業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明一種有效提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)量的方法做進(jìn) 一步描述。
[0014] 實(shí)施例1 :利福平抗性突變株的獲得(第一輪抗藥性突變株篩選） 制備利福平終濃度為20 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中利福平濃度為 20 μ g/mL。用移液槍吸取100 μ L淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D孢子懸液（IX IO6個(gè)/mL)于GYM 固體平板上，用無(wú)菌涂布棒涂布均勻，置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，分別挑取單菌落至新的含有 20 μ g/mL利福平的GYM固體平板(一個(gè)單菌落劃一個(gè)平板)，置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，能再 次在該新的GYM固體平板上長(zhǎng)出的菌株即為利福平抗性突變株。共獲得利福平抗性突變株 2株，編號(hào)分別為f31和f32，對(duì)這2株突變株按照技術(shù)方案中的步驟（4)進(jìn)行液體發(fā)酵培 養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中突變株f31產(chǎn)四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能力較強(qiáng)(見表1); 實(shí)施例2 :低濃度鏈霉素抗性突變株的獲得(第二輪抗藥性突變株篩選） 制備鏈霉素終濃度為30 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中鏈霉素濃度為 30 μ g/mL。用移液槍吸取100 μ L利福平抗性突變株f31孢子懸液（IX IO6個(gè)/mL)于 GYM固體平板上，用無(wú)菌涂布棒涂布均勻，置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，分別挑取單菌落至新的 含有30 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板(一個(gè)單菌落劃一個(gè)平板)，置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天， 能再次在該新的GYM固體平板上長(zhǎng)出的菌株即為低濃度鏈霉素抗性突變株。共獲得低濃度 鏈霉素抗性突變株2株，編號(hào)分別為G2-13和G2-18,對(duì)這2株突變株按照技術(shù)方案中的步 驟（4)進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中突變株G2-13產(chǎn)四烯大環(huán)內(nèi)酯類 抗生素能力較強(qiáng)(見表1); 實(shí)施例3 :高濃度鏈霉素抗性突變株的獲得(第三輪抗藥性突變株篩選） 制備鏈霉素終濃度為300 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中鏈霉素濃度為 300 μ g/mL。用移液槍吸取1000 μ L低濃度鏈霉素抗性突變株G2-13孢子懸液（IX IO12 個(gè)/mL)于GYM固體平板上，用無(wú)菌涂布棒涂布均勻，置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)10~15天，分別挑 取單菌落至新的含有300 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板(一個(gè)單菌落劃一個(gè)平板)，置28°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)7~10天，能再次在該新的GYM固體平板上長(zhǎng)出的菌株即為高濃度鏈霉素抗性突 變株。共獲得高濃度鏈霉素抗性突變株2株，編號(hào)分別為G3-13和G3-15 ; 實(shí)施例4 :突變株液體發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)液為GYM液體培養(yǎng)基，組分與濃度為葡萄糖4 g/L，Dried yeast extract 4 g/L，Dried Malt extract-S 10 g/L，N-Z_Amine A I g/L，NaCl 2 g/L，0B 溶液 600 yL，定 容后用2mol/L NaCl溶液調(diào)節(jié)pH至7. 3 ;其中OB溶液配置方法：稱取MgS04 · 7H20 25g， CuSO4 · 5H20 2. 5g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 3. 75g，MnSO4 · 5H20 I. 8g，CaCl2 · 2H20 17. 5g，ZnSO4 · 7H20 4. 5g，加500 mL水，用前搖勻；每300 mL三角瓶裝60 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，配制后121°C滅菌20 min，待冷卻至50 °C，無(wú)菌條件下分別挑取一鉑金環(huán)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D和突變株孢子接 種，28°C±1°C，發(fā)酵培養(yǎng)6天；發(fā)酵液經(jīng)5000 r/min離心10 min，上清液用于四烯大環(huán)內(nèi) 酯類抗生素含量的測(cè)定； 實(shí)施例5 :四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測(cè) 方法：采用SHIMADZU C18色譜柱（150 mmX4. 6 mm，5 μπι)，甲醇為流動(dòng)相A，水為流 動(dòng)相 Β，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?0-15 min，5%-37% A;15-30 min，37%-100% A;30-40 min， 100%-5% Α;流速 LO mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 279 nm，柱溫 30 °C。
[0015] 結(jié)果表明：淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株G3-13和G3-15發(fā)酵液中四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗 生素的含量均比對(duì)照淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D高，其中突變株G3-13合成四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生 素的能力最強(qiáng)，四霉素P，四稀菌素B和四霉素A的發(fā)酵效價(jià)高達(dá)1065. 18mg/L，912. 47 mg/ L，885. 24mg/L，分別為對(duì)照的19. 13倍，17. 19倍和21. 45倍。
[0016] 表1淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D和突變株合成四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的能力
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種有效提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)量的方法，其特征在于通過(guò)聯(lián)合抗藥性突變 株的篩選，獲得對(duì)利福平20yg/mL、低濃度鏈霉素30yg/mL和高濃度鏈霉素300yg/mL 都產(chǎn)生抗藥性的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（D的突變株，獲 得的突變株合成四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的能力比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D顯著提高，所述的淀 粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏地址北 京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2007年5月25日，保藏登記號(hào)CGMCCNo. 2060。2. 權(quán)利要求1所述的突變株合成四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的方法，其特征在于發(fā)酵 培養(yǎng)液為GYM液體培養(yǎng)基，組分與濃度為葡萄糖4g/L，Driedyeastextract4g/L， DriedMaltextract-S10g/L，N-Z-AmineA1g/L，NaCl2g/L，OB溶液 600yL，定容 后用2mol/LNaCl溶液調(diào)節(jié)pH至7. 3 ;其中OB溶液配置方法：稱取MgS04 · 7H20 25g， CuS04 · 5H20 2. 5g，F(xiàn)eS04 · 7H20 3. 75g，MnS04 · 5H20 1. 8g，CaCl2 · 2H20 17. 5g，ZnS04 · 7H20 4. 5g，加500mL水，用前搖勻；每300mL三角瓶裝60mL發(fā)酵培養(yǎng)液，配制后121°C滅菌20 min，待冷卻至50 °C，無(wú)菌條件下分別挑取一鉑金環(huán)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D和突變株孢子接 種，28°C±1°C，發(fā)酵培養(yǎng)6天；發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心10min，上清液用于四烯大環(huán)內(nèi) 酯類抗生素含量的測(cè)定。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種有效提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)量的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法通過(guò)聯(lián)合抗藥性突變株的篩選，獲得對(duì)利福平、低濃度鏈霉素和高濃度鏈霉素都產(chǎn)生抗藥性的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（<i>Streptomyces？diastatochromogenes</i>）D的突變株，獲得的突變株合成四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的能力比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D顯著提高。CGMCC No. 206020070525
【IPC分類】C12P19/62, C12R1/525
【公開號(hào)】CN105400853
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510966000
【發(fā)明人】申屠旭萍, 俞曉平, 許益鵬, 湯谷, 劉楠楠
【申請(qǐng)人】中國(guó)計(jì)量學(xué)院
【公開日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年12月22日