提取各植株DNA ; 分別取上述3個(gè)品種的基因組DNA各10 Pg，用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoR I內(nèi)切酶 進(jìn)行雙酶切16 h，采用回收試劑盒對(duì)酶切的產(chǎn)物進(jìn)行回收純化；(相關(guān)酶試劑及回收試劑盒 均為TaKaRa公司產(chǎn)品，具體操作參考試劑使用說明書進(jìn)行）； 對(duì)上述酶切產(chǎn)物進(jìn)行適當(dāng)濃縮后，用地高辛標(biāo)記并進(jìn)行Southern雜交，具體雜交過程 為： 對(duì)酶切后的DNA產(chǎn)物進(jìn)行0. 7%瓊脂糖凝膠電泳，25 V恒壓、4°C低溫過夜；然后進(jìn)行轉(zhuǎn) 膜、雜交探針，然后進(jìn)行洗膜，記錄Southern雜交結(jié)果(雜交結(jié)果如圖9所示）； 詳細(xì)Southern雜交過程及步驟參考高辛標(biāo)記Southern雜交試劑盒（Roche公司)使用 說明書進(jìn)行。
[0067] 從Southern雜交結(jié)果可以看出，在花序有限dtl型和花序無限dtO型芝麻種質(zhì) 中，及其等位基因均可被雜出，且雜交條帶均為1條，大小相似。這一結(jié)果表明， 在2種花序類型的栽培種和野生種種質(zhì)基因組中，芝麻花序有限基因及其等位基因 均以單拷貝存在；芝麻花序有限基因其等位基因的基因序列差異極小。
[0068] 實(shí)施例4 本實(shí)施例主要進(jìn)行芝麻花序有限基因的SNP分子標(biāo)記5YDt27-l開發(fā)。
[0069] 本實(shí)施例以選育花序有限型高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種材料為例，主要介紹芝麻花序有限基因 的SNP分子標(biāo)記5YDt27-l應(yīng)用過程，具體過程如下。
[0070] (1)為選育出花序有限型高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種材料，2014年從芝麻種質(zhì)庫中挑選鄭芝 98N09做母本，以豫芝DS899做父本，6月份種植于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心原陽基 地。2014年7月，配置雜交組合，獲得Fl。2014年11月，在三亞基地種植F 1代種子，單株 罩網(wǎng)自交，隨后獲得F2代種子，群體大于200株。2015年2月，隨機(jī)選取50個(gè)F 2單株的飽 滿種子，種于海南三亞基地?；ㄆ谡{(diào)查F2株系后代花序類型。每個(gè)株系設(shè)定3個(gè)重復(fù)，每 個(gè)重復(fù)調(diào)查10棵植株。
[0071] (2)利用實(shí)施例2中的三引物序列（正向引物HSDt01-lF、正向引物HSDt01-2F、反 向引物HSDtOl-R)進(jìn)行SNP標(biāo)記的可靠性評(píng)價(jià)； 隨機(jī)挑選上述F2群體的50個(gè)單株個(gè)體和2個(gè)親本個(gè)體，提取基因組DNA，并以此為模 板，進(jìn)行PCR。
[0072] PCR反應(yīng)采用10 PL反應(yīng)體系，設(shè)置如下： 模板 DNA (50ng/^L)，L 〇μL ; 10XPCR Buffer (Mg2+), I. 〇μL ； Taqase 酶（5U/>L)，0· 2μL ; dNTP (lOmmol/L),0. 2μL ； Forward Primer I (1〇μΜ) ,0. 5)J-L ； Forward specific Primer 2 (1〇μΜ), 0. 5)J-L ； Reverse Primer (1〇μΜ), I. 0)J-L ； 加入超純水5. 6PL。
[0073] PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3分鐘，之后94°C變性30秒，55 °C復(fù)性30秒，72 °C延 伸30秒，循環(huán)30次，最后72 °C延伸5分鐘，反應(yīng)產(chǎn)物4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0074] (3)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離 對(duì)步驟（2 )中PCR產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，凝膠濃度為8~10%，凝膠 大小180mmX 120mmX2mm，電泳緩沖液為0· 5XTBE，150V恒壓交流電電泳L 5~2小時(shí)；電泳 結(jié)束后，在凝膠加入濃度為0. 1%的硝酸銀水溶液，置于水平搖床上滲透銀染IOmin ;再加入 2%氫氧化鈉和0. 4%甲醛混合溶液，置于水平搖床中適度顯色；最后清水漂洗凝膠并記錄讀 取數(shù)據(jù)。
[0075] 部分電泳圖譜如圖8所示。
[0076] (4) SNP分子標(biāo)記檢測與被檢測樣品表型一致性分析 從5YDt27-l位點(diǎn)篩選過程我們可以知曉，理論上具有5YDt27-l等位位點(diǎn)1 (條帶大 小92bp，即本申請(qǐng)5YDt27-l位點(diǎn)）的植株應(yīng)該表現(xiàn)為花序有限；具有5YDt27-l等位位點(diǎn)2 (條帶大小97bp，即5YDt27-l位點(diǎn)中的堿基G變?yōu)锳時(shí)位點(diǎn)）的植株應(yīng)該表現(xiàn)為花序無限； 具有5YDt27-l等位位點(diǎn)1、2 (條帶大小92bp和97bp，）的植株為雜合體，應(yīng)該表現(xiàn)為花序 無限。
[0077] 檢測結(jié)果顯示，在有5YDt27-l等位位點(diǎn)1 (條帶大小92bp)的20個(gè)植株中均為有 限花序，可靠度為100% ;在有5YDt27-l等位位點(diǎn)2 (條帶大小97bp)的15個(gè)植株中，均為 無限花序，可靠度為100%。在有5YDt27-l等位位點(diǎn)1和2 (條帶大小為92bp、97bp)的15 個(gè)植株為雜合子，表型均為無限花序，可靠度100%。
[0078] 部分植株的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖10所示。
[0079] 綜上，我們可以認(rèn)為該SNP標(biāo)記即為芝麻花序有限基因 SNP位點(diǎn)標(biāo)記，可以用于預(yù) 測芝麻品種的花序類型，用于芝麻分子標(biāo)記輔助育種和花序有限型芝麻新品種的選育。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 芝麻花序有限基因5??Λ1，其特征在于，該基因有1809bp，包含4個(gè)外顯子和 3個(gè)內(nèi)含子，位于芝麻第4條染色體上，在芝麻SNP遺傳圖譜中的位置為第8連鎖群， 18. 0-19. 2cM，對(duì)花序有限性狀的解釋率為100%(Vg/Vp);其DNA序列如SEQIDNO. 1所示。2. 權(quán)利要求1所述芝麻花序有限基因的cDNA序列，其特征在于，該cDNA序列長 度為531bp，編碼176個(gè)氨基酸，具體如SEQID. 2所示。3. 權(quán)利要求1所述芝麻花序有限基因的SNP分子標(biāo)記5YDt27-l，其特征在于， 該分子標(biāo)記5YDt27-l有92bp，為花序有限基因中第378至469處堿基序列，具體序 列為： CCTGATGTTCCTGGTCCTAATGATCCATATCTGAGGGAGCACCTGCACTGGTATGCTTTCATTTTTAACTGCT TAAGACCTGATTGATTTAA。4. 利用權(quán)利要求3所述SNP分子標(biāo)記5YDt27-l檢測芝麻花序有限基因的檢測 方法，其特征在于，具體包括以下步驟： (1) 提取待測芝麻種質(zhì)資源的基因組DNA; (2) 以步驟（1)中所提取DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增時(shí)，采用如下引物序列： 正向引物HSDt01-lF序列：5'CCTGATGTTCCTGGTCCGAA3' ； 正向引物HSDt01-2F序列；5'CTATTCCTGATGTTCCTGGTCCGAG3' ； 反向引物HSDtOl-R序列：5'TAAATCAATCAGGTCTTAAGCAGT3' ； 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，判斷待測芝麻種質(zhì)資源的基因組DNA中是否含有SNP分子標(biāo)記SiDt27-l，判斷規(guī)則如下： 如果僅含有SNP分子標(biāo)記5YDt27-l標(biāo)記位點(diǎn)，當(dāng)采用引物HSDt01-lF與HSDtOl-R配 對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，能擴(kuò)增出條帶大小為92bp的產(chǎn)物，則該待測種質(zhì)屬于?/Μ型，花序有 限，可用于培育花序有限型芝麻新品種； 如果不含有SNP分子標(biāo)記5YDt27-l標(biāo)記位點(diǎn)，當(dāng)采用引物HSDt01-2F與HSDtOl-R配 對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，能擴(kuò)增出條帶大小為97bp的產(chǎn)物，則該待測種質(zhì)屬于花序無限，不 能用于培育花序有限型芝麻新品種； 如果所擴(kuò)增條帶大小既有92bp的產(chǎn)物，也有97bp的產(chǎn)物，則該待測種質(zhì)屬于雜合型， 花序無限，其后代會(huì)表現(xiàn)出性狀分離，可進(jìn)一步獲得花序有限型材料。5. 如權(quán)利要求4所述利用SNP分子標(biāo)記5YDt27-l檢測芝麻花序有限基因的檢 測方法，其特征在于，為進(jìn)一步準(zhǔn)確判斷待測種質(zhì)資源是否含有花序有限基因57出1，可以 步驟（1)中所提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增時(shí)，采用如下引物序列： 正向引物DtlPrimerF序列為：5'_ATGGCAAAAATGTCATCGGACC-3' ； 反向引物DtlPrimerR序列為：5'_CTAGCGCCTTCTAGCAGCAGTC-3' ； 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，并與花序有限基因57出7的基因序列進(jìn)行比對(duì)，如果相同， 則待測種質(zhì)屬于花序有限，可用于培育新的芝麻品種， 所述花序有限基因的基因序列為SEQIDNO. 1中的序列。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種芝麻花序有限基因<i>Sidt</i>1及其SNP標(biāo)記<i>Si</i>Dt27-1。芝麻花序有限基因<i>Sidt</i>1有1809bp，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，位于芝麻第4條染色體上，在芝麻SNP遺傳圖譜中的位置為第8連鎖群，18.0-19.2cM，對(duì)花序有限性狀的解釋率為100%（Vg/Vp）；其DNA序列如SEQ？ID？NO.1所示。SNP分子標(biāo)記<i>Si</i>Dt27-1有92bp，為花序有限基因<i>Sidt</i>1中第378至469處堿基序列。本發(fā)明為分析芝麻等農(nóng)作物花發(fā)育機(jī)理提供了遺傳信息；為建立芝麻分子輔助育種技術(shù)提供了重要分子標(biāo)記，為篩選花序有限的芝麻新品種提供了快速檢測方法。
【IPC分類】C12N15/29, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105385697
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510876016
【發(fā)明人】張海洋, 苗紅梅, 李春, 魏利斌, 段迎輝, 徐芳芳, 王慧麗
【申請(qǐng)人】河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心
【公開日】2016年3月9日
【申請(qǐng)日】2015年12月3日