一種能降解瓊脂的柯恩氏菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能降解瓊脂的柯恩氏菌。通過從土壤中篩菌獲得一株能夠降解瓊脂的細菌，經(jīng)16s rDNA鑒定該菌為柯恩氏菌，命名為Cohnella sp.LGH。該瓊脂降解菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC NO.10018，保藏日期為：2014年11月20日。該菌可在工業(yè)上用于降解瓊脂，制備新瓊寡糖。
CGMCC NO. 10018
20141120
【專利說明】一種能降解瓊脂的柯恩氏菌

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一種能降解瓊脂的柯恩氏菌。
技術(shù)背景
[0002]瓊脂是從紅藻類海藻中提取的一類天然多糖物質(zhì)。得益于其穩(wěn)定性，在食品工業(yè)上瓊脂作為增稠劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、凝固劑和乳化劑等使用，是工業(yè)用途最為廣泛的海藻膠之一。在我國瓊脂的生產(chǎn)主要來源于江籬。瓊脂是由具有凝膠性質(zhì)的瓊脂糖仏職抓此)和非凝膠性質(zhì)的瓊脂膠構(gòu)成的混合物，并以瓊脂糖為主。瓊脂糖的化學(xué)構(gòu)成是由￠-0-半乳糖和3,6-內(nèi)醚-0-1-半乳糖等組成的鏈狀線性聚合物，其中硫酸基的含量低于0.15%。瓊脂膠的結(jié)構(gòu)與瓊脂糖相似，但3，6-內(nèi)醚-0 半乳糖上的羥基被硫酸基、甲氧基、丙酮基等基團替代。
[0003]新瓊寡糖是瓊脂經(jīng)瓊脂酶水解后形成聚合度為2?20的海洋功能性低聚糖，主要由瓊脂二糖的重復(fù)單位連接而成。瓊脂粘度高，不溶于水，難以分解利用，新瓊寡糖則有很好的水溶性，易于人體吸收利用。隨著研宄的不斷進展和深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)新瓊寡糖具有很多有意義的生理功能特性。新瓊寡糖具有抗癌癥，抗炎癥，抗病毒，抗氧化，抗齲齒，預(yù)防糖尿病，增殖腸道益生菌和美白保濕等生理功能。這表明新瓊寡糖在醫(yī)用藥物，保健品，功能飼料和化妝品等方面有著很好的應(yīng)用前景。
[0004]目前獲得新瓊寡糖的主要方法有酸解法和酶解法，而酸解法存在污染大和效率低等缺點，酶解法有著效率高，污染小和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢，代替酸解法是未來的趨勢。本發(fā)明通過土壤細菌的分離和篩選獲得一株具有瓊脂降解能力的菌株，可在工業(yè)上用于降解瓊脂，制備新瓊寡糖。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供一株能降解瓊脂的新型菌株，為工業(yè)降解瓊脂，制備新瓊寡糖提供方法。
[0006]本發(fā)明的目的可以通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]一株瓊脂降解菌[⑶，分類命名為柯恩氏菌(￠0111161121鄧.)，于2014年11月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號勵.10018。
[0008]本發(fā)明瓊脂降解菌⑷!!，菌落圓形，略微發(fā)紅，邊緣整齊，表面光滑濕潤，不透明，在18平板上劃線培養(yǎng)能看到明顯的凹陷，革蘭氏染色陽性。
[0009]本發(fā)明瓊脂降解菌⑷!!，經(jīng)透射電子顯微鏡觀察可知，該菌大小約為0.8 V爪父2.5 V111，周生鞭毛。
[0010]本發(fā)明瓊脂降解菌，經(jīng)16&'0嫩測序及同源性比較，得到與其最相近的種屬是柯恩氏菌屬0011116118鄧.，168『0嫩已提交至60118811^登錄號為1771374。
[0011]本發(fā)明瓊脂降解菌，經(jīng)培養(yǎng)后有瓊脂酶活性，通過0吧法可檢測到瓊脂糖被降解成具有還原性的低聚糖。
[0012]有益效果:
[0013]本發(fā)明篩選到一株能降解瓊脂的柯恩氏菌屬菌株LGH，該菌株能夠降解瓊脂生成瓊脂寡塘，為工業(yè)化制備瓊脂寡糖提供菌株資源。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為平板培養(yǎng)基上的瓊脂降解菌LGH菌落形態(tài)照片；
[0015]圖2為瓊脂降解菌LGH透射電子顯微鏡觀察圖；
[0016]圖3為不同初始pH對瓊脂降解菌LGH生長的影響；
[0017]圖4為不同溫度對瓊脂降解菌LGH生長的影響；
[0018]圖5為不同Nacl濃度對瓊脂降解菌LGH生長的影響；
[0019]圖6為不同碳源對瓊脂降解菌LGHH的影響；
[0020]圖7為不同氮源對瓊脂降解菌LGHH生長的影響；
[0021]圖8為不同碳氮比對瓊脂降解菌LGH的影響；
[0022]圖9為不同通氣量對瓊脂降解菌LGH生長的影響；
[0023]生物材料保藏信息
[0024]瓊脂降解菌LGH，分類命名為柯恩氏菌Cohnella sp.，于2014年11月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研宄所，保藏號CGMCC N0.10018。

【具體實施方式】
[0025]實施例1:篩選瓊脂降解菌
[0026]初篩:將南京麒麟鎮(zhèn)采集土樣稱取1g 土壤樣品，放入盛有90ml無菌水的三角瓶中，振蕩約20min，使土樣和無菌水充分混勾，得到土壤懸浮液。用滅菌的槍頭吸取Iml懸液，加入到盛有9ml無菌水的試管中反復(fù)吹打使溶液充分混勻，以此類推采用梯度稀釋的方法，選取10_3、10_4、10_53個梯度吸取稀釋液0.1ml涂布于LB平板，30°C培養(yǎng)，觀察平板的凹陷情況，初步挑取具有降解瓊脂能力的菌株。
[0027]復(fù)篩:將挑選的菌株進行梯度稀釋，挑取降解能力好單菌落培養(yǎng)，用以瓊脂為唯一碳源的培養(yǎng)基多次劃線純化。培養(yǎng)基配方:NaCllg，K2HPO4L 5g，KH2PO40.5g，(NH4)2S042g，MgSO40.2g，CaCl20.2g，瓊脂 15g 溶于 IL 純水，121°C滅菌 20min。
[0028]盧戈氏碘液驗證:將盧戈氏碘液滴加在長有瓊脂降解菌的平板上，觀察菌體周圍是否出現(xiàn)透明圈。透明圈越大說明降解能力越好，挑取降解能力強的菌株于-70°C保存菌株。
[0029]通過上述方法篩選得到瓊脂降解菌LGH。用高鹽法提取瓊脂降解菌LGH的總DNA，PCR獲得16s rDNA，由南京思普金測序公司測序獲得序列信息，在NCBI上利用Blast在GenBank中與其它的16SrDNA序列進行同源性比較，選擇相近的序列與瓊脂降解菌LGH的序列。使用MEGA5.2軟件構(gòu)建瓊脂降解菌LGH的16S rDNA系統(tǒng)進化樹，根據(jù)該菌株的生理生化特征，鑒定為柯恩氏菌。將該菌株送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期為2014年11月20日，保藏編號為CGMCC N0.10018。
[0030]實施例2:瓊脂降解菌LGH的優(yōu)化培養(yǎng)條件
[0031]本實驗的培養(yǎng)基基于⑶培養(yǎng)基優(yōu)化。
[0032]18培養(yǎng)基:蛋白胨108，版1(^1 108，酵母膏58，瓊脂158溶于11純水，121X:滅菌201111110
[0033]檢測不同邱，溫度，^01濃度，碳源，氮源，碳氮比，通氣量同瓊脂降解菌的生長影響
[0034]所選不同邱:4,5,6,7,8,9,10(圖3)；
[0035]所選不同溫度:22。〇，25。〇，28。〇，301:，331:，371:，401:，451:(圖4)；
[0036]所選不同恥濃度:0,0.5%，1%，2%，3%，5%，10% (圖5)；所選不同碳源:乳糖，可溶性淀粉，葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，甘露醇，甘油(圖6)；
[0037]所選不同氮源:(順》2804，謂03，尿素，蛋白胨(圖7)；
[0038]所選不同碳氮比:1/1,1/2,1/5,1/10,1/15(圖8)；
[0039]所選不同通氣量:25001三角瓶中培養(yǎng)基含量為2501，50^1，75^1，100^1，12501(圖 9) 0
[0040]得到瓊脂降解菌最佳生長條件:初始邱8.0，溫度301:，^01濃度1 %，碳源:鹿糖，氮源:，最適碳氮比為1/5。
[0041]得到優(yōu)化培養(yǎng)基配方:蛋白胨10& ^01 10@，酵母膏5仏鹿糖20@，瓊脂15@溶于11 純水，1211 滅菌 20111111。
[0042]實施例3
[0043]培養(yǎng)基配方
[0044]改良⑶培養(yǎng)基:蛋白胨108，似108，酵母膏如，蔗糖208，瓊脂158溶于1[純水，1211 滅菌 20111111。
[0045]無機鹽培養(yǎng)基:^01 1。舊？041 58，狃2？0辦58，(順%30辦28，
28，瓊脂糖溶于11純水，1211:滅菌20-11.用接種環(huán)挑取瓊脂降解菌至改良18培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1811,30^,1801-.—―1，即為種子液。
[0046]分別以接種量為2%卜')接種到含10001改良18培養(yǎng)基和無機鹽培養(yǎng)基的5001111三角瓶中，培養(yǎng)2處，30。〇，180^.砧打―1。
[0047]分別將上述培養(yǎng)液于離心管中，120008離心10111111，用101111，￠117.0，濃度為2011111101/1的似2?。。?4-^^2？04緩沖液重懸菌體，置于超聲細胞破碎儀中破壁12111111，14000^離心15-?。?，棄去沉淀，所得上清即為粗酶液。
[0048]取100 4粗酶液與300 4 0.2 %的瓊脂糖混合，50 X:水浴反應(yīng)100111后加入400 V 1 0吧試劑終止反應(yīng)，沸水浴100111，稀釋4倍后于0054011111處檢測，酶活定義為:每毫升粗酶液1111111產(chǎn)生1 011101還原糖所需的酶量(1^)作為一個酶活力單位(11)，以滅活的酶液作為空白對照。
[0049]取粗酶液用考馬斯亮藍比色法測定粗酶液的總蛋白含量。計算比酶活。改良18培養(yǎng)基的比酶活為2.231加8，無機鹽培養(yǎng)基的比酶活為24.2川加8。
【權(quán)利要求】
1.瓊脂降解菌LGH，分類命名為柯恩氏菌(Cohnellasp.)，于2014年11月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC N0.10018。
2.權(quán)利要求1所述瓊脂降解菌LGH在制備瓊脂酶中的應(yīng)用。
3.一種利用權(quán)利要求1所述瓊脂降解菌LGH制備瓊脂酶的方法，其特征在于將權(quán)利要求I所述的瓊脂降解菌LGH在無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束的上清液即為含瓊脂酶的粗酶液；所述的無機鹽培養(yǎng)基配方為 Nacl lg/L, K2HPO4L 5g/L，KH2PO40.5g/L，(NH4)2S042g/L, MgSO40.2g/L，Cacl20.2g/L，瓊脂糖 2g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)條件為30?40°C培24?36h。
5.權(quán)利要求1所述的瓊脂降解菌LGH在降解瓊脂中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的瓊脂降解菌LGH在制備新瓊寡糖中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/38GK104498412SQ201410855021
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】武俊, 李 根, 魏維, 李鵬, 葛新成, 虞麗, 李輝信, 胡鋒 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)