得到的堿基序列數(shù)據(jù)的總解碼長(zhǎng)度變?yōu)?1，323, 692, 563bp。拼接后，具有500bp以上 長(zhǎng)度的重疊群的數(shù)量為967, 925個(gè)，總?cè)L(zhǎng)變?yōu)?19, 787, 603bp，其中，最大重疊群長(zhǎng)度為 287,641bp〇
[0153] 〈3>β-木糖苷酶的開放閱讀框（0PF)預(yù)測(cè)
[0154] 從Uniprot數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/)下載EC號(hào)為 3. 2. 1. 4(纖維素 酶）、3·2· 1·21(β-葡糖苷酶）、3·2· 1·37(β-木糖苷酶）、3·2· 1.91(纖維素 1，4-β-纖 維二糖糖苷酶）、3. 2. 1.8(內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶）的序列（訪問日期：2011/12/9)， 構(gòu)建這些糖苷水解酶基因的蛋白質(zhì)組本地?cái)?shù)據(jù)庫。使用注釋軟件Metagene(Noguchi等， 《DNAResearch(DNA研究）》，2008,15 (6))，由上述〈2>所得重疊群序列推斷基因區(qū)域 (=開放閱讀框）（Metagene選項(xiàng)：-m)。為了從推斷的0RF提取糖苷水解酶基因，使用了 BLASTP(blastallver. 2. 2. 18)，參照了上述本地?cái)?shù)據(jù)庫。BLASTP的選項(xiàng)條件設(shè)為"過濾查 詢序列=假"，"期望值（E)〈le2°"[以下為默認(rèn)值：空位開放罰分=-1，空位擴(kuò)展罰分=-1， 空位比對(duì)的X下降值=0,閾值拓展命中=0,字段長(zhǎng)度=默認(rèn)（Costtoopenagap= -1， Costtoextendedgap= _1，Xdropoffvalueforgappedalignment= 0，Threshold forextendinghits= 0，Wordsize=default)]，以命中0RF序列為糖苷水解酶基因進(jìn) 行收集。收集的堿基序列包含纖維素酶、內(nèi)切半纖維素酶、脫支酶等糖苷水解酶基因的堿基 序列。
[0155] 〈4>基因的糖苷水解酶（GH)家族分類
[0156] 對(duì)于在上述〈3>中收集的堿基序列，以蛋白質(zhì)功能區(qū)域序列數(shù)據(jù)庫pfam HMMs(Pfam23. 0版和HMMERv2. 3 ;Finn等，《核酸研究數(shù)據(jù)庫》，2010年，第38卷，第 D211-222頁）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行功能分類。具體而言，對(duì)于在上述〈3>中收集的堿基序列，使用 了蛋白質(zhì)基序檢索程序HMMER(Durbin等，"ThetheorybehindprofileHMMs.Biological sequenceanalysis:probabilisticmodelsofproteinsandnucleicacids(概形 HMM理論。生物序列分析理論：蛋白質(zhì)和核酸的概率模型）"，1998年，劍橋大學(xué)出版社； hmmpfam(2. 3. 2版）中，E值截止值<le5;數(shù)據(jù)庫=Pfam_fs(可用于查找所表示的結(jié)構(gòu)域 在序列中的片段的模型。）），由與Pfam結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫的相似性確定糖苷水解酶（GH)家族。 另外，將覆蓋GH催化結(jié)構(gòu)域的70%以上的堿基序列計(jì)入屬于各家族的酶基因。
[0157] 通過Metagene，從84. 2Gbp長(zhǎng)的宏基因組AR19序列數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)了602, 589個(gè)0RF， 全長(zhǎng)ORF為251，146個(gè)。
[0158] 通過BLASTP的相似性檢索，命中作為β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶序列的406個(gè) 0RF。這406個(gè)0RF中，通過pfamHMMs，168個(gè)預(yù)測(cè)為β-葡糖苷酶基因或β-木糖苷酶基 因，238個(gè)（全長(zhǎng)0RF為92個(gè)，非全長(zhǎng)0RF為146個(gè)）的GH催化結(jié)構(gòu)域的序列的覆蓋率不 足70 %，或者為在pfam數(shù)據(jù)庫中未命中的序列。
[0159] 預(yù)測(cè)為β-葡糖苷酶基因或β-木糖苷酶基因的168個(gè)0RF的GH家族分類結(jié)果示 于表1中。GH催化結(jié)構(gòu)域的覆蓋率不足70%以及與Pfa