一種植物乳桿菌的特異性分子標(biāo)記dna序列及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的特異性分子標(biāo)記DNA序列及其用途以及植物乳桿菌的檢測(cè)方法。該特異性分子標(biāo)記DNA序列如SEQ ID NO.6所示。該檢測(cè)方法包括步驟：(1)提取待測(cè)樣本的基因組DNA；(2)以步驟(1)所得的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO.1所示的半隨機(jī)引物為擴(kuò)增引物進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增；(3)對(duì)步驟(2)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與SEQ ID NO.6所示序列進(jìn)行比對(duì)，若同源度大于99％，則表明待測(cè)樣本中含有植物乳桿菌。
【專利說(shuō)明】-種植物乳桿菌的特異性分子標(biāo)記DNA序列及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)的特異性分子標(biāo)記DNA序列及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 要對(duì)一種細(xì)菌進(jìn)行分子水平的檢測(cè)需要獲知該細(xì)菌的特異性序列，而獲得一種細(xì) 菌的特異性序列，往往需要對(duì)網(wǎng)上大量的已知序列進(jìn)行分析比對(duì)；但有些細(xì)菌已測(cè)的序列 較少，分析起來(lái)非常困難，難以得到其特異性序列。當(dāng)然，也可以收集某一種細(xì)菌的所有菌 株，進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，但該方法實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)、費(fèi)用高昂。
[0003] 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)是益生菌的一種，廣泛應(yīng)用于各種功能 性食品中，尤其是在乳制品的開(kāi)發(fā)研究中，日益受到重視。目前，在網(wǎng)上可以獲取的植物乳 桿菌已經(jīng)經(jīng)過(guò)測(cè)序的序列較少，因而難以分析得到植物乳桿菌的特異性序列，這給植物乳 桿菌的分子檢測(cè)帶來(lái)不便。因此，有必要研究開(kāi)發(fā)獲知植物乳桿菌的特異性序列，以方便對(duì) 其進(jìn)行分子檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)目前對(duì)植物乳桿菌（Lactobaci I Ius plantarum)進(jìn)行分子檢測(cè)不方便的現(xiàn)狀，而提供一種植物乳桿菌的特異性分子標(biāo)記DNA序 列及其用途。本發(fā)明的植物乳桿菌的特異性分子標(biāo)記DNA序列與已經(jīng)測(cè)過(guò)序的植物乳桿菌 的基因同源性大于99 %，可以方便地用于對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行分子檢測(cè)。此前，該分子標(biāo)記未 經(jīng)報(bào)道過(guò)，是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的植物乳桿菌的特異性序列。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題。
[0006] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是：一種植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)的 特異性分子標(biāo)記DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0007] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是：核苷酸序列組成如SEQ ID NO. 6所示的植物乳桿 菌（Lactobacillus plantarum)的特異性分子標(biāo)記DNA在檢測(cè)植物乳桿菌中的用途。
[0008] 核苷酸序列組成如SEQ ID NO. 6所示的植物乳桿菌的特異性分子標(biāo)記DNA，是植物 乳桿菌的種特異性序列，可以作為分子遺傳學(xué)標(biāo)記，用于植物乳桿菌的分子檢測(cè)。
[0009] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三是：一種植物乳桿菌的檢測(cè)方法，其包括如下步驟：
[0010] ⑴提取待測(cè)樣本的基因組DNA ;
[0011] ⑵以步驟⑴所得的基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.1所示的半隨機(jī)引物為擴(kuò) 增引物進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增；
[0012] (3)對(duì)步驟（2)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與SEQ ID NO. 6所示的 核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，若同源度大于99%，則表明待測(cè)樣本中含有植物乳桿菌。
[0013] 本發(fā)明中，步驟（1)為提取待測(cè)樣本的基因組DNA。所述的提取待測(cè)樣本的基因 組DNA的方法為本領(lǐng)域常規(guī)，如可以采用液氮凍融-CTAB法，也可以采用溶菌酶法，還可以 使用市售的各種基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行操作。
[0014] 本發(fā)明中，步驟（2)為以步驟（1)所得的基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.1所 示的半隨機(jī)引物為擴(kuò)增引物進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增。所述的單引物PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī) 所指的含義，即擴(kuò)增體系中只加入一條擴(kuò)增引物進(jìn)行DNA片段的合成。較佳地，所述的單 弓丨物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括如下組分：0. 5?2. 0 ii mol/L半隨機(jī)引物，0. 2?I. Ommol/L dNTP，I. 0 ?2. 5mmol/L 的 Mg2+，0? 02 ?0? IOU/ ii LTaq DNA 聚合酶，以及 0? 5 ?2. Ong/ ii L 基因組DNA模板。所述的單引物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序包括：①93-96 °C，4-6min ;②93-96 °C， 20-40s ;③ 45-58°C，20-40s ;④ 70-72°C，30-120s ;⑤ 70 ?72°C，5 ?IOmin ;其中，步驟 ②至④的循環(huán)數(shù)為25-40。更佳地，所述的單引物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括如下組分： I. Oii mol/L 半隨機(jī)引物，0? 5mmol/L dNTP，I. 5mmol/L 的 Mg2+，0. 05U/ii LTaq DNA 聚合酶， 以及1.0ng/iiL基因組DNA模板。所述的單引物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序包括：①95°C，5min ; ②95°C，30s ;③50°C，30s ;④72°C，2min ;⑤72°C，5min ;其中，步驟②至④的循環(huán)數(shù)為35。
[0015] 本發(fā)明中，步驟（3)為對(duì)步驟（2)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與 SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，若同源度大于99%，則表明待測(cè)樣本中含有植物 乳桿菌。其中，所述的對(duì)步驟（2)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序較佳地按下述方式進(jìn)行：將步 驟（2)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳（優(yōu)選瓊脂糖凝膠電泳，也可以是聚丙烯酰胺凝膠電泳），若 在500bp位置存在擴(kuò)增條帶，則將該條帶進(jìn)行克隆測(cè)序。
[0016] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0017] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0018] 相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：
[0019] 本發(fā)明中的植物乳桿菌的特異性分子標(biāo)記DNA序列與已經(jīng)測(cè)過(guò)序的植物乳桿菌 的基因同源性大于99%，可以方便地用于對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行分子檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)方法 操作簡(jiǎn)單、方便快速、特異性強(qiáng)，不需要特別設(shè)計(jì)PCR引物即可對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，成本 較低，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為不同植物乳桿菌菌株的特異性PCR條帶篩選的結(jié)果。圖中編號(hào)"M" 為 DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co, Ltd. 1-5" 分別為： Lactobacillus plantarumST_III、Lactobacillus plantarumATCC8014、Lactobacillus pIantarumACCC 11095^ Lactobacillus pIantarumATCCl4917^ Lactobacillus pIantarumWCFSI 的 PCR 結(jié)果。
[0021] 圖2為不同植物乳桿菌菌株的特異性PCR條帶獲取的結(jié)果。圖中編號(hào) "M" 為 DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co, Ltd.。"1-8" 分別 為：Lactobacillus plantarum CGMCC1.119、 Lactobacillus plantarum MCCL IK Lactobacillus plantarum CICC22710、LactobaciIIus plantarum CICC6234、 Lactobacillus plantarum CGMCCl?3、 LactobaciIIus plantarum CICC20871、 Lactobacillus plantarum CICC23132、Lactobacillus plantarumCICC23506 的 PCR 結(jié)果。
[0022] 圖3為植物乳桿菌菌株的特異性PCR條帶的獲取的結(jié)果。圖中編號(hào)"M" 為 DL2,OOODNA Marker Takara Biotechnology (Dalian)Co,Ltd. 1-2" 分別為： Lactobacillus plantarumATCC14917、Lactobacillus plantarumWCFSl 的 PCR 結(jié)果。
[0023] 圖4為不同植物乳桿菌菌株的特異性PCR條帶獲取的結(jié)果。圖中編號(hào)"M" 為 DL2,000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian)Co,Ltd.。"1-10" 分別 為：Lactobacillus plantarum CGMCC1. 119、Lactobacillus plantarum MCCL IK Lactobacillus plantarum CICC22710、LactobaciIIus plantarum CICC6234、 Lactobacillus plantarum CGMCC1.3、Lactobaci I Ius plantarum CICC20871、 Lactobacillus plantarum CICC23132、LactobaciI Ius pIantarumCICC23506 ^ Lactobacillus plantarumATCC14917、Lactobacillus plantarumWCFSl 的 PCR 結(jié)果。
[0024] 圖5為不同半隨機(jī)引物的效果比較。圖中"M"為DL2,000DNA(Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co, Ltd)，編號(hào) "1-4" 為半隨機(jī)引物 "AP2-AP5" 分別對(duì)應(yīng)的 PCR 結(jié) 果，編號(hào)5為半隨機(jī)引物APl對(duì)應(yīng)的PCR結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說(shuō)明書選擇。
[0026] 下述實(shí)施例中，如非特別說(shuō)明，所用試劑和材料均為常規(guī)市售可得。
[0027] 下述實(shí)施例中，下述實(shí)驗(yàn)材料的來(lái)源為：
[0028] 植物乳桿菌：
[0029] Lactobacillus plantarumST-III取自光明乳業(yè)股份有限公司，此為 申請(qǐng)人:的專 利菌株，亦可購(gòu)自CGMCC，其保藏編號(hào)為CGMCC NO. 0847 ;
[0030] Lactobacillus plantarumATCC8014購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司；
[0031] Lactobacillus plantarumACCC11095購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司；
[0032] Lactobacillus plantarumATCC14917購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司；
[0033] Lactobacillus plantarumWCFSl 購(gòu)自丹尼斯克有限公司；
[0034] Lactobacillus plantarum CGMCCL 119購(gòu)自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；
[0035] Lactobacillus plantarum MCCL 11購(gòu)自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；
[0036] Lactobacillus plantarum CICC22710購(gòu)自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；
[0037] Lactobacillus plantarum CICC6234購(gòu)自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；
[0038] Lactobacillus plantarum CGMCCL 3購(gòu)自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；
[0039] Lactobacillus plantarum CICC20871購(gòu)自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；
[0040] Lactobacillus plantarum CICC23132購(gòu)自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；
[0041] Lactobacillus plantarumCICC23506購(gòu)自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司。
[0042] 實(shí)施例1不同植物乳桿菌菌株的特異性PCR條帶的篩選
[0043] (1)模板制備
[0044] 將各菌株活化分離培養(yǎng)，獲得的菌落挑選單菌落，接種于Iml MRS培養(yǎng)基，37°C 厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，離心獲得菌體。提取細(xì)菌基因組，使用的試劑盒為：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver. 2. 0 (Takara Biotechnology (Dalian) Co. , Ltd. ) 〇
[0045] (2) PCR 擴(kuò)增
[0046] PCR擴(kuò)增的體系組成為：1 ii mol/L半隨機(jī)引物（其序列如SEQ ID NO. I所示）， 0? 5mmol/L dNTP，I. 5mmol/L 的Mg2+，0. 05U/ii LTaq DNA聚合酶，以及 500ng (請(qǐng)以濃度表示） 基因組DNA模板，總體積50 ii L。
[0047] PCR 擴(kuò)增的程序?yàn)椋孩?95°C，5min ;② 95°C，30s ;③ 50°C，30s ;④ 72°C，2min ; ⑤72°C，5min ;其中，步驟②至④的循環(huán)數(shù)為35。
[0048] (3)特異性條帶的獲得
[0049] 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1，圖中編號(hào)"M"為DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd. 〇 ''1-5" 分別為：Lactobacillus p IantarumST-111 > Lactobacillus plantarumATCC8014、LactobaciIIus pIantarumACCCl1095、LactobaciIIus plantarumATCC14917、Lactobacillus plantarumWCFSl 的 PCR 結(jié)果。
[0050] 將泳道1-5中共有的位置大約在500bp的條帶（箭頭所指處）回收純化并克隆測(cè) 序，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO. 6所示。
[0051] 實(shí)施例2不同植物乳桿菌菌株的特異性PCR條帶的獲取
[0052] (1)模板制備
[0053] 將各菌株活化分離培養(yǎng)，獲得的菌落挑選單菌落，接種于Iml MRS培養(yǎng)基，37°C 厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，離心獲得菌體。提取細(xì)菌基因組，使用的試劑盒為：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver.2.0(Takara Biotechnology(Dalian) Co. , Ltd. ) 〇
[0054] (2) PCR 擴(kuò)增
[0055] PCR擴(kuò)增的體系組成為：2 mol/L半隨機(jī)引物（其序列如SEQ ID NO. I所示）， lmmol/L dNTP，2. 5mmol/L 的 Mg2+，0? IOU/ii LTaq DNA 聚合酶，以及 2ng/ii L 基因組 DNA 模 板，總體積50 ii L。
[0056] PCR 擴(kuò)增的程序?yàn)椋孩?95 °C，4min ;② 95 °C，20s ;③ 50 °C，20s ;④ 72 °C，60s ; ⑤72°C，5min ;其中，步驟②至④的循環(huán)數(shù)為40。
[0057] (3)特異性條帶的獲得
[0058] 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果見(jiàn)圖2,圖中編號(hào)"M"為DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd. 〇 ''1-8，' 分別為：Lactobacillus pi ant arum CGMCCl? 119、LactobaciIIus plantarum MCCl. 11> Lactobacillus plantarum CICC22710> Lactobacillus piantarum CICC6234> Lactobacillus piantarum CGMCCI. 3> Lactobacillus plantarum CICC20871、LactobaciIIus plantarum CICC23132、 Lactobacillus plantarumCICC23506 的 PCR 結(jié)果。
[0059] 將泳道1-8中共有的位置大約在500bp的條帶（箭頭所指處）回收純化并克隆測(cè) 序，測(cè)序結(jié)果都如SEQ ID NO. 6所示。
[0060] 實(shí)施例3植物乳桿菌菌株的特異性PCR條帶的獲取
[0061] (1)模板制備
[0062] 將菌株活化分離培養(yǎng)，獲得的菌落挑選單菌落，接種于Iml MRS培養(yǎng)基，37°C 厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，離心獲得菌體。提取細(xì)菌基因組，使用的試劑盒為：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver. 2. 0(Takara Biotechnology(Dalian) Co. , Ltd. ) 〇
[0063] (2) PCR 擴(kuò)增
[0064] PCR擴(kuò)增的體系組成為：0? 5 ii mol/L半隨機(jī)引物（其序列如SEQ ID NO. I所示）， 0? 2mmol/L dNTP，I. Ommol/L 的 Mg2+，0. 02U/ii LTaq DNA 聚合酶，以及 0? 5ng/ii L 基因組 DNA 模板，總體積50 ii L。
[0065] PCR 擴(kuò)增的程序?yàn)椋孩?96°C，4min ;② 93°C，40s ;③ 45°C，40s ;④ 70°C，120s ; ⑤70°C，IOmin ;其中，步驟②至④的循環(huán)數(shù)為25。
[0066] (3)特異性條帶的獲得
[0067] 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果見(jiàn)圖3,圖中編號(hào)"M"為DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co,Ltd.。"1-2" 分別為：Lactobacillus plantarumATCC14917、 Lactobacillus plantarumWCFSl 的 PCR 結(jié)果。
[0068] 將泳道中共有的位置大約在500bp的條帶（箭頭所指處）回收純化并克隆測(cè)序， 測(cè)序結(jié)果都如SEQ ID NO. 6所示。
[0069] 實(shí)施例4植物乳桿菌菌株的特異性PCR條帶的獲取
[0070] ⑴模板制備
[0071] 將菌株活化分離培養(yǎng)，獲得的菌落挑選單菌落，接種于Iml MRS培養(yǎng)基，37°C 厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，離心獲得菌體。提取細(xì)菌基因組，使用的試劑盒為：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver.2. 0(Takara Biotechnology(Dalian) Co. , Ltd. ) 〇
[0072] (2) PCR 擴(kuò)增
[0073] PCR擴(kuò)增的體系組成為：1 mol/L半隨機(jī)引物（其序列如SEQ ID NO. I所示）， 0? 5mmol/L dNTP，I. 5mmol/L 的 Mg2+，0. 05U/ii LTaq DNA 聚合酶，以及 2ng/ii L 基因組 DNA 模 板，總體積50 ii L。
[0074] PCR 擴(kuò)增的程序?yàn)椋孩?93 °C，6min ;② 96 °C，20s ;③ 58 °C，30s ;④ 72 °C，30s ; ⑤70°C，IOmin ;其中，步驟②至④的循環(huán)數(shù)為35。
[0075] (3)特異性條帶的獲得
[0076] 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果見(jiàn)圖4,圖中編號(hào)"M"為DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd. 〇 ''1-10，' 分別為：Lactobacillus pi ant arum CGMCCl? 119、LactobaciIIus plantarum MCCl? 11、LactobaciIIus plantarum CICC22710> Lactobacillus plantarum CICC6234> Lactobacillus plantarum CGMCCI. 3> Lactobacillus plantarum CICC20871、LactobaciIIus plantarum CICC23132、 Lactobacillus pIantarumCICC23506> Lactobacillus plantarumATCC14917、 Lactobacillus plantarumWCFSl 的 PCR 結(jié)果。
[0077] 將泳道中共有的位置大約在500bp的條帶（箭頭所指處）回收純化并克隆測(cè)序， 測(cè)序結(jié)果都如SEQ ID NO. 6所示。
[0078] 實(shí)施例5序列特異性驗(yàn)證
[0079] 將實(shí)施例1?4所獲得的特異性序列（如SEQ ID NO. 6所示）在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行 BLAST，結(jié)果顯示獲得的特異性序列與植物乳桿菌的基因同源性大于99%，與其它物種的同 源性都不高，或者極低，具體結(jié)果參見(jiàn)表1，由此確定所得的序列為植物乳桿菌的特異性序 列。
[0080] 表 1
[0081]

【權(quán)利要求】
1. 一種植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)的特異性分子標(biāo)記DNA，其特征在于， 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
2. 核苷酸序列組成如SEQ ID NO. 6所示的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)的 特異性分子標(biāo)記DNA在檢測(cè)干酪乳桿菌中的用途。
3. -種植物乳桿菌的檢測(cè)方法，其特征在于，其包括如下步驟： (1)提取待測(cè)樣本的基因組DNA ; ⑵以步驟⑴所得的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO. 1所示的半隨機(jī)引物為擴(kuò)增引 物進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增； (3)對(duì)步驟（2)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與SEQ ID NO. 6所示的核苷 酸序列進(jìn)行比對(duì)，若同源度大于99 %，則表明待測(cè)樣本中含有植物乳桿菌。
4. 如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的提取待測(cè)樣本的基因組DNA的方 法為液氮凍融-CTAB法或溶菌酶法。
5. 如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的單引物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括 如下組分：〇? 5 ?2. 0 u mol/L 半隨機(jī)引物，0? 2 ?1. Ommol/LdNTP，1. 0 ?2. 5mmol/L 的 Mg2+， 0? 02?0? 10U/ ii LTaq DNA聚合酶，以及0? 5?2. Ong/ ii L基因組DNA模板。
6. 如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的單引物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序包 括：① 93-96 °C，4-6min ;② 93-96 °C，20-40s ;③ 45-58 °C，20-40s ;④ 70-72 °C，30-120s ; ⑤70?72°C，5?lOmin ;其中，步驟②至④的循環(huán)數(shù)為25-40。
7. 如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的單引物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括 如下組分：1. 0 U mol/L 半隨機(jī)引物，0? 5mmol/L dNTP，1. 5mmol/L 的 Mg2+，0. 05U/ii LTaq DNA 聚合酶，以及1. 〇ng/ y L基因組DNA模板。
8. 如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的單引物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序包 括：① 95°C，5min ;② 95°C，30s ;③ 50°C，30s ;④ 72°C，2min ;⑤ 72°C，5min ;其中，步驟②至 ④的循環(huán)數(shù)為35。
9. 如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的對(duì)步驟（2)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 克隆測(cè)序按下述方式進(jìn)行：將步驟（2)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，若在500bp位置存在擴(kuò)增條 帶，則將該條帶進(jìn)行克隆測(cè)序。
10. 如權(quán)利要求9所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的電泳為瓊脂糖凝膠電泳。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104450949SQ201410855051
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月26日
【發(fā)明者】張紅發(fā), 任婧, 郭本恒, 劉振民 申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司