專利名稱：肝素雙糖混合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝素雙糖混合物，其制備方法，使用該雙糖混合物作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)肝素或者低分子量肝素進(jìn)行HPLC分析的方法，以及所述雙糖混合物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝素(heparin)是一種糖胺聚糖類天然藥物,于1916年被Mclean發(fā)現(xiàn)具有抗凝血功能。1935年開始用作臨床抗凝藥物，成為僅次于胰島素的第2大天然產(chǎn)物藥物。廣泛用于治療血栓塞、暴發(fā)性流腦、敗血癥、腎炎、急性心肌梗塞、動(dòng)脈硬化等疾病，還具有澄清血漿脂質(zhì)，降低膽固醇，抗平滑肌增生、促進(jìn)纖維蛋白溶解等作用。肝素的化學(xué)本質(zhì)是長(zhǎng)短不一的酸性粘多糖長(zhǎng)鏈的混合物，由硫酸化或乙?；煌?的己糖醛酸(UA)和葡萄糖胺(GlcN)雙糖單位交替連接構(gòu)成，形成分子量4 40kDa的糖鏈混合物。為了從肝素源中產(chǎn)生低分子量肝素，必須將較長(zhǎng)的肝素多糖鏈打斷成較短的低分子量鏈。這一過程可以通過化學(xué)或酶的解聚作用來進(jìn)行。將肝素用酶法或β消除法充分分解為雙糖時(shí)，主要產(chǎn)生8種雙糖a - AUA-2S-[1 — 4]_GlcNS_6S(I_S)a - AUA-2S-[1 — 4]-GlcNAc_6S(I_A)a - AUA-[1 — 4]_GlcNS_6S(II-S)a - AUA-[1 — 4]-GlcNAc_6S(II-A)a - AUA-2S-[1 — 4]-GlcNS(III-S)a - AUA-2S-[1 — 4]-GlcNAc (III-A)a-AUA-[I — 4]-GlcNS(IV-S)a-AUA-[I — 4]-GlcNAc (IV-A)這8種雙糖在豬腸黏膜或其它來源的肝素和低分子肝素中的含量大致保持恒定，利用這一點(diǎn)，通過分析雙糖組成可以判斷肝素或低分子肝素的來源，也可分析生產(chǎn)中的批次間差異。以SAX-HPLC法測(cè)定肝素或低分子肝素中的雙糖種類和含量比例，可作為一種質(zhì)量是否合格的檢測(cè)手段。由于所用SAX-HPLC柱會(huì)在使用過程中漸漸因柱效下降而引起雙糖出峰位置漂移，這會(huì)對(duì)雙糖成分的判斷帶來干擾，需要在每次使用前先以標(biāo)準(zhǔn)雙糖來標(biāo)定出峰位置；并且，由于其中I-S含量過高，會(huì)掩蓋其他弱勢(shì)峰是在HPLC圖譜上如果有某個(gè)組分峰極高大時(shí)，其他組分峰在圖上就太弱小以至于接近基線而像是噪音峰，不利于對(duì)其他雙糖含量進(jìn)行分析。本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的雙糖混合物中不僅含有上述8種標(biāo)準(zhǔn)肝素雙糖，而且這8種雙糖的比例比較溫和，使用本發(fā)明雙糖混合物作為HPLC分析中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)，8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物的峰都能比較明顯地辨別出。在每次測(cè)定前均先用此混合雙糖做標(biāo)定，則每次測(cè)定目標(biāo)物的雙糖組分能確定辨別。
并且，本發(fā)明中的標(biāo)準(zhǔn)雙糖混合物，不但可以用做HPLC分析時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)，還可以用來檢測(cè)以肝素雙糖為作用底物的酶如肝素雙糖脫硫酸酶、肝素雙糖雙鍵消除酶等的存在。在肝素酶中有時(shí)會(huì)含有這兩種雜質(zhì)酶，其存在會(huì)導(dǎo)致肝素酶作用的最終產(chǎn)物被繼續(xù)作用，從而影響肝素酶降解反應(yīng)后的色譜分析。所以在使用前對(duì)肝素酶中是否含有這二種雜質(zhì)酶做檢測(cè)是很重要的。與現(xiàn)有技術(shù)中的相關(guān)方法相比，本發(fā)明簡(jiǎn)單易操作，具有極高的實(shí)際使用價(jià)值。本發(fā)明提出一種標(biāo)準(zhǔn)雙糖混合物的制備方法，通過將肝素先用肝素酶I充分降解為二糖、四糖、六糖混合物，取其中的四糖和六糖，再分別以肝素酶II、III聯(lián)合充分降解，分離出產(chǎn)生的雙糖，這樣得到兩種混合雙糖，均含所有8種前述標(biāo)準(zhǔn)肝素雙糖，而且這8種雙糖的比例比較溫和。可以使用這二種混合雙糖之一或其混合物，作為HPLC分析的標(biāo)準(zhǔn)物 質(zhì)。因此，本發(fā)明方法的創(chuàng)新點(diǎn)之一在于先用肝素酶I充分作用肝素，將肝素中含量過高的I-S雙糖除掉大部分，這樣獲得的雙糖混合物色譜圖上不致因I-S峰過于高大而掩蓋其他弱勢(shì)雙糖峰；另外將這樣的雙糖混合物用于檢測(cè)肝素雙糖脫硫酸酶、肝素雙糖雙鍵消除酶等為本發(fā)明首創(chuàng)。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的一方面中，本發(fā)明提供了一種標(biāo)準(zhǔn)雙糖混合物，在所述混合物中，含有肝素雙糖 1-8，肝素雙糖 1-8 分別為I-S，I-A, II-S, II-A, III-S, 111-A, IV-S, IV-A00在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的標(biāo)準(zhǔn)雙糖混合物的制備方法，所述方法包括步驟I、肝素樣品用肝素酶I (編號(hào)EC 4. 2. 2. 7.)降解；步驟2、對(duì)步驟I所得的降解產(chǎn)物中的二、四、六糖進(jìn)行分離，得到二糖，四糖，六糖；步驟3、步驟2中分離出的四糖、六糖分別用肝素酶II (肝素裂解酶II)、肝素酶III (編號(hào) EC 4.2.2.8.)降解；步驟4、兩種降解物分別用層析柱分離，分別分離出二糖和四糖；步驟5、步驟4得到兩種二糖混合物，即為本發(fā)明的第一種雙糖混合物和第二種雙糖混合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述步驟I的降解作用可以在4°C 35°C下進(jìn)行，優(yōu)選在8°C 30°C下進(jìn)行，更優(yōu)選在室溫下(25°C )進(jìn)行。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述步驟I的降解作用可以進(jìn)行2-48小時(shí)，更優(yōu)選2-24小時(shí)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在步驟2中，利用柱層析方法對(duì)步驟I中所得的降解產(chǎn)品進(jìn)行分離；優(yōu)選在該方法中使用分子量分離范圍100-10000的凝膠過濾柱，比如聚丙烯酰胺類、葡聚糖凝膠類、瓊脂糖凝膠類，或其他類凝膠過濾柱；優(yōu)選使用BiO-Gel P6柱(I. 5 X 100cm)。在上述步驟2的洗脫過程中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)選擇的洗脫柱選擇適當(dāng)?shù)南疵撘哼M(jìn)行洗脫，例如氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、碳酸氫銨。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如在洗脫柱為Bio-Gel P6柱(I. 5X100cm)的情形中，可以使用O. 1-1. 0M(更優(yōu)選O. 2M)碳酸氫
銨平衡并洗脫。在洗脫分離過程中，洗脫液的流速可以 由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇，優(yōu)選O. 1-5. Oml/min,最優(yōu)選 O. 1-1. Oml/min。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述步驟3的降解作用可以在4°C 35°C下進(jìn)行，優(yōu)選在8°C 25 °C下進(jìn)行，更優(yōu)選在室溫下進(jìn)行。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述步驟3的降解作用可以進(jìn)行6-48小時(shí)，更優(yōu)選6_24小時(shí)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在步驟4中，利用分子量分離范圍100-10000的凝膠過濾柱，比如聚丙烯酰胺類、葡聚糖凝膠類、瓊脂糖凝膠類，或其他類凝膠過濾柱；優(yōu)選使用Bio-Gel P6 柱(I. 5XIOOcm)。在上述步驟2的洗脫過程中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)選擇的洗脫柱選擇適當(dāng)?shù)南疵撘哼M(jìn)行洗脫，例如氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、碳酸氫銨等等的水溶液。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如在洗脫柱為Bio-Gel P6柱(I. 5X100cm)的情形中，可以使用O. 1-1. 0M(更優(yōu)選O. 2M)碳酸氫銨平衡并洗脫。在洗脫分離過程中，洗脫液的流速可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇，優(yōu)選O. 1-5. Oml/min,最優(yōu)選 O. 1-1. Oml/min。在上述實(shí)施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)雙糖混合物既可以是上述方法中獲得的雙糖混合物1，也可以是雙糖混合物2，還可以是雙糖混合物I和2的混合物。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，最優(yōu)選步驟I為取肝素樣品，溶于Tris-HCl (50mM，含CaCl2IOmM, pH7. O)緩沖液中，優(yōu)選肝素與Tris-HCl的質(zhì)量體積比為200 1-10 (mg ml)，加入肝素酶 I(50mM Tris-HCl 溶液，含 CaCl2IOmM, ρΗ7· O) 2-20IU，在室溫下，酶解2-24小時(shí)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，最優(yōu)選步驟2為取步驟I中獲得的降解產(chǎn)物，上一根Bio-Gel Ρ6柱(I. 5 X IOOcm)，以O(shè). 2Μ碳酸氫銨平衡并洗脫，流速O. 1-1. Oml/min，分部收集，先后得到六糖、四糖、雙糖，將四糖和六糖分別匯合收集，60°C旋轉(zhuǎn)濃縮。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，最優(yōu)選步驟3為向步驟2獲得的四、六糖組分中，分別加入O. 1-2. OIU肝素酶II和O. 2-5. OIU肝素酶III (均為50mM Tris-HCl溶液，含CaCl2IOmM, pH7. O)，在室溫下，酶解6-24小時(shí)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，最優(yōu)選步驟4為將步驟3中獲得的兩種降解物分別上一根Bio-Gel P6柱(I. 5 X IOOcm)，以O(shè). 2M碳酸氫銨平衡并洗脫，流速O. 1-1. Oml/min,分部收集，先后得到四糖、雙糖在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的標(biāo)準(zhǔn)雙糖混合物的制備方法，所述方法包括步驟I、取肝素樣品，溶于Tris-HCl (50mM，含CaCl2IOmM,pH7. O)緩沖液中，優(yōu)選肝素與Tris-HCl的質(zhì)量體積比為200 1-10 (mg ml)，加入肝素酶I (50mMTris_HCl溶液，含 CaCl2IOmM, ρΗ7· O) 2-20IU,在室溫下，酶解 2-24 小時(shí)；步驟2、取步驟I中獲得的降解產(chǎn)物，上一根Bio-Gel Ρ6柱(I. 5 X IOOcm)，以O(shè). 2Μ碳酸氫銨平衡并洗脫，流速O. 1-1. Oml/min，分部收集，先后得到六糖、四糖、雙糖，將四糖和六糖分別匯合收集，60°C旋轉(zhuǎn)濃縮；步驟3、向步驟2獲得的四、六糖組分中，分別加入O. 1-2. OIU肝素酶II和
O.2-5. OIU 肝素酶 III (均為 50mM Tris-HCl 溶液，含 CaCl2IOmM, ρΗ7· O)，在室溫下，酶解6-24小時(shí)；步驟4、將步驟3中獲得的兩種降解物分別上一根Bio-Gel Ρ6柱(I. 5X 100cm)，以O(shè). 2Μ碳酸氫銨平衡并洗脫，流速O. 1-1. Oml/min，分部收集，先后得到四糖、雙糖；
步驟5、步驟4得到兩種二糖混合物，分別匯合收集，60°C旋轉(zhuǎn)濃縮至1-lOml，冷凍干燥，得到本發(fā)明的雙糖混合物I和雙糖混合物2。以上步驟中，肝素酶I，肝素酶II、肝素酶III為可商業(yè)獲得的酶，來源于IBEX公司或SIGMA公司或其他公司生產(chǎn)的，從天然菌體發(fā)酵并分離純化而來的產(chǎn)品，或者經(jīng)基因工程表達(dá)并純化的產(chǎn)品。Bio-Gel P6柱為商業(yè)獲得純化填料裝填的柱子，填料來源于BIO-RAD公司生產(chǎn)的層析純化填料產(chǎn)品,柱子為普通玻璃柱。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)上述方法獲得的雙糖混合物，該雙糖混合物可以為第一種雙糖混合物、第二種雙糖混合物或者二者的混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一種雙糖混合物為雙糖混合物1，其中8種肝素雙糖的摩爾含量分別為I-S，47% ;I-A，I. 3%；II-S, 18. 9%；II-A, 12. 5%；III-S, 3. 7%；III-A,
3.3% ；IV-S,4. 9% ；IV-A,6. 7%。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種雙糖混合物為雙糖混合物2，其中8種肝素雙糖的摩爾含量分別為I-S，40.6% ； I-A, 5. 7% ；II-S,37. 7% ；II-A, I. 2% ；III-S,9. 9% ；III-A,2. 3% ；IV-S, I. 7% ；IV-A,0. 98%。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的雙糖混合物檢測(cè)肝素雙糖作用酶的存在的方法，所述方法包括I)將本發(fā)明的雙糖混合物配成l-10mg/ml溶液；2)向步驟I的溶液中加入可能含有肝素雙糖作用酶的物質(zhì)，比如肝素雙糖脫硫酸酶、肝素雙糖雙鍵消除酶等，室溫反應(yīng)6-24小時(shí)；3)用SAX-HPLC法(例如，色譜操作條件可以見表I)測(cè)定步驟2)反應(yīng)后的雙糖圖譜，對(duì)比步驟I)中使用的雙糖混合物的SAX-HPLC圖譜，觀察各成分的色譜峰面積變化。在步驟I)中，可以使用任何適宜的溶劑，但是優(yōu)選使用Tris-HCl溶液(50mM，含CaCl2IOmM, pH7. O)作為溶劑。在上述方法中，如果有某種雙糖色譜峰面積減少而另一種雙糖色譜峰面積增多，意味著該酶能催化一種雙糖變成另一種雙糖。如果有某種雙糖色譜峰面積減少而無他種雙糖色譜峰面積增多，則意味著該酶能作用該雙糖引起雙鍵消除。這樣的酶作為雜質(zhì)存在于肝素酶中，會(huì)對(duì)酶反應(yīng)帶來極大的干擾。事先檢測(cè)其存在，可將干擾提前排除。


圖I步驟2中，二糖、四糖、六糖的A232值對(duì)洗脫管數(shù)圖譜圖2步驟3中，四糖組分的A232值對(duì)洗脫管數(shù)圖譜圖3步驟3中，六糖組分的A232值對(duì)洗脫管數(shù)圖譜
圖4雙糖混合物I的SAX-HPLC圖譜圖5雙糖混合物2的SAX-HPLC圖譜圖6 —種催化I-S雙糖脫去2位硫酸基的酶作用混合雙糖后的SAX-HPLC圖譜圖7 —種能將肝素雙糖中ΛUA雙鍵破壞掉的酶作用混合雙糖后的SAX-HPLC圖譜
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。請(qǐng)對(duì)以下實(shí)施例中所使用的原料、儀器以及操作方法進(jìn)行說明
實(shí)施例I :標(biāo)準(zhǔn)雙糖混合物的制備步驟I :肝素的酶 I 降解取 200mg 肝素，溶于 2ml Tris-HCl (50mM，含 CaC1210mM，pH7. 0)緩沖液中，加入肝素酶I (50mM Tris-HCl溶液，含CaC1210mM，pH7. O) 12IU，室溫酶解24小時(shí)；步驟2 : 二、四糖片段的分離取酶I降解產(chǎn)物，上一根Bio-Gel P6柱(I. 5 X 100cm)，以O(shè). 2M碳酸氫銨平衡并洗脫，流速O. 3ml/min，分部收集，共收集130管，每管I. 5ml，測(cè)定A232值(A232指使用Icm光徑比色皿在分光光度計(jì)上測(cè)得的232nm的吸收值)，以A232值對(duì)洗脫管數(shù)作圖(以洗脫管數(shù)為X軸，以A232為Y軸做圖)，洗脫圖譜上顯示主要的3個(gè)峰，見圖1，由后至前分別是二糖、四糖、六糖，將四糖和六糖分別匯合收集，60 °C旋轉(zhuǎn)濃縮至Iml ；步驟3:四、六糖片段的酶II、III聯(lián)合降解向步驟2得到的四、六糖組分，分別加入IIU肝素酶II和2IU肝素酶III (均為50mM Tris-HCl溶液，含CaCl2IOmM, pH7. O)，室溫酶解24小時(shí)；步驟4 :聯(lián)合酶解物的分離步驟3得到的四、六糖組分再次降解物，分別上一根Bio-Gel P6柱(I. 5X 100cm)，洗脫條件同于步驟2，四、六糖組分再次降解物洗脫圖譜上均顯示主要的2個(gè)峰，見圖2、3，由后至前分別是二糖、四糖，將兩者分離出的二糖分別匯合收集，60°C旋轉(zhuǎn)濃縮至1ml，冷凍干燥，由此得到雙糖混合物I和雙糖混合物2 ；所述標(biāo)注雙糖混合物為雙糖混合物I或者雙糖混合物2或者二者的混合物。實(shí)施例2 :雙糖混合物組成的鑒定和含量測(cè)定采用SAX-HPLC法，色譜條件見表1，洗脫梯度和雙糖出峰時(shí)間分別見表2、3，兩種雙糖混合物的SAX-HPLC圖譜見圖4、5，雙糖的摩爾百分含量標(biāo)示于圖上。由于色譜圖中除8種所述肝素雙糖的吸收峰外，尚含有其它幾個(gè)微小的吸收峰，這導(dǎo)致混合物中8種雙糖峰面積積分定量后比例之和小于100%。這幾個(gè)微小吸收峰可能是幾種微量的、難以確定化學(xué)本質(zhì)的、非主要肝素雙糖或三糖、四糖，也可能是溶劑峰，暫時(shí)不能確定。雙糖混合物I中，8種肝素雙糖的摩爾含量分別為I_S，47% ；I-A,1.3% ;II_S，18. 9% ；II-A, 12. 5% ；III-S,3. 7% ；III-A,3. 3% ；IV-S,4. 9% ;IV_A，6.7%。雙糖混合物2，中8種肝素雙糖的摩爾含量分別為I-S，40.6%;I-A，5. 7%;II-S，37. 7% ；II-A, I. 2% ；III-S,9. 9% ；III-A,2. 3% ；IV-S, I. 7% ；IV-A,0. 98%。表I SAX-HPLC法的色譜條件
權(quán)利要求
1.雙糖混合物，其特征在于，在所述混合物中，含有肝素雙糖1-8，肝素雙糖1-8分別為l-s，I-A, II-S, II-A, III-S, 111-A, IV-S, IV-A。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的雙糖混合物，其特征在于，所述混合物為混合物1，其中8種肝素雙糖的摩爾含量分別為I-S,47% ；I-A, I. 3% ；II-S,18. 9% ；II-A, 12. 5% ；III-S,3. 7% ；III-A,3. 3% ；IV-S,4. 9% ;IV_A，6.7%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的雙糖混合物，其特征在于，所述混合物為混合物2，其中8種肝素雙糖的摩爾含量分別為I-S，40.6% ；I-A,5. 7% ；II-S,37. 7% ；II-A, I. 2% ；III-S,9. 9% ；III-A,2. 3% ；IV-S, I. 7% ；IV-A,0. 98%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙糖混合物的制備方法，包括以下步驟 步驟I、肝素樣品用肝素酶I降解； 步驟2、對(duì)步驟I所得的降解產(chǎn)物中的二、四、六糖進(jìn)行分離，得到二糖，四糖，六糖； 步驟3、步驟2中分離出的四糖和六糖均使用肝素酶II和肝素酶III降解； 步驟4、降解物分別用層析柱分離，分別分離出二糖和四糖； 步驟5、步驟4得到兩種二糖混合物，即第一種混合物和第二種混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述步驟I的降解作用可以在4°C 35°C下進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述步驟I的降解作用在室溫下進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述步驟I的降解作用在室溫下進(jìn)行2-24小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4 7任一項(xiàng)的方法，其中在步驟2中，利用柱層析方法對(duì)步驟I中所得的降解產(chǎn)品進(jìn)行分離。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中在步驟2中，使用Bio-GelP6柱(I. 5 X IOOcm)對(duì)步驟I中所得的降解產(chǎn)品進(jìn)行分離。
10.根據(jù)權(quán)利要求4 9任一項(xiàng)的方法，其中所述步驟3的降解作用可以在4°C 35°C下進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述步驟3的降解作用在室溫下進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述步驟3的降解作用在室溫下進(jìn)行6-24小時(shí)。
13.根據(jù)權(quán)利要求4 12任一項(xiàng)的方法，其中在步驟4中，使用Bio-GelP6柱(I. 5 X IOOcm)進(jìn)行分離。
14.根據(jù)權(quán)利要求4 13任一項(xiàng)的方法，包括以下步驟 步驟I、取肝素樣品，溶于Tris-HCl緩沖液中，加入肝素酶I，在室溫下，酶解2-24小時(shí)； 步驟2、取步驟I中獲得的降解產(chǎn)物，上一根Bio-Gel P6柱(I. 5 X IOOcm)，以碳酸氫銨溶液平衡并洗脫，分部收集，先后得到六糖、四糖、雙糖，將四糖和六糖分別匯合收集，濃縮； 步驟3、向步驟2獲得的四糖和六糖組分中，分別加入肝素酶II和肝素酶III，在室溫下，酶解6-24小時(shí)； 步驟4、將步驟3中獲得的降解物上Bio-Gel P6柱(I. 5X IOOcm)，以碳酸氫銨溶液平衡并洗脫，分部收集，先后得到四糖和雙糖； 步驟5、步驟4得到二糖混合物，分別匯合收集，旋轉(zhuǎn)濃縮，冷凍干燥，得到本發(fā)明的第一種雙糖混合物和第二種雙糖混合物。
15.一種檢測(cè)肝素雙糖作用酶的存在的方法，所述肝素雙糖作用酶為肝素雙糖脫硫酸酶或肝素雙糖雙鍵消除酶，或其它能以肝素雙糖為作用底物引起可檢測(cè)變化的酶，所述方法包括 1)將權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)的雙糖混合物配成l-10mg/ml溶液； 2)向步驟I的溶液中加入可能含有肝素雙糖作用酶的物質(zhì)，室溫反應(yīng)6-24小時(shí)； 3)用上述SAX-HPLC法測(cè)定步驟2)反應(yīng)后的雙糖圖譜，對(duì)比步驟I)中使用的雙糖混合物的SAX-HPLC圖譜，觀察各成分的色譜峰面積變化，進(jìn)行判定。
16.根據(jù)權(quán)利要求4 14任一項(xiàng)的方法獲得的雙糖混合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的混合物，其為混合物I、混合物2或者二者的混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及肝素雙糖混合物，其制備方法，使用該雙糖混合物作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)肝素或者低分子量肝素進(jìn)行HPLC分析的方法，以及所述雙糖混合物的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P19/12GK102864191SQ20121004675
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者馬小來, 黃洪, 張紫恒, 李鋰 申請(qǐng)人:深圳市海普瑞藥業(yè)股份有限公司