專利名稱：用于評(píng)估種子純度的dna標(biāo)記和應(yīng)用dna序列評(píng)估種子純度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用DNA序列作為評(píng)估種子純度的方法，尤其涉及具有同源性的DNA序列和水稻的線粒體DNA，其對(duì)于含有水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的野生敗育(WA)的細(xì)胞質(zhì)是特有的，且在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)中應(yīng)用這些序列去區(qū)別水稻的雄性不育系(CMS)和它們的同族雄性可育保持系。本發(fā)明涉及利用DNA堿基標(biāo)記確保水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的純度的一種方法。
背景技術(shù)：
雜種優(yōu)勢(shì)是在兩個(gè)近親繁殖系的一個(gè)雜交的后代比它雙親中的任一個(gè)有高的生產(chǎn)潛力的一種現(xiàn)象。雜種能產(chǎn)生比最好的品系高10-30％的產(chǎn)量，而且對(duì)于增加產(chǎn)量它也是一個(gè)受歡迎的選擇。
在世界上水稻是主要的禾谷類作物，而且在亞洲的許多地區(qū)它是飲食的主要部分。據(jù)估計(jì)，在亞洲的許多國(guó)家，象印度，到2025年為止，水稻的產(chǎn)量必須加倍才能滿足日益增長(zhǎng)的人口需要[Hossain，1996.InKhush(ed)水稻遺傳學(xué)(Rice Genetics)III，Proc.Third Intl.RiceGenet.Symp.，Los Banos馬尼拉，菲律賓，16-20 Oct.1995.國(guó)際水稻研究院，馬尼拉，菲律賓]。就象在中國(guó)所證明的那樣，在中國(guó)，幾乎水稻種植面積的50％都是被雜種覆蓋。雜種水稻的廣泛種植對(duì)于增加產(chǎn)量是一個(gè)理想的可行的選擇。相比之下，在象印度這樣的國(guó)家，雜交水稻的種植面積不到水稻總的種植面積的1％。這證明了增加雜交水稻種植面積的巨大的潛力，而且，人們預(yù)計(jì)，雜交水稻種子的市場(chǎng)在許多種植水稻的國(guó)家將增加，這包括印度。
對(duì)于雜交水稻的生產(chǎn)應(yīng)用最廣泛的系統(tǒng)是三系雜交系統(tǒng)(表1)。三系雜交系統(tǒng)包括1、一個(gè)被稱做細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(CMS)的雄性不育的雌性可育系，因?yàn)樗诨蚪M的細(xì)胞質(zhì)成分中攜帶有一個(gè)給予它突變的雄性不育；2、保持系；以及3、恢復(fù)系。保持系和恢復(fù)系是雄性可育和雌性可育的。CMS和保持系與基因組的細(xì)胞核的成分實(shí)際上是完全相同的(常常作為等同-細(xì)胞核系被提到)，但是基因組的細(xì)胞質(zhì)的成分是互不相同的。CMS系的雄性不育是母性遺傳的，而且最有可能是由于在線粒體DNA上突變。CMS系(雌性可育)可通過(guò)用來(lái)源于保持系的花粉受精被繁殖。因?yàn)榛蚪M的細(xì)胞質(zhì)不能通過(guò)花粉進(jìn)行轉(zhuǎn)移，這樣雜交的后代將僅僅遺傳有來(lái)源于CMS系的細(xì)胞質(zhì)，而且將因此是雄性不育的。即使后代基因組的細(xì)胞核成分有一半來(lái)源于保持系，由于在這兩個(gè)系的基因組的成分沒有什么區(qū)別，后代基因組的細(xì)胞核成分同CMS系的細(xì)胞核成分也是完全相同的。
在CMS系和另一個(gè)近親繁殖的親本系雜交中產(chǎn)生的雜種種子被稱做恢復(fù)系，就象上面所指明的那樣是雄性可育和雌性可育的。在這個(gè)雜交中，CMS系作為雌性的親本起作用，而恢復(fù)系是作為雄性的親本?；謴?fù)系在其細(xì)胞核基因組中帶有一個(gè)Rf基因/或多個(gè)Rf基因(可育的恢復(fù))，它將恢復(fù)細(xì)胞質(zhì)源于CMS系遺傳的植物的雄性可育性。因此，在如

圖1所示的雜交中產(chǎn)生的雜種的種子是可育的。CMS和恢復(fù)系要恰當(dāng)?shù)剡x擇，這樣雜交呈現(xiàn)充分的雜種優(yōu)勢(shì)(雜種優(yōu)勢(shì))以得到比近交的品種實(shí)際上更高的產(chǎn)量。
目前在世界上具有商業(yè)價(jià)值種植的雜交水稻的絕大多數(shù)(90％或更多)是從一個(gè)單一的資源衍生它們的細(xì)胞質(zhì)[Yuan，1995，雜交水稻生產(chǎn)技術(shù)，水稻研究理事會(huì)(Directorate of Rice Research)，海得拉巴，印度]，這種細(xì)胞質(zhì)被稱作野生敗育(WA)細(xì)胞質(zhì)，是在中國(guó)的野生稻中被發(fā)現(xiàn)的。隨后，利用循環(huán)的親體做為雄性供體，通過(guò)重復(fù)回交使這個(gè)細(xì)胞質(zhì)同幾種不同細(xì)胞核遺傳背景進(jìn)行雜交。在這個(gè)方法里，幾個(gè)不同的CMS系已被培育。它們中每一個(gè)都按順序同不同的恢復(fù)系雜交而培育出大量的雜種，它們所有都具有相同的WA細(xì)胞質(zhì)。
保持雜種的純度是重要的，因?yàn)槿魏坞s質(zhì)都會(huì)降低期望的產(chǎn)量。據(jù)估計(jì)，在雜種種子中每1％的雜質(zhì)會(huì)使產(chǎn)量降低達(dá)100kg/公頃[Mao等，1996In Virmani，S.S.，E.A.Siddiq，和K.Muralidharan(eds)，雜交水稻技術(shù)的進(jìn)展(Advances in Hybrid Rice Technology)Proc.Third Intl.Symp.on Hybrid Rice，水稻研究理事會(huì)(Directorate of Rice Research)，海得拉巴，印度]。印度種子法規(guī)定雜交水稻期望的純度應(yīng)該是98％(Verma，1996.Seed Tech.News 241-4)。在中國(guó)雜交水稻的純度被規(guī)定至少是96％(Wengui Yan，2000.，US Patent #6066779)。為了確保雜交種子純度要求的水平，用于雜交種子生產(chǎn)的親本系應(yīng)有高的純度(幾乎99％)水平。
一個(gè)最常見的出現(xiàn)在雜交種子生產(chǎn)期間的雜質(zhì)是CMS系種子中的保持系雜質(zhì)。因?yàn)樗鼈兌际堑韧?xì)胞核系，除了雄性不育僅在開花期能被判斷，基于形態(tài)上的標(biāo)準(zhǔn)去區(qū)分這些系是極其困難的。區(qū)分CMS和保持系的DNA標(biāo)記可能被研究開發(fā)和被應(yīng)用在苗的水平上去進(jìn)行做為雜質(zhì)出現(xiàn)在CMS系的原種中保持系種子的實(shí)際檢測(cè)?；诰酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)基礎(chǔ)上的DNA標(biāo)記對(duì)于這個(gè)目的是極其適用的。因?yàn)樗鼈儽然谙拗菩云伍L(zhǎng)度多態(tài)性的方法基礎(chǔ)上的雜交能更為有效地處理大量的樣品。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是基于應(yīng)用短寡聚核苷酸序列做為引物的DNA序列的酶[促]擴(kuò)增的基礎(chǔ)上的，這樣的DNA序列出現(xiàn)在兩個(gè)結(jié)合在靶DNA位點(diǎn)適當(dāng)間隔的引物之間。當(dāng)寡聚核苷酸引物在已知靶DNA序列的基礎(chǔ)上被設(shè)計(jì)時(shí)，PCR工作是重復(fù)的。基于的短的(8-10個(gè)堿基長(zhǎng))，隨機(jī)設(shè)計(jì)的寡聚核苷酸引物[Williams等，1990；核酸研究(Nucleic acidsresearch) 186531-6535]的PCR的程序已被研究開發(fā)。這些引物不是以已知的靶DNA序列為基礎(chǔ)的，而且包含有大量的這些隨機(jī)產(chǎn)生的引物的試劑盒現(xiàn)在都已商品化供應(yīng)。用這種方法被研究開發(fā)的DNA標(biāo)記就是被稱為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)(RAPD)DNA標(biāo)記。由于大量的引物是可用的，即使是極其相關(guān)的品系，其遺傳(基因)的多態(tài)性也可以用這種方法檢測(cè)。然而，RAPD標(biāo)記的重復(fù)性是不好的，這是由于RAPD的寡聚核苷酸引物長(zhǎng)度短，也可能是由于對(duì)靶特異性的要求程度的缺乏。這嚴(yán)重限制了RAPD標(biāo)記做為一種區(qū)分不同基因型的診斷標(biāo)記的實(shí)際應(yīng)用。
用于區(qū)分水稻CMS(WA細(xì)胞質(zhì))和保持系的RAPD標(biāo)記，曾有過(guò)報(bào)道(Jena和Pandey 1999；Hybrid Rice Newsletter，213-14)。然而，由于這些標(biāo)記的低可重復(fù)性使在實(shí)際中不可能應(yīng)用它們以常規(guī)方法對(duì)CMS和保持系進(jìn)行區(qū)分。因此，基于這些方法基礎(chǔ)上的可重復(fù)PCR的研究開發(fā)是必要的，且其能被應(yīng)用于區(qū)分CMS和保持系，如果寡聚核苷酸引物是基于在CMS和保持系之間的具有多態(tài)性的水稻DNA一個(gè)區(qū)域已知序列的基礎(chǔ)上的，那么可能獲得理想的重復(fù)水平。因?yàn)檫@些引物在長(zhǎng)度上比用在RAPD分析上的引物長(zhǎng)且對(duì)靶DNA序列特異，所以基于這樣引物基礎(chǔ)上的PCR檢測(cè)將是高度可重復(fù)的。

發(fā)明內(nèi)容
在本申請(qǐng)中，對(duì)于含有野生敗育型細(xì)胞質(zhì)(WA)的CMS水稻系特異的水稻線粒體DNA一個(gè)區(qū)域的序列確定和識(shí)別進(jìn)行了描述。在這個(gè)序列基礎(chǔ)上，可以被用于在PCR檢測(cè)中區(qū)分CMS系(WA)和與它等同細(xì)胞核保持系的特異的寡聚苷酸引物已被研究開發(fā)。這些引物已被用于區(qū)分幾種不同的水稻CMS系(所有均含有WA細(xì)胞質(zhì))和它們同源的保持系。在一個(gè)編代碼試驗(yàn)中，這個(gè)檢測(cè)被用于預(yù)測(cè)水稻CMS(WA)保持系混合物的基因型，其具有100％的準(zhǔn)確性。因此育種者可以應(yīng)用這個(gè)檢測(cè)去成功地檢測(cè)在CMS系的原種種子中保持質(zhì)的雜質(zhì)，確保了這個(gè)親本系及其由它衍生的雜種純度。
在CMS系的原種種子中另一個(gè)雜質(zhì)的來(lái)源是由不是指定保持系的水稻花粉雜交引起的。對(duì)于水稻CMS系的繁殖[Virmani，1993.農(nóng)學(xué)進(jìn)展(Advances in Agronmy)57377-462]，規(guī)定的最小隔離距離為300米，在這個(gè)距離內(nèi)除了保持系(優(yōu)先的花粉供體或雄性親本)外，沒有其它品系的水稻被培育，這是基于來(lái)源于這個(gè)距離以外的正在生長(zhǎng)的水稻的花粉不能傳粉給雌性親本的觀察為基礎(chǔ)的。偶爾，這個(gè)最小的隔離距離或者沒有被嚴(yán)格遵守或者由于當(dāng)?shù)氐臈l件(例如風(fēng)流和天氣)可能允許花粉從正在生長(zhǎng)的水稻作物上被轉(zhuǎn)移到300米以外的距離。因此，監(jiān)測(cè)在CMS繁育期間出現(xiàn)的劣種花粉供體遠(yuǎn)源雜交的程度是重要的。在本專利中，描述了象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STSs)這樣用于估計(jì)在CMS系的原種種子繁育期間出現(xiàn)的遠(yuǎn)源雜交的程度的序列特異的PCR標(biāo)記的應(yīng)用方法。
盡管這個(gè)應(yīng)用是用于估計(jì)水稻CMS系出現(xiàn)的遠(yuǎn)源雜交的程度，但是用于估計(jì)遠(yuǎn)源雜交程度的相似方法已被應(yīng)用于其它作物CMS系中，其非限制性包括玉米、珍珠谷子、高粱、麥子、太陽(yáng)花、芥子、卷心菜、花木郁菜、西紅柿、胡椒、秋葵等。在這里CMS系被用于雜種的生產(chǎn)而且合適的微衛(wèi)星或STS標(biāo)記也是可行的。
雜種種子純度的評(píng)估在傳統(tǒng)上是通過(guò)生長(zhǎng)測(cè)試(GOT)試驗(yàn)完成，這是基于生長(zhǎng)成熟的具有代表性的植物樣品的形態(tài)和花的特性(區(qū)分雜種)基礎(chǔ)上的，水稻植株要花幾個(gè)月的時(shí)間才能成熟而且這些種子不得不貯存在適宜的條件下，因此它們要等到這些試驗(yàn)結(jié)果是可行后才能被銷售。此外，象在印度出現(xiàn)的那樣，如果在雜交種子生產(chǎn)后被GOT所占據(jù)的第一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)也是雜種培育的優(yōu)選季節(jié)的情況下就會(huì)引起相當(dāng)大的耽擱。在這樣情況下，種子不得不被貯存達(dá)一年至到在它們能銷售之前的隨后的生長(zhǎng)季節(jié)到來(lái)。對(duì)于種子公司在延長(zhǎng)的周期中大量的資金因此被以雜種原種的形式擱死，同時(shí)等待GOT的結(jié)果。GOT的另一個(gè)缺陷是它對(duì)由于環(huán)境影響形態(tài)特征的表達(dá)是敏感的。而且，也存在這種可能性，即不利的氣候條件(象大風(fēng)或大雨)可能損害或毀掉作物，這樣使收集數(shù)據(jù)變得困難了。
從速度和準(zhǔn)確性方面考慮，以一個(gè)優(yōu)越的試驗(yàn)取代GOT為目標(biāo)，基于檢測(cè)的一個(gè)PCR被描述用于評(píng)估雜種種子純度。這些實(shí)驗(yàn)包括區(qū)別水稻雜種親本系的微衛(wèi)星或STS(序列標(biāo)簽位點(diǎn))多態(tài)性的應(yīng)用。這些多態(tài)性是共顯性的，而且等位基因是做為在PCR及瓊脂糖凝膠電泳中不同大小的DNA片段被檢測(cè)的。雜種能被鑒定，因?yàn)樗斜粌蓚€(gè)親本提供的等位基因，即從雜種植物中分離的DNA在PCR中做為一個(gè)模板的應(yīng)用后，PCR擴(kuò)增的兩個(gè)不同大小的片段被獲得。這些等位基因中的一個(gè)被雄性不育、雌性可育的(CMS)親本提供，而另一個(gè)被雄性可育、雌性可育的親本(恢復(fù)系)提供。這個(gè)試驗(yàn)是用從6天的水稻幼苗分離的DNA而進(jìn)行的，且檢測(cè)能在48小時(shí)之內(nèi)被完成。這個(gè)基于種子純度試驗(yàn)的PCR的實(shí)施在種子工業(yè)上將引起相當(dāng)大的節(jié)約。在本實(shí)驗(yàn)中描述的對(duì)這個(gè)檢測(cè)的另外的修改不需要在單獨(dú)的苗上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而能夠在從雜種種子原種所獲得的一個(gè)群體苗上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明涉及用于評(píng)估種子純度的新的DNA標(biāo)記和用基于標(biāo)記的DNA確保水稻細(xì)胞質(zhì)的雄性不育系純度的方法。該方法是基于對(duì)水稻W(wǎng)A細(xì)胞質(zhì)雄性不育系特異的一個(gè)DNA序列的確認(rèn)識(shí)別的基礎(chǔ)上的，也是關(guān)于來(lái)源相同的特異的DNA標(biāo)記的研究開發(fā)。這些DNA標(biāo)記能被用于檢測(cè)CMS系的雄性可育保持系的雜質(zhì)。這個(gè)應(yīng)用可能對(duì)于雜交水稻工業(yè)是非常有利的，因?yàn)樯鲜龅幕旌衔镱愋统３?dǎo)致雜交種子有一個(gè)下降的純度和在商品交易中產(chǎn)品的不利的銷售。本發(fā)明還提供了在親本系、雜交水稻及其它作物中應(yīng)用象微衛(wèi)星和STSs這樣的共顯性序列特異的PCR標(biāo)記檢測(cè)的方法。
在世界的許多地方，水稻是主要的禾谷類作物。中國(guó)正在大規(guī)模地實(shí)踐雜交水稻的種植，據(jù)報(bào)道，雜交水稻種植后產(chǎn)量增加了10-30％。人們期望在不久的將來(lái)，雜交水稻技術(shù)也將在許多其它的生長(zhǎng)水稻的國(guó)家被大規(guī)模實(shí)踐。目前，大多數(shù)雜交水稻，通過(guò)一個(gè)三系系統(tǒng)生產(chǎn)，其包括1、一個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(CMS)，由于在水稻基因組細(xì)胞質(zhì)成分上的一個(gè)突變(最可能是線粒體)，所以其是雌性可育的但雄性不育的；2、一個(gè)雄性可育的、雌性可育的保持系，它和CMS系基因組細(xì)胞核成分是完全相同的，但有一個(gè)不能誘導(dǎo)雄性不育的不同的細(xì)胞質(zhì)基因型；3、一個(gè)雄性可育的、雌性可育的恢復(fù)系。CMS系做為雌性親本在雜交中起作用，而恢復(fù)系是雄性親本。在雜種種子生產(chǎn)期間，CMS和恢復(fù)系在很近的距離內(nèi)被培育，這樣，來(lái)源于恢復(fù)系的花粉將被傳粉給CMS系的花上。因?yàn)镃MS系是雄性不育的，它將不能通過(guò)白花傳粉結(jié)種，而且在CMS系上形成的任何種子都注定是由于來(lái)源于恢復(fù)系的花粉受精的結(jié)果。恢復(fù)系帶有一個(gè)或多個(gè)編碼基因的細(xì)胞核，它將恢復(fù)雜種的雄性可育，即使它帶有一個(gè)CMS細(xì)胞質(zhì)。因此雜種是自交可稔的。
CMS系由于本身是雄性不育的，它不能通過(guò)自交繁育。實(shí)際上，CMS系的繁育是通過(guò)用CMS系做為一個(gè)雌性親本和保持系做為一個(gè)雄性親本被完成的。從這雜交中出現(xiàn)的后代的基因型將同CMS系的基因型是完全相同的，因?yàn)楸３窒岛虲MS系實(shí)際上在基因組的細(xì)胞核成分上是完全相同的。后代將有CMS系的雄性不育的特性，因?yàn)榛蛐偷募?xì)胞質(zhì)成分是由雌性親本提供的，在本試驗(yàn)情況下是CMS系。還應(yīng)注意到保持系不帶有CMS系的細(xì)胞質(zhì)雄性不育表型的任何恢復(fù)。
CMS和保持系的細(xì)胞核基因型的等同性意味著這兩個(gè)品系通過(guò)形態(tài)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)幾乎是不可區(qū)分的。這就產(chǎn)生了一個(gè)實(shí)際問題，因?yàn)槿z測(cè)在CMS系種子原種中的保持系雜質(zhì)是極其困難的。因?yàn)楸３窒凳亲越豢娠模@些雜質(zhì)能在雜交水稻的生產(chǎn)田中不需要恢復(fù)系授精就能產(chǎn)生種子，這導(dǎo)致了保持系的種子污染了雜種的種子。這種類型的污染在雜交水稻種子的生產(chǎn)期間是最常被觀察的，而且導(dǎo)致期望產(chǎn)量的減少及在田里雜種的弱的生產(chǎn)能力。如果雜種的純度達(dá)不到種子證明處(seed certificationagencies)制定的規(guī)定的限制(在印度是98％，在中國(guó)96％)，所有的種子都被拒絕，這對(duì)種子生產(chǎn)者(公司)是相當(dāng)大的損失。
在雜交水稻的商品生產(chǎn)中用的CMS系絕大多數(shù)是基于WA細(xì)胞質(zhì)應(yīng)用的基礎(chǔ)上的。在本專利中，我們描述了對(duì)于含有WA細(xì)胞質(zhì)水稻品系特有的DNA序列的識(shí)別確認(rèn)，而且這是和水稻線粒體DNA高度同源的，基于這個(gè)DNA序列的對(duì)寡聚核苷酸引物特異的序列已被研究開發(fā)，它能被用于PCR檢測(cè)中可靠地區(qū)分含有WA細(xì)胞質(zhì)水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和它的同族的保持系。困此這些引物能被雜種種子培育者/種子公司利用去檢測(cè)在CMS系中保持系的雜質(zhì)，通過(guò)確保CMS系的純度，一個(gè)主要的雜種種子污染源被除去，對(duì)種子工業(yè)和農(nóng)場(chǎng)主產(chǎn)生了明顯的利益。
附圖的簡(jiǎn)要描述圖1是雜交水稻生產(chǎn)的三系系統(tǒng)；該圖是在三系系統(tǒng)中，一個(gè)雜種如何被生產(chǎn)出來(lái)的示意圖。細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)系(花粉不育的)做為雌性親本在和作為雄性親本的保持系(花粉可育的)的雜交中起作用。除了在CMS系中花粉不育外，CMS和保持系是等同細(xì)胞核的。因此，保持系對(duì)于CMS系的繁育是非常必要的。一旦CMS系被獲得，它就和一個(gè)恢復(fù)系雜交，該恢復(fù)系擁有大量的我們想要的農(nóng)藝學(xué)上的特性，且能恢復(fù)后代的可育性。因此通過(guò)這樣雜交產(chǎn)生的雜種是可育的。
圖2為對(duì)水稻CMS系特異的一個(gè)DNA序列的PCR擴(kuò)增；PCR就如實(shí)施例3描述的用微衛(wèi)星引物RM9(SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7)進(jìn)行的。PCR產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，用EB(溴乙錠)染色，在紫外燈下可見。第一泳道含有DNA分子量標(biāo)記[λDNA用HindIII酶切消化(NEW England Biolabs，USA)]；第二泳道是含有保持系的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(IR 62829B)；第三泳道是雜種(DRR H1)，第四泳道是CMS系(IR 62829A)，一個(gè)多余的DNA條帶僅在雜種和CMS系中出現(xiàn)，在保持系中未出現(xiàn)的用一個(gè)黑色的箭頭在膠的右角標(biāo)明了。
圖3為一個(gè)水稻CMS系特異的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)；用微衛(wèi)星引物RM9對(duì)一個(gè)CMS特異的DNA條帶進(jìn)行確定，而且其如實(shí)施例4所描述的一樣被純化。該DNA條帶用一個(gè)自動(dòng)的DNA測(cè)序儀測(cè)序(ABI 3700；ABI，F(xiàn)oster city，USA)。這個(gè)序列由325堿基對(duì)組成，同源查詢表明它同水稻線粒體DNA有高度的同源性，DBJ登記號(hào)#D21251，除了從1-36位置的堿基有一點(diǎn)(不同)外，PCR引物是基于這個(gè)序列信息被設(shè)計(jì)的，僅在CMS系中獲得了擴(kuò)增。正向引物是基于對(duì)水稻線粒體DNA(從位置1-36)沒有呈現(xiàn)同源性的區(qū)域基礎(chǔ)上的，反向引物是基于線粒體DNA序列基礎(chǔ)上的。
圖4為CMS特異DNA序列和水稻線粒體DNA的同源性(SEQ.ID.NO.2)；通過(guò)測(cè)序獲得的DNA序列的信息如實(shí)施例4描述的一樣和水稻線粒體DNA進(jìn)行比較，DBJ登記號(hào)#D21251，用Boxshade服務(wù)器，在http//www.ch.embnet.org/software/Box-form.html.上可用。
圖5為區(qū)分水稻CMS和保持系的一個(gè)PCR檢測(cè)；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上被分離，用EB(溴乙錠)染色，在紫外燈下可見。第一泳道為1kb(千對(duì)堿基)的DNA標(biāo)記；第二泳道含有IR58025A(CMS)；第三泳道，DRR H2(雜種)；第四泳道，IR 58025B(保持系)；第五泳道，IR 62829A(CMS)；第六泳道，DRR H1(雜種)；第七泳道，IR 62829B(保持系)。三個(gè)其它組的CMS-保持系被分析；而且在所有情況下，觀察到擴(kuò)增僅在CMS系中，而未觀察到雜種在保持系中。
圖6為用CMS特異的DNA序列做為探針在水稻CMS和保持系間進(jìn)行限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)的檢測(cè)；從IR 58025 A(CMS)和IR 58025 B(保持系)分離的基因組DNA用EcoR V限制性酶消化在瓊脂糖凝膠上過(guò)夜分離。用CMS特異的DNA序列作為探針如在實(shí)施例7中所描述的進(jìn)行Southern雜交。這個(gè)探針雜交上一個(gè)2.3kb的在IR 58025 A(CMS)系的區(qū)域，而在IR 58025 B(保持系)，其與一個(gè)0.6kb的區(qū)域雜交。
圖7是為了區(qū)分水稻的CMS系和保持系而進(jìn)行的一個(gè)多重PCR檢測(cè)；第一泳道是DNA分子量標(biāo)記[λDNA用Hind III消化(NEW EnglandBiolabs，USA)]；第二泳道是IR 58025A(CMS)；第三泳道是IR 58025B(保持系)，在第二、三泳道中樣品是通過(guò)SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5單獨(dú)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；第四泳道是IR 58025 A(CMS)；第五泳道，IR 58025B(保持系)，第四、五泳道中樣品是通過(guò)多重SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ.ID NO.8和SEQ.ID No.9擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。單態(tài)性片段是SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9的PCR產(chǎn)物，多態(tài)性片段是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的PCR產(chǎn)物。
圖8為測(cè)定水稻雜種純度的PCR檢測(cè)；第一泳道是一條1kb DNA分子量標(biāo)記，用引物對(duì)RM164微衛(wèi)星基因座進(jìn)行的PCR擴(kuò)增；第二泳道是IR 40750(恢復(fù)系)；第三泳道是DRR H1(雜種)；第四泳道是IR 62829A(CMS)。注意，一個(gè)單一的多態(tài)PCR擴(kuò)增的片段在第二、四泳道中被觀察到。雜種顯示了由雙親提供的具有特征性的等位基因的兩個(gè)DNA片段。第5-12泳道代表了確定來(lái)源于DRR H1雜種原種中種子純度而進(jìn)行的一個(gè)PCR檢測(cè)。兩條帶的出現(xiàn)表明了第5、6、8、9、10、11和13電泳泳道代表真正的雜種，單一條帶的出現(xiàn)表明被7、12帶代表的植物是雜質(zhì)(非正常型的)。
簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明提供了和水稻線粒體DNA有極大同源性的一個(gè)DNA序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3)，這里提到的序列對(duì)于含有水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育的野生敗育細(xì)胞質(zhì)(WA)是特有的。本發(fā)明提供了基于這個(gè)序列在PCR檢測(cè)中用于區(qū)分水稻的雄性不育系(CMS)和與它同源的雄性可育的保持系基礎(chǔ)上的寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5)的寡聚核苷酸引物。
在另一個(gè)具體體現(xiàn)中，本發(fā)明提供了基于DNA序列在PCR檢測(cè)中用于區(qū)分水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(CMS)和它同源的雄性保持系的基礎(chǔ)上的應(yīng)用寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于DNA序列在PCR檢測(cè)中用于區(qū)分水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(CMS)和它同源的雄性保持系的基礎(chǔ)上的應(yīng)用含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法。這里所說(shuō)的雄性不育系含有WA(野生敗育)細(xì)胞質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于DNA序列在PCR檢測(cè)中用于區(qū)分水稻W(wǎng)A細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(CMS)和它同源的雄性保持系的基礎(chǔ)上的應(yīng)用含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法。在這里如果模板DNA來(lái)源于CMS系則DNA擴(kuò)增產(chǎn)物是可得到的，如果模板DNA來(lái)源于同源的雄性可育的保持系則DNA擴(kuò)增產(chǎn)物不可得到。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于這個(gè)DNA序列在PCR檢測(cè)中用于水稻W(wǎng)A細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(CMS)和與它同源的雄性可育的保持系基礎(chǔ)上的含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法，在這里PCR擴(kuò)增片段的檢測(cè)是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和隨后的EBC(溴乙錠)染色。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于這個(gè)DNA序列在PCR檢測(cè)中用于區(qū)分水稻的WA細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(CMS)和與它同源的雄性可育的保持系基礎(chǔ)上的含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法，在這里PCR擴(kuò)增片段的檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)被結(jié)合進(jìn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的放射性標(biāo)記的核苷酸來(lái)完成的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于這個(gè)DNA序列在PCR檢測(cè)中用于區(qū)分水稻的WA細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(CMS)和與它同源的雄性可育的保持系基礎(chǔ)上的含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法，在這里非放射性標(biāo)記的核苷酸被結(jié)合進(jìn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，而且它的檢測(cè)是通過(guò)比色法、化學(xué)發(fā)光法、或熒光測(cè)量法進(jìn)行的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于DNA序列在PCR-ELISA(酶連免疫吸附檢測(cè))設(shè)計(jì)反應(yīng)用于區(qū)分水稻的WA細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和它同源的可育保持系的方法。所述PCR-ELISA設(shè)計(jì)反應(yīng)可能包括(a)一個(gè)被標(biāo)記的捕獲探針或一個(gè)被標(biāo)記的PCR引物的應(yīng)用，它們能對(duì)適當(dāng)?shù)挠删郾揭蚁⒈揭蚁?、玻璃等組成的包被固體表面起作用；(b)在PCR中非放射性標(biāo)記的[標(biāo)簽為地高辛DIG(digoxigen)、熒光素等]核苷酸和隨后用抗-DIG或抗熒光素的抗體進(jìn)行檢測(cè)，這些抗體被共價(jià)連到用于ELISA的酶上，這些酶包括辣屋過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等。對(duì)于PCR-ELISA設(shè)計(jì)反應(yīng)的修改包括對(duì)標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段的可替代的方法及探針吸附到固體表面的檢測(cè)方法等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于這個(gè)DNA序列在PCR檢測(cè)中用于區(qū)分水稻W(wǎng)A細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和它們同源的雄性可育的保持系基礎(chǔ)上的含又SEQ ID NO.4和SED ID NO.5引物的方法。在這里的檢測(cè)方法是基于是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer)(FRET)的應(yīng)用基礎(chǔ)上的，而FRET基于包括Taqman、Beacon分子等的檢測(cè)系統(tǒng)基礎(chǔ)上，這對(duì)于精通這個(gè)領(lǐng)域的人是熟悉的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于這個(gè)DNA序列基礎(chǔ)上，用第一對(duì)含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的多重PCR檢測(cè)的方法，其與第二對(duì)寡聚核苷酸引物配合。在這里只要模板DNA是從WA細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中而不是雄性保持系中被獲得，用第一對(duì)引物就可以獲得DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。而且，無(wú)論模板DNA是來(lái)源于一個(gè)CMS系還是一個(gè)雄性不育保持系，用第二套引物都能獲得另一個(gè)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第二對(duì)寡聚核苷酸引物能從第一對(duì)引物的靶區(qū)域以外的水稻基因組的任何序列部分衍生而來(lái)，另一個(gè)需要考慮的是即使當(dāng)兩對(duì)引物被包含在同樣的PCR的混合物中，各個(gè)靶DNA序列的成功的擴(kuò)增應(yīng)該出現(xiàn)。屬于這個(gè)第二套的幾個(gè)寡聚核苷酸引物對(duì)和第一套寡聚核苷酸引物對(duì)在PCR檢測(cè)中能夠被成功的進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在Southern雜交檢測(cè)中用CMS特異的DNA序列區(qū)分水稻的WA細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和它的同族的雄性保持系的方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估在水稻的細(xì)胞質(zhì)雄性不育的繁育期間，用劣種的花粉供體(即水稻的品系不是指定的保持系)和作為結(jié)果出現(xiàn)的遺傳上有雜質(zhì)的種子遠(yuǎn)源雜交程度。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從單一苗中分離DNA的方法。進(jìn)行PCR分析，通過(guò)在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)基因型進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)通過(guò)EB(溴乙錠)染色，銀染進(jìn)行或如果一個(gè)放射性的標(biāo)簽或一個(gè)非放射性的熒光標(biāo)簽被結(jié)合進(jìn)PCR的擴(kuò)增的產(chǎn)物中可適用的檢測(cè)方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估在水稻的細(xì)胞質(zhì)雄性不育的繁育期間，用劣種的花粉供體(即水稻的品系不是指定的保持系)和作為結(jié)果出現(xiàn)的遺傳上有雜質(zhì)的種子遠(yuǎn)源雜交程度的方法。在這里的DNA是從一個(gè)群體的苗中被分離的(在這個(gè)群體中具有代表性的個(gè)體數(shù)可能是100)，這些苗是通過(guò)CMS原種種子發(fā)芽而獲得的。進(jìn)行PCR的分析，而且通過(guò)估計(jì)在被評(píng)估位置群體中等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度。估計(jì)在群體中等位基因頻率的方法包括通過(guò)凝膠電泳使帶有熒光標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增片段的分離，以及同特定的等位基因相應(yīng)的峰高的評(píng)估。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估在任何作物或雜種的生產(chǎn)是遵循三系的具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物的細(xì)胞質(zhì)雄性不育的繁育期間，用劣質(zhì)的花粉供體(即水稻的品系不是指定的保持系)和作為結(jié)果出現(xiàn)的遺傳上有雜質(zhì)的種子遠(yuǎn)源雜交程度的方法。DNA是從單一的苗中分離出來(lái)的。進(jìn)行PCR分析，通過(guò)在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)基因型進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)通過(guò)EB(溴乙錠)染色、銀染進(jìn)行或如果一個(gè)放射性的標(biāo)簽或一個(gè)非放射性的熒光標(biāo)簽被結(jié)合進(jìn)PCR的擴(kuò)增的產(chǎn)物中可適用的檢測(cè)方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估在任何作物或雜種的生產(chǎn)是遵循三系的具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物的細(xì)胞質(zhì)雄性不育的繁育期間，用劣質(zhì)的花粉供體(即水稻的品系不是指定的保持系)和作為結(jié)果出現(xiàn)的遺傳上有雜質(zhì)的種子遠(yuǎn)源雜交程度的方法。DNA是從一個(gè)群體的苗中被分離的(在這個(gè)群體中具有代表性的個(gè)體數(shù)可能是100)。進(jìn)行PCR的分析，而且通過(guò)估計(jì)在被評(píng)估的位置群體中等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度。估計(jì)在群體中等位基因頻率的方法包括通過(guò)凝膠電泳使帶有熒光標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增片段的分離，以及同特定的等位基因相應(yīng)的峰高的評(píng)估。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估水稻雜種的親本系純度的方法。在這里采用了生產(chǎn)雜交水稻的一個(gè)兩系系統(tǒng)。這些親本系包括一個(gè)雌性親本，它具有由溫度、光周期引起不育的及能夠誘導(dǎo)雄性配子致死的化學(xué)試劑處理的條件雄性不育性。DNA是從單一的苗中進(jìn)行分離的。進(jìn)行PCR分析，通過(guò)在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)基因型進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)通過(guò)EB(溴乙錠)染色、銀染進(jìn)行或如果一個(gè)放射性的標(biāo)簽或一個(gè)非放射性的熒光標(biāo)簽被結(jié)合進(jìn)PCR的擴(kuò)增的產(chǎn)物中可適用的檢測(cè)方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估水稻雜種的親本系純度的方法。在這里采用了生產(chǎn)雜交水稻的一個(gè)兩系系統(tǒng)。這些親本系包括一個(gè)雌性親本，它具有由溫度、光周期引起不育的及能夠誘導(dǎo)雄性配子致死的化學(xué)試劑處理的條件雄性不育性。這里要求保護(hù)的是將DNA從一個(gè)群體的苗中分離的方法(在這個(gè)群體中具有代表性的個(gè)體數(shù)可能是100)，這些苗是通過(guò)親本系發(fā)芽的種子被獲得的。進(jìn)行PCR分析，而且通過(guò)估計(jì)在被評(píng)估位置群體中的等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度。估計(jì)在群體中的等位基因頻率的方法包括通過(guò)凝膠電泳使帶有熒光標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增片段的分離，以及同特定的等位基因相應(yīng)的峰高的評(píng)估。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估任何具有經(jīng)濟(jì)重要性的雜種的親本系純度的方法。在這里采用了雜交生產(chǎn)的一個(gè)兩系系統(tǒng)。這些親本系包括一個(gè)雌性親本，它具有由溫度、光周期引起不育的及能夠誘導(dǎo)雄性配子致死的化學(xué)試劑處理的條件雄性不育性。DNA是從單一的苗中進(jìn)行分離的。進(jìn)行PCR分析，通過(guò)在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)基因型進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)通過(guò)EB(溴乙錠)染色、銀染進(jìn)行或如果一個(gè)放射性的標(biāo)簽或一個(gè)非放射性的熒光標(biāo)簽被結(jié)合進(jìn)PCR的擴(kuò)增的產(chǎn)物中可適用的檢測(cè)方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估任何具有經(jīng)濟(jì)重要性的雜種的親本系純度的方法。在這里采用了雜交生產(chǎn)的一個(gè)兩系系統(tǒng)。這些親本系包括一個(gè)雌性親本，它具有由溫度、光周期引起不育的及能夠誘導(dǎo)雄性配子致死的化學(xué)試劑處理的條件雄性不育性。這里要求保護(hù)的是DNA是從一個(gè)群體的苗中被分離的方法(在這個(gè)群體中具有代表性的個(gè)體數(shù)可能是100)，這些苗是通過(guò)親本系發(fā)芽的種子被獲得的。進(jìn)行PCR分析，而且通過(guò)估計(jì)在被評(píng)估位置群體中等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度。估計(jì)在群體中等位基因頻率的方法包括通過(guò)凝膠電泳使帶有熒光標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增片段的分離，以及同特定的等位基因相應(yīng)的峰高的評(píng)估。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)水稻的種子或苗及一個(gè)三系或二系的系統(tǒng)被應(yīng)用于雜種的生產(chǎn)時(shí)，在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估雜種純度的方法。DNA是從單一的苗中進(jìn)行分離的。進(jìn)行PCR分析，通過(guò)在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)基因型進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)通過(guò)EB(溴乙錠)染色、銀染進(jìn)行或如果一個(gè)放射性的標(biāo)簽或一個(gè)非放射性的熒光標(biāo)簽被結(jié)合進(jìn)PCR的擴(kuò)增的產(chǎn)物中可適用的檢測(cè)方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)水稻的種子或苗及一個(gè)三系或二系的系統(tǒng)被應(yīng)用于雜種的生產(chǎn)時(shí)，在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估雜種純度的方法。DNA是從一個(gè)群體的苗中被分離的(在這個(gè)群體中具有代表性的個(gè)體數(shù)可能是100)，這些苗是通過(guò)雜種原種發(fā)芽的種子被獲得的。進(jìn)行PCR分析，而且通過(guò)估計(jì)在被評(píng)估位置群體中等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度。估計(jì)在群體中等位基因頻率的方法包括通過(guò)凝膠電泳使帶有熒光標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增片段的分離，以及同特定的等位基因相應(yīng)的峰高的評(píng)估。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)任何作物或有經(jīng)濟(jì)價(jià)值植物的種子或苗及一個(gè)三系或二系的系統(tǒng)被應(yīng)用于雜種的生產(chǎn)時(shí)，在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估雜種純度的方法。DNA是從單一的苗中進(jìn)行分離的。進(jìn)行PCR分析，通過(guò)在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)基因型進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)通過(guò)EB(溴乙錠)染色、銀染進(jìn)行或如果一個(gè)放射性的標(biāo)簽或一個(gè)非放射性的熒光標(biāo)簽被結(jié)合進(jìn)PCR的擴(kuò)增的產(chǎn)物中可適用的檢測(cè)方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了當(dāng)任何作物或有經(jīng)濟(jì)價(jià)值植物的種子或苗及一個(gè)三系或二系的系統(tǒng)被應(yīng)用于雜種的生產(chǎn)時(shí)，在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估雜種純度的方法。DNA是從一個(gè)群體的苗中被分離的(在這個(gè)群體中具有代表性的個(gè)體可能是400)，這些苗是通過(guò)雜種原種發(fā)芽的種子被獲得的。進(jìn)行PCR分析，而且通過(guò)估計(jì)在被評(píng)估位置群體中等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度。估計(jì)在群體中等位基因頻率的方法包括通過(guò)凝膠電泳使帶有熒光標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增片段的分離，以及同特定的等位基因相應(yīng)的峰高的評(píng)估。
為詳細(xì)描述本發(fā)明，最初，PCR檢測(cè)是在單獨(dú)從構(gòu)成CMS(WA細(xì)胞質(zhì))的一套水稻品系中分離的DNA模板上進(jìn)行的。保持品種和相應(yīng)的雜種用寡聚核苷酸引物擴(kuò)增RM9水稻微衛(wèi)星位置(McCouch等，1996.Rice GeneticsIII，Proc.Third Intl.Rice Genet.Symp.Los Banos馬尼拉，菲律賓16-20Oct.1995.國(guó)際水稻研究院，馬尼拉，菲律賓).PCR擴(kuò)增片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，而且通過(guò)溴乙錠(EB)染色進(jìn)行檢測(cè)。就象對(duì)PCR檢測(cè)所期望的一樣，RM9位點(diǎn)被檢測(cè)到，利用來(lái)源于所有三系的模板DNA，一個(gè)大約250bp的PCR擴(kuò)增片段被觀察到(圖2)。除此之外，僅模板DNA從CMS系或雜種中獲得時(shí)，一個(gè)大約350bp的PCR擴(kuò)增片段才能在此反應(yīng)中被觀察到(圖2)。然而，這個(gè)片段的PCR擴(kuò)增被發(fā)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)條件是高度敏感的，即使模板DNA從CMS系或雜種中獲得時(shí)，也常常觀察不到它。這表明引向RM9微衛(wèi)星位置的引物不能可靠地被用于區(qū)分CMS系和保持系。我們認(rèn)為這種重復(fù)性的缺乏出現(xiàn)是由于在RM9引物和含有CMS細(xì)胞質(zhì)的品系的靶序列中不能完好地配對(duì)。
隨后，在圖2中表明的CMS系特異的PCR擴(kuò)增的片段(大小為325bp)被純化，而且通過(guò)應(yīng)用來(lái)源于RM9位置的正向和反向的寡聚核苷酸引物在DNA自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行核苷酸序列的確定。被確定的PCR核苷酸序列如圖3所示。
用BLAST計(jì)算程序通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(Bethesda，Maryland，USA)的網(wǎng)點(diǎn)，在GenBank DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源DNA序列的查詢[Altschul等，1997.核酸研究(Nucleic Acid Res.)253389-3402]。所述DNA序列同數(shù)據(jù)庫(kù)中的特定的記載[登記號(hào)#D21251；日本的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DBJ)，在這作為一個(gè)參考]是高度同源的。這個(gè)記載來(lái)源于基因組區(qū)域的水稻(Oryza sativa)線粒體的一個(gè)序列，其編碼核糖體蛋白S3、L16、S12及NADH脫氫酶的亞單位3。這里所說(shuō)的DNA序列同水稻線粒體DNA同源的程度如圖4所描述的。很清楚，除了在登記號(hào)#D21251所描述的水稻線粒體DNA缺乏的一段DNA序列[同核苷酸序列ACGGCCCTCATCACCTTCTTTCACTTTTTGTTTTTG(SEQ ID No.3)相應(yīng)的]外，區(qū)域是高度同源性的。
被用在PCR檢測(cè)中區(qū)分水稻CMS(WA)和保持系的一對(duì)寡聚核苷酸引物是以這個(gè)序列為基礎(chǔ)被設(shè)計(jì)的(表2在描述的末尾進(jìn)行了表明)。其中一個(gè)引物(正向引物)是以對(duì)CMS系(圖3)特異的序列為基礎(chǔ)的，而另一個(gè)引物(反向引物)是基于核糖體蛋白S3基因的基因組的上游區(qū)域的水稻的線粒體DNA，其位于核苷酸#s1362和1384之間，如DBJ登記號(hào)#D21251所表明的，寡聚核苷酸引物[正向引物5’-ACTTTTTGTTTTTGTGTAGG-3’(SEQ ID No.4)；反向引物5’-TGCCATATGTCGCTTAGACTTTAC-3’(SEQ ID No.5)]被用在以來(lái)源于水稻CMS系和保持系的模板DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，這些模板DNA被列在表1中(如描述的末尾所示)。
當(dāng)模板DNA是從CMS系(IR 58025 A，IR 62829 A，PMS 8 A，PMS 10A，78897 A)分離的，利用引物SEQ ID No.4和SEQ ID No.5作為引物，可獲得一個(gè)PCR擴(kuò)增的325bp的產(chǎn)物(圖5)，而當(dāng)模板DNA來(lái)源是保持系時(shí)(IR 58025 B，IR 62829 B，PMS 8 B，PMS 10 B，78897 B)卻不能得到。在這個(gè)測(cè)試的進(jìn)一步的證據(jù)中，一個(gè)編碼實(shí)驗(yàn)在從35種不同的水稻植物中提取的基因組DNA中進(jìn)行的，它們中有15種是CMS系的IR 58025A，20種是保持系的IR 58025 B。在不了解這35種植物那些是CMS系，那些是保持系的情況下，進(jìn)行PCR檢測(cè)。這個(gè)檢測(cè)被精確地用于預(yù)測(cè)35種不同植物的每個(gè)基因型，表明了PCR檢測(cè)作為區(qū)分水稻CMS和保持系方法的可應(yīng)用性。
這里所說(shuō)的CMS特異的PCR擴(kuò)增片段是用α32p-dATP放射標(biāo)記的。從同族的成對(duì)的CMS(IR 58025 A和IR62829 A)和保持系(IR 58025 B和IR62829 B)被分離的基因組DNA用不同的限制酶消化，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離，和放射性標(biāo)記的探針雜交(如Sambrook等，1989，ColdSpring Harbor，NY，USA)。圖6表明在水稻CMS(WA)系和保持系間的一個(gè)限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)形，它通過(guò)用探針及EcoR V限制性酶被檢測(cè)到的。用上述提到的探針-酶聯(lián)合對(duì)來(lái)源于水稻CMS和保持系的線粒體DNA的純化及RFLP分析揭示了同那個(gè)可檢測(cè)在線粒體DNA中多態(tài)性相似的一個(gè)多態(tài)性的證實(shí)。
多重PCR檢測(cè)被發(fā)展用以區(qū)分水稻的CMS和保持系。在這個(gè)檢測(cè)中，用在上面提到的PCR檢測(cè)中的第一套寡聚核苷酸引物和屬于第二套寡聚核苷酸引物進(jìn)行多重復(fù)合。這個(gè)第二套寡聚核苷酸引物或是以從正在進(jìn)行的國(guó)際水稻基因組計(jì)劃(公共可用的就象在GenBank登記號(hào)#AP001859，在這里引入作為參考)的一部分獲得的水稻的染色體I上的一段序列為基礎(chǔ)的，或在DBJ中登記號(hào)為#D21251可用的水稻線粒體DNA序列為基礎(chǔ)的。第二套引物被這樣設(shè)計(jì)，因此屬于第二套中的任一引物對(duì)都可被加到含有屬于第一套寡聚核苷酸引物的引物的PCR檢測(cè)的混合物中，而不會(huì)影響通過(guò)第一套寡聚核苷酸引物擴(kuò)增CMS特異的DNA片段。在這個(gè)多重PCR檢測(cè)中，無(wú)論模板DNA是來(lái)源于一個(gè)CMS系還是來(lái)源于一個(gè)保持系(圖7)，第二套寡聚核苷酸引物擴(kuò)增一個(gè)特異的DNA片段。當(dāng)從CMS和保持系中獲得一個(gè)PCR擴(kuò)增的片段時(shí)，第二套引物作為影響PCR結(jié)果的外在的因素(象PCR的抑制劑，模板DNA的質(zhì)量不好等)的對(duì)照。第二套寡聚核苷酸引物，它們?cè)谒净蚪M上的位置及通過(guò)用這些引物擴(kuò)增的DNA片段的大小在表2中被表明了(在描述的末尾所示)。
微衛(wèi)星(也稱單序列重復(fù)或SSRs)是簡(jiǎn)單的，一前一后重復(fù)的二至四-核苷酸序列的基元，它位于一個(gè)獨(dú)特的序列的側(cè)翼。微衛(wèi)星是豐富的，而且很規(guī)則地分散在水稻(McCouch等1997)及其它作物的基因組中(Powell等，1996，Trends Plant Sci.1215-222)。因?yàn)槲⑿l(wèi)星是共顯性的，可以檢測(cè)高水平的等位基因的多樣性，且能通過(guò)PCR進(jìn)行有效的檢測(cè)，所以它作為遺傳標(biāo)記很有價(jià)值。目前通用的被微衛(wèi)星提供的水稻中基因組寬度的覆蓋水平為每6cM一個(gè)(Temnykh等，2000.Theor.App.Genet.100697-712)對(duì)于評(píng)估雜種純度和基因型的確定是充分有用的。同微衛(wèi)星相似的是STS，一個(gè)STS是一段短的DNA序列，它可以通過(guò)PCR進(jìn)行檢測(cè)，而且在基因組中可以作為一個(gè)地標(biāo)對(duì)特定的位點(diǎn)做圖譜。在水稻中作圖譜的一些STSs是多態(tài)的(Ghareyazie等，1995.Theor.Appl.Genet.91218-227；Robenoil等，1996.Inkhush，G.S.(ed)Rice Genetics III，Proc.Third Intl，Rice Genet，Symp，Los Banos馬尼拉，菲律賓，16-20Oct.1995.國(guó)際水稻研究院，馬尼拉，菲律賓)。
水稻CMS系的繁育規(guī)定最小的隔離距離是300米[Virmani，1993.雜交水稻在農(nóng)藝學(xué)方面的進(jìn)展(Hybrid Rice Advances in Agronomy)57377-462]，也就是在這個(gè)隔離距離內(nèi)除了保持系的水稻以外，沒有水稻系應(yīng)被培育。這是基于來(lái)源于這個(gè)距離以外的正在生長(zhǎng)的水稻的植株的花粉不能傳粉給CMS系的觀察的基礎(chǔ)上的。在偶然的情況下，這個(gè)最小的隔離距離或是由于沒有被嚴(yán)格的遵守或是由于當(dāng)?shù)氐臈l件(象風(fēng)流和天氣)有可能允許花粉被轉(zhuǎn)移到300米以外的正在生長(zhǎng)的植物上。
CMS系同來(lái)源于生長(zhǎng)在大田附近的水稻品系(保持系除外)的劣質(zhì)花粉的雜交授粉的程度，可以通過(guò)微衛(wèi)星和STS標(biāo)記進(jìn)行評(píng)估，這兩種方法在這些水稻品系和CMS系間具有多態(tài)性。這些多態(tài)性的標(biāo)記可用來(lái)源于有潛在的生產(chǎn)能力的供體系(一個(gè)具有代表性的情況是1-3個(gè)系)和CMS系中的任一個(gè)的模板DNA通過(guò)PCR、瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色鑒定。一個(gè)優(yōu)選標(biāo)記是一個(gè)能夠檢測(cè)來(lái)源于這些劣質(zhì)系任一個(gè)的雜交授粉。來(lái)源于雜交授粉的植物在雜合性存在的情況下將用這樣的標(biāo)記檢測(cè)[即在兩個(gè)大小不同的DNA片段存在的情況下，這兩個(gè)片段中的一個(gè)是被雌性(CMS)親本提供的，而另一個(gè)是由雄性的親本提供的(劣質(zhì)花粉供體)]。和這種情況形成對(duì)照的是，如果授粉象我們希望的那樣出現(xiàn)，且花粉來(lái)源于保持系，那么純合子(以單個(gè)的DNA片段存在的)將在后代中被觀察到，這是因?yàn)镃MS和保持系相互是等同細(xì)胞核的，意味著除了細(xì)胞核DNA標(biāo)記外，它們?cè)趯?shí)質(zhì)上是完全相同的。DNA分離、PCR及瓊脂糖凝膠電泳的程序如實(shí)施例9所描述的一樣。
這種檢測(cè)的修改方法也在實(shí)施例9中被描述了，其中的DNA是從屬于CMS原種的苗(從100或更多的種子庫(kù)中獲得的)的群體中獲得的葉片中分離的。用于檢測(cè)多態(tài)性標(biāo)記的引物中的一個(gè)在5’末端用象熒光素、若丹明、和其它的這樣的染料染色標(biāo)記，它們可以用象ABI 377 DNA測(cè)序儀的基因描掃設(shè)備或?qū)@個(gè)領(lǐng)域熟悉的人來(lái)講所知道的其它相似的儀器，隨后的PCR或電泳被檢測(cè)到。通過(guò)這種檢測(cè)，雜交授粉的程度可以通過(guò)測(cè)量每個(gè)峰的高度進(jìn)行檢測(cè)(每個(gè)峰的具有一個(gè)等位基因特性)，就象通過(guò)儀器進(jìn)行檢測(cè)一樣。如果僅有一個(gè)峰被檢測(cè)到(相對(duì)應(yīng)于一個(gè)等位基因)，那么CMS種子的樣品能被認(rèn)為是100％純的。通過(guò)在樣品中出現(xiàn)多個(gè)等位基因(峰)，檢測(cè)雜質(zhì)。雜質(zhì)的峰高(被劣質(zhì)種子供體提供給群體的等位基因)和期望峰高(具有CMS系特性的等位基因)的比率表明了曾出現(xiàn)在隨后的用劣種花粉供體的雜交授粉的CMS原種中的種子的頻率。
盡管本申請(qǐng)如前面所表明的一樣是用于評(píng)估出現(xiàn)在水稻CMS系的繁育期間的遠(yuǎn)源雜交的程度的，一個(gè)相似的方法能被用于評(píng)估出現(xiàn)在其它作物CMS系的繁育期間的遠(yuǎn)源雜交的程度，這些作物非限制性包括玉米、珍珠谷子、高梁、麥子、太陽(yáng)花、芥子、卷心菜、花椰菜、西紅柿、胡椒、秋葵等。在這里，CMS系用于雜種的生產(chǎn)，而且適當(dāng)?shù)奈⑿l(wèi)星或STS標(biāo)記是可用的。
種子純度的評(píng)估是雜交水稻程序的一項(xiàng)重要質(zhì)量控制成分。在傳統(tǒng)上這是通過(guò)生長(zhǎng)測(cè)試(GOT)完成的，它(GOT)是基于在生長(zhǎng)到成熟(Ref)的植物上的形態(tài)的或花的特性的評(píng)估的基礎(chǔ)上的。對(duì)于種子工業(yè)來(lái)講，大量資金因?yàn)檠娱L(zhǎng)的周期以貯存的雜種種子形式被擱死，同時(shí)等待著GOT的結(jié)果。以檢測(cè)基礎(chǔ)上的DNA取代GOT為目標(biāo)，用微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)多態(tài)性，水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)、恢復(fù)和雜交系被篩選以用于區(qū)分。這些共顯性多態(tài)性在PCR、瓊脂糖凝膠電泳、溴乙淀染色后被鑒定。這個(gè)方法的原理是雜種將是雜合的(即兩個(gè)親本的等位基因?qū)⒃陔s種中出現(xiàn))，當(dāng)用在親本系間具有多態(tài)性的微衛(wèi)星或STS標(biāo)記評(píng)估基因型時(shí)(即檢測(cè)在兩個(gè)親本上的一個(gè)不同的等位基因)，用3天齡的水稻苗進(jìn)行DNA分離、檢測(cè)雜合性及純度的一個(gè)簡(jiǎn)單程序已被標(biāo)準(zhǔn)化(如下所描述)，而且已被用于在雜種種子組中雜質(zhì)的檢測(cè)(實(shí)施例10)。盡管多重多態(tài)性的標(biāo)記能被用于(或是單獨(dú)地或是多重地)評(píng)估種子純度，但是考慮到花費(fèi)上的原因，建議一個(gè)單一的適當(dāng)選擇的微衛(wèi)星標(biāo)記足以評(píng)估雜種種子純度。
這個(gè)檢測(cè)的一個(gè)修改也是在實(shí)施例10中被描述，其中DNA是從屬于雜種種子原種的400棵小苗(從400粒種子庫(kù)中獲得的)群體的葉片中被分離的用于檢測(cè)多態(tài)性標(biāo)記物中一個(gè)在5’末端用象熒光素、若丹明和其它染料這樣的熒光標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，這些熒光標(biāo)簽標(biāo)記可用象ABI 377 DNA測(cè)序儀的基因掃描設(shè)備的儀器或熟悉這個(gè)領(lǐng)域的人所知道的其它儀器在隨后的PCR和電泳在被檢測(cè)到。通過(guò)這個(gè)檢測(cè)，純度可以通過(guò)測(cè)量期望的兩個(gè)峰中每一個(gè)高度檢測(cè)，這兩個(gè)峰(每個(gè)峰代表被一個(gè)親本提供的等位基因)具有可通過(guò)儀器檢測(cè)的雜種特性。在PCR檢測(cè)中，用從一個(gè)單一雜種植物中分離的基因組DNA做一個(gè)模板，峰高被期望是相等的，產(chǎn)生了1∶1的比率(或50∶50)。在PCR檢測(cè)中，用從400株苗的群體中分離的基因組DNA作為一個(gè)模板，任何兩個(gè)峰高度的1∶1的比率(50∶50)的偏離都將是在雜種種子原種中雜質(zhì)程度的指標(biāo)。峰高比率為1.02∶0.98(51∶49)將和一個(gè)98％純度的雜種種子原種的樣品對(duì)應(yīng)，峰高比率為1.1∶0.9(55∶45)將和一個(gè)90％純度的雜種種子原種的樣品對(duì)應(yīng)。
用于評(píng)估雜種種子純度的方法在認(rèn)真考慮后應(yīng)被仔細(xì)地篩選。生長(zhǎng)在鄰近大田的品種作為一個(gè)有潛在生產(chǎn)能力花粉供體或在CMS系繁育期間(在這里僅保持系應(yīng)是一個(gè)花粉供體)或在雜種生產(chǎn)期間(在這里僅恢復(fù)系應(yīng)是一個(gè)花粉受體)起作用。如果授粉是通過(guò)劣種花粉供體進(jìn)行的(即既不是保持系也不是恢復(fù)系的品系被發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)的情況下)，而且那個(gè)劣種供體對(duì)應(yīng)于所選擇的微衛(wèi)星或STS標(biāo)記在CMS系是中具有多態(tài)性，那么雜合性即使在我們想要的雜種不存在的情況下也可以被觀察到，因此，篩選用于評(píng)估雜種純度的標(biāo)記應(yīng)在CMS系和有潛在生產(chǎn)能力的花粉供體之間是單態(tài)性的，而不應(yīng)在CMS系和恢復(fù)系之間有多態(tài)性。那么我們期望的雜合性的檢測(cè)將是雜種種子生產(chǎn)的一個(gè)指標(biāo)。這些特異的標(biāo)記在用或微衛(wèi)星或STS標(biāo)記于CMS，恢復(fù)系和有潛在生產(chǎn)能力的劣種的供體系中所進(jìn)行的多態(tài)性測(cè)量中被鑒定。對(duì)于以前熟知這一個(gè)領(lǐng)域的人說(shuō)，這些多態(tài)性標(biāo)記的檢測(cè)并不困難，因?yàn)槟壳坝写罅康奈⑿l(wèi)星標(biāo)記對(duì)水稻是適用的(Temnykh等，2000)。
DNA標(biāo)記檢測(cè)從速度和準(zhǔn)確度角度來(lái)講優(yōu)于GOT，而且它的應(yīng)用在種子工業(yè)上將引起相當(dāng)大的節(jié)省。盡管這個(gè)方法被標(biāo)準(zhǔn)化了，用于評(píng)估如圖1所描述的那種類型的通過(guò)三系培育系統(tǒng)生產(chǎn)水稻雜種的純度，它也可用于評(píng)估通過(guò)兩系培育系統(tǒng)獲得的水稻雜種的純度。在這個(gè)兩系培育系統(tǒng)中，一個(gè)條件型的雄性不育系通過(guò)生長(zhǎng)在誘導(dǎo)雄性不育的條件下，被用做雜種生產(chǎn)的雌性親本。當(dāng)生長(zhǎng)在不會(huì)誘導(dǎo)雄性不育的條件下，該系可通過(guò)自我授粉繁殖。因此，可以避免對(duì)細(xì)胞質(zhì)雄性不育和保持系的需要。兩系培育系統(tǒng)總的說(shuō)來(lái)處于實(shí)驗(yàn)階段(除了在中國(guó)有一個(gè)小的規(guī)模)，然而，即使對(duì)于雜種種子生產(chǎn)的兩系系統(tǒng)，評(píng)估雜種種子純度的方法也將和三系培育系統(tǒng)所描述的那樣是相同的。在這種情況下，區(qū)分雌、雄性親本(而不是CMS和恢復(fù)系)的微衛(wèi)星和STS多態(tài)性將象前述的一樣被鑒定及應(yīng)用。
盡管這個(gè)方法是用于評(píng)估水稻雜種的純度的標(biāo)準(zhǔn)化的方法，它也能被用于評(píng)估任何其它作物中雜種的純度，這些作物非限制性包括玉米、珍珠谷子、高梁、麥子、太陽(yáng)花、芥子、卷心菜、花郁菜、西紅柿、胡椒、秋葵等，對(duì)于它們合適的微衛(wèi)星和STS標(biāo)記也是可用的。人們期望這個(gè)檢測(cè)方法(或由此所做的修改對(duì)于熟知這一領(lǐng)域的人是明顯的)在雜交種子質(zhì)量控制程序中發(fā)現(xiàn)廣泛的應(yīng)用。用這個(gè)過(guò)程進(jìn)行種子試驗(yàn)的農(nóng)民也將獲利，因?yàn)樗麄冋诘玫揭粋€(gè)適合的真正的產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1從水稻CMS和保持系進(jìn)行基因組DNA的分離水稻基因組DNA的分離用或是被(a)Kochert等(1989)RockefellerProgram on Rice Biotechnology，Cornell Univ.，New York，USA描述的程序或(b)Chunwongse等(1993)Theor.Appl.Genet.86694-698的程序，有稍微改動(dòng)(a)簡(jiǎn)要的，用Kochert等的分離程序如下5-10g來(lái)源于20天齡的溫室中生長(zhǎng)的植物的葉片在一個(gè)液態(tài)氮的研缽和杵中被研磨至到形成一個(gè)均勻的粉末，不要讓粉末解凍。樣品然后被轉(zhuǎn)到抗氯仿的50ml試管中(聚丙醇試管)，試管中含有預(yù)先溫?zé)岬?0℃的25ml提取緩沖液[420g尿素，70ml 5M NaCl，50ml 1M Tris-HCl pH 8.0，80ml 0.25M EDTA，200ml10％SDS 50ml苯酚試劑，用滅過(guò)菌的重蒸水(double distilled water)定容到1L]。用玻璃棒攪拌不要形成任何的塊狀物，加入0.750ml的20％的十二烷基苯磺酸鈉，混合好。這個(gè)混合物在60℃溫育10分鐘，同時(shí)不時(shí)有規(guī)律地上下倒置混勻。冷卻到室溫，加15ml氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻得到一個(gè)乳液。試管被離心而分成水和氯仿相，用吸移管將上層水相移到一個(gè)新鮮的50ml試管中，將2/3體積的異丙醇加到最終的水相中，顛倒混合直到DNA開始聚集。DNA被沉淀析出并轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有70％乙醇的新鮮的試管中。DNA通過(guò)離心而成粒狀沉淀并在倒掉乙醇后于真空干燥器中被吸干。DNA被溶解在TE中(Tris-HCl 10mM pH8.0，EDTA 1mM pH8.0)。
(b)應(yīng)用Chunwongse等(1993)進(jìn)行DNA分離的程序如下種子在培養(yǎng)皿濕潤(rùn)的濾紙上在黑暗中28℃下發(fā)芽。三天齡的苗用一個(gè)杵在一個(gè)1.5ml的含有200μl提取緩沖液的試管中單獨(dú)地被搗碎，此緩沖液由5％W/V chelex-100(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室、美國(guó))在無(wú)菌蒸餾水中組成。組織勻漿在95℃中溫育10分鐘，于12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘。10-15μl上清液被用于每個(gè)PCR反應(yīng)。
實(shí)施例2從水稻CMS和保持系中分離線粒體DNA線粒體DNA根據(jù)Saleh等，(1989)Theor.Appl.Genet.77617-619的程序從CMS和保持系中分離。表面消過(guò)毒的種子在溫室中發(fā)芽生長(zhǎng)14天。這些植物然后在黑暗中被保存3天，以使植株褪色發(fā)白。這一步之后，所有的實(shí)驗(yàn)均在4℃條件下進(jìn)行。收集來(lái)源于14天齡植株的20g葉片并將其切成小片。葉片在一個(gè)100ml緩沖液A的研缽和杵中被勻漿。緩沖液A(10mM TES pH7.2，0.5M甘露糖醇，0.2％BSA，0.05％半胱氨酸。組織勻漿通過(guò)4層的奶酪布過(guò)濾，在5000rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，收集上清液。粒狀沉淀被輕輕重懸浮在30ml的緩沖液A中，再于5000rpm下離心10分鐘?；旌仙锨逡海?2000rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，收集粒狀沉淀。將上清液再一次在12000rpm下離心10分鐘，混合兩次粒狀沉淀。該沉淀在緩沖液A中重懸浮而且于5000rpm下離心10分鐘，收集上清液。1M MgCl2和10mg/ml新配制的Dnase I(在0.15M NaCl和50％甘油中)加到使終濃度為10mM的MgCl2和10μg DNase/g新鮮的葉片組織按時(shí)，4℃溫育1h。一個(gè)蔗糖梯度是用緩沖液B(10mM TES pH7.2，20mM EDTA，0.6M蔗糖)和2ml線粒體懸浮液被加到每個(gè)試管中形成的。于16000rpm下離心10分鐘，粒狀沉淀在4ml緩沖液C(50mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTApH8.0，2％肌氨酰，100μg/ml蛋白酶K)中被重懸浮，并在37℃的水浴搖床(Jolabo，德國(guó))中溫育2小時(shí)，同時(shí)進(jìn)行輕輕攪拌。裂解液用0.2M乙酸銨補(bǔ)足，而且用3個(gè)循環(huán)的苯酚-氯仿抽提進(jìn)行純化。用95％乙醇洗滌沉淀顆粒，再用70％乙醇洗滌。在真空中干燥沉淀顆粒，DNA溶解在TE中，用RNA酶(Rnase A)處理，-20℃下保存。
實(shí)施例3對(duì)水稻CMS系特異的DNA序列的確定所用的引物對(duì)于水稻RM9微衛(wèi)星位置的寡聚核苷酸引物(McCouch等，1996.Rice Genetics III，Proc.Third Intl.Rice Genet.Symp.LosBanos馬尼拉，菲律賓16-20Oct.1995.國(guó)際水稻研究院，馬尼拉，菲律賓)。
正向5’-CAAAAACAGAGCAGATGAC-3’(SEQ ID No.6)反向5’-CTCAAGATGGACGCCAAGA-3’(SEQ ID No.7)引物被Oswel DNA Service，Southamton，U.K合成的。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)條件如McCouch等，[(1996).Rice Genetics III，Proc.ThirdIntl.Rice Genet.Symp.Los Banos馬尼拉，菲律賓16-20Oct.1995.國(guó)際水稻研究院，馬尼拉，菲律賓]的略帶修改的描述。簡(jiǎn)言之，PCR是在含有50-100ng模板DNA，每個(gè)引物5pmol，200μM(每)脫氧核糖核苷酸，50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl2，0.01％明膠和1個(gè)單位的Taq聚合酶的25μl反應(yīng)體系中進(jìn)行的。PCR條件是95℃，7分鐘(為初變性)，接著是94℃下變性1分鐘，55℃下退火1分鐘，72℃下延伸2分鐘這樣三個(gè)重復(fù)步驟組成一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行35個(gè)這樣循環(huán)，最后在72℃下延長(zhǎng)5分鐘。樣品在4℃下貯存，備下一步使用。PCR產(chǎn)物的檢測(cè)是通過(guò)在1％或2％的瓊脂糖凝膠上分離、電泳、溴乙錠染色，以便在紫外燈下可見DNA片段來(lái)進(jìn)行的。
PCR是用一個(gè)保持系、CMS系和同族的雜種進(jìn)行的。除希望的由RM9引物擴(kuò)增DNA片段外，僅在CMS系和雜種中觀察到了一個(gè)額外的條帶，但在保持系中沒有觀察到(圖2)。
實(shí)施例4對(duì)水稻CMS系特異的核苷酸序列的確定用RM9引物，PCR是在含有50-100ng模板DNA，每個(gè)引物5pmol，200μM(每)脫氧核糖核苷酸，50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl2，0.01％明膠和1個(gè)單位的Taq聚合酶的25μl反應(yīng)體系中進(jìn)行的。PCR條件是95℃，7分鐘(為初變性)，接著是94℃下變性1分鐘，55℃下退火1分鐘。72℃下延伸2分鐘這樣三個(gè)重復(fù)步驟組成一個(gè)循環(huán)，共35個(gè)這樣循環(huán)，最后在72℃下延長(zhǎng)5分鐘。在4℃下貯存，備下一步使用。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物被分離在瓊脂糖凝膠上、被溴乙錠染色并且其在紫外燈下可被觀察到。對(duì)CMS系(圖2)特異的大約350bp的DNA序列從凝膠上切下用Qiaquick凝膠提取試劑盒(Qiaquick Gel Extraction Kit)(Qiagen，德國(guó))根據(jù)操作指南進(jìn)行純化，純化后DNA的用自動(dòng)DNA測(cè)序儀ABI 3700(ABI，F(xiàn)oster City，USA)排序，所獲得序列如圖3所示，在GenBank中對(duì)DNA同源性查詢表明(圖4)這個(gè)序列大多數(shù)和水稻線粒體體DNA(DBJ，登記號(hào)#D21251)一個(gè)區(qū)域有同源性。然而，這個(gè)序列有一小部分同水稻線粒體DNA并沒有呈現(xiàn)任何同源性。
實(shí)施例5
用于PCR檢測(cè)區(qū)分水稻CMS和保持系的特異的寡聚核苷酸引物的設(shè)計(jì)PCR引物設(shè)計(jì)是基于用在實(shí)施例4所描述的程序獲得的序列信息基礎(chǔ)上的。一個(gè)引物是以那個(gè)序列的一部分為基礎(chǔ)的，這個(gè)序列對(duì)于CMS系是獨(dú)有的(圖3中1-36的堿基位置)，而另一個(gè)引物是以水稻線粒體DNA序列為基礎(chǔ)的，這個(gè)引物是正向5’-ACTTTTTGTTTTTGTGTAGG-3’(SEQ ID No.4)反向5’-TGCCATATGTCGCTTAGACTTTAC-3’(SEQ ID No.5)實(shí)施例6用于區(qū)分水稻CMS和保持系的PCR檢測(cè)用實(shí)施例6中描述的引物對(duì)，PCR在以CMS和保持系做為模板DNA的25μl反應(yīng)體系中進(jìn)行的。反應(yīng)組成為50-100ng模板DNA、1X PCR緩沖液(50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，0.01％明膠)、200μM(每)脫氧核糖核苷酸(dNTP)、1個(gè)單位的Taq聚合酶、每個(gè)引物5pmol。PCR條件是在95℃下進(jìn)行7分鐘的初變性，接著是94℃下變性30秒、44℃下退火1分鐘、72℃下延伸2分鐘這樣三個(gè)重復(fù)步驟組成一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行35個(gè)這樣循環(huán)，最后在72℃下延長(zhǎng)7分鐘。樣品在4℃貯存，備下一步使用。PCR產(chǎn)物是在1％瓊脂糖凝膠上被分離、DNA條帶用溴乙錠染色，且在紫外燈下可見。用這個(gè)引物對(duì)，在CMS系中有一個(gè)350bp的DNA片段的擴(kuò)增，但在保持系中(圖5)沒有觀察到PCR擴(kuò)增。
實(shí)施例7用CMS特異的PCR擴(kuò)增的DNA片段作為探針對(duì)區(qū)分CMS和保持系的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)檢測(cè)的DNA-DNA雜交檢測(cè)如實(shí)施例1(a)所描述的那樣，從水稻的IR 58025 A(CMS)和IR 58025B(保持系)分離的基因組DNA用各種各樣的限制性酶即EcoR I、HindIII、Dra I、EcoR V、Hinc II、Sau96 I、TaqαI(New England BiolabsInc.，MA，USA)消化。來(lái)源于CMS和保持系的消化完全的3-4mg的DNA在0.7％的瓊脂糖(Sigma，USA)凝膠上電泳分離、變性、中和和真空轉(zhuǎn)移到Hybond N(Amersham Life Science，Buckinghamshire)膜上，這是按照由Sambrook等(1989)Cold Spring Harbor，NY，USA.提供的程序進(jìn)行的。用一個(gè)紫外(UV)Stratalinker(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，DNA被雜交連到膜上。印跡在0.5M磷酸鈉(pH 7.2)、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1％的牛血清蛋白、1mM的EDTA溶液中，于65℃預(yù)雜交3小時(shí)。用一個(gè)隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(JONAKI-BRIT，Mumbai，印度)，按照制造商所描述的方法，用α32P-dATP標(biāo)記探針(SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，于65℃下保持18小時(shí)，同時(shí)進(jìn)行不斷的搖蕩。印跡在65℃下，用2×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)、0.1％SDS、5mM磷酸鈉(pH7.0)沖洗3×20分鐘，再用0.5×SSC、0.1％SDS和3mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)沖洗3×20分鐘。在-70℃下，通過(guò)暴露印跡于X-射線的膠片進(jìn)行發(fā)射自顯影。作為一個(gè)圖解，用限制酶EcoR V所獲得的RFLP在表6中被描述。
實(shí)施例8區(qū)分水稻CMS和保持系的多重PCR檢測(cè)我們已研究開發(fā)了一種多重PCR檢測(cè)，其中第一套寡聚核苷酸引物(如在表2描述的末尾所示)能和屬于第二套寡聚核苷酸引物(表3)的任一個(gè)引物對(duì)在一個(gè)單PCR中進(jìn)行成功的多重復(fù)合以區(qū)分CMS和保持系。
用來(lái)源于CMS系的DNA模板作為一個(gè)靶，第一套引物可以擴(kuò)增一個(gè)325bp的片段，但是用來(lái)源于保持系的基因組DNA作為一個(gè)靶不能獲得擴(kuò)增的產(chǎn)物。無(wú)論靶DNA是來(lái)源于CMS系還是來(lái)源于保持系，屬于第二套寡聚核苷酸引物的任一引物對(duì)將擴(kuò)增出一單一片段。這個(gè)程序敘述如下在公共領(lǐng)域(GenBank)可用的水稻基因組序列被下載，而且引物是基于這些序列的基礎(chǔ)上被設(shè)計(jì)的。一個(gè)引物對(duì)是以水稻1號(hào)染色體的序列為基礎(chǔ)的(登記號(hào)#AP001859；在數(shù)據(jù)庫(kù)序列的1372和2598的位置)。寡聚核苷酸引物的序列如下正向5’-AACACAAGGGACAGCACATTGAGC-3’(SEQ ID No.8)反向5’-GAAAGAGGAGCTAGAGGTGGGTGC-3’(SEQ ID No.9)這一引物產(chǎn)生了一個(gè)1.1kb的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。其它的兩個(gè)引物對(duì)是以數(shù)據(jù)庫(kù)中水稻線粒體DNA(登記號(hào)#D21251)序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的，其在序列的4981和5641位置之間是SEQ ID No.10和SEQ ID No.11，在序列的6660和7303位置之間的是SEW ID No.12和SEQ ID No.13。
(1)正向5’-GGGCAATTCCATCGTGCTATGAGC-3’(SEQ ID No.10)反向5’-GCGTTGGGTTTTCCAACGAAAAAC-3’(SEQ ID No.11)這一引物對(duì)產(chǎn)生了一個(gè)660bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
(2)正向5’-CAGGCGAAGGTCATAATTCGCAGG-3’(SEQ ID No.12)反向5’-CGAAGAAGGCAGTCTTGCTTCCTC-3’(SEQ ID No.13)這一引物對(duì)產(chǎn)生了一個(gè)600bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
這三個(gè)引物對(duì)中的每一個(gè)單獨(dú)地與表2(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)中所說(shuō)明的寡聚核苷酸引物混合，在一個(gè)PCR中進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，所用的條件如下50-100ng的模板DNA，1×PCR緩沖液(50mM KCl，10mMTris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，0.01％的明膠)，200μM dNTP(每一種)，一個(gè)單位的Taq聚合酶，來(lái)自于表2的引物(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)每個(gè)5pmol，來(lái)自表3任一引物對(duì)的每個(gè)引物1pmol。PCR反應(yīng)的條件如下95℃、初始變性7分鐘；接著94℃下30秒、44℃下1分鐘、72℃下2分鐘這樣的一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行35次；在72℃最后延伸7分鐘，樣品儲(chǔ)存于4℃，備下一步用。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，DNA條帶用溴乙錠染色并且在紫外燈下可見。如圖7所描述的一樣，僅當(dāng)模板DNA來(lái)源于CMS系時(shí)，用引物SEQ ID No.4和SEQ ID No.5擴(kuò)增才能得到一個(gè)325bp的片段。無(wú)論模板是來(lái)源于CMS還是保持系，用在表3(SEQID No.8和SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13)中的引物對(duì)中的每一個(gè)都可擴(kuò)增一個(gè)特異的DNA片段。因此，在多重PCR檢測(cè)中，當(dāng)模板是來(lái)源于CMS系時(shí)，有兩個(gè)DNA片段被觀察到；當(dāng)模板是來(lái)源于保持系時(shí)，僅有一個(gè)單的DNA片段被獲得。在表7中(第2泳道，第3泳道)展示了用對(duì)CMS特異的單一的引物對(duì)(SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5)進(jìn)行PCR的例子和用引物對(duì)SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5和SEQ ID No.8和SEQ ID No.9(第4、5泳道)進(jìn)行多重PCR的例子。
實(shí)施例9用于由于和劣種花粉供體雜交授粉而出現(xiàn)的CMS系中雜質(zhì)檢測(cè)的PCR檢測(cè)如實(shí)施例1(b)所描述的一樣，通過(guò)CMS原種種子發(fā)芽得到的100株3天齡的幼苗，從這些幼苗中進(jìn)行基因組DNA的分離。通過(guò)用可以靶向大量的用于檢測(cè)CMS系和劣質(zhì)花粉供體之間的多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記中的任何一個(gè)的寡聚核苷酸引物，PCR如實(shí)施例7中所描述的一樣被操作(隨每個(gè)來(lái)源的引物不同，循環(huán)條件有一些改動(dòng))。PCR以后，產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，通過(guò)溴乙錠染色進(jìn)行檢測(cè)。如果DNA是來(lái)自于CMS系，一個(gè)單個(gè)的條帶就可以被觀察到，但是如果來(lái)自于劣種花粉供體的雜交授粉已出現(xiàn)，那么除了CMS特異的帶，還有一個(gè)額外的條帶(劣種花粉供體)將被觀察到。
用于由于和劣種花粉供體雜交授粉而出現(xiàn)的CMS系中雜質(zhì)檢測(cè)的PCR檢測(cè)也可從通過(guò)CMS原種種子發(fā)芽得到的100株幼苗庫(kù)分離的DNA進(jìn)行。切除100株生長(zhǎng)到15天的CMS的水稻苗中的每一株的第二片葉片頂部2cm，然后在這個(gè)區(qū)域以下切下一個(gè)1cm長(zhǎng)的葉片。收集從所有植株切下的葉片，按照Kochert等(1989)的程序如實(shí)施例1所述分離基因組DNA。按標(biāo)準(zhǔn)程序用熒光染料標(biāo)記引物對(duì)(正向或反向)中的一個(gè)的5’末端。用熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，通常如實(shí)施例7中所描述的一樣。循環(huán)條件根據(jù)所用的引物而變化。重點(diǎn)要提到的是，所用的模板DNA應(yīng)僅僅是2-3ng，而且應(yīng)該用AmpliTaq Gold酶(ABI，F(xiàn)oster City，USA)。PCR后，取1μl的PCR產(chǎn)物和上樣(loading)染料[甲酰胺和右旋蘭(Bluedextron)為5∶1的比率]和1.5μl的標(biāo)記(ABI，F(xiàn)oster City，USA)混合。加熱變性，加1.5μl在自動(dòng)DNA測(cè)序儀377中(ABI，F(xiàn)oster City，USA)。在凝膠上進(jìn)行電泳直到條帶被很好的分離。用基因掃描分析儀(ABI，F(xiàn)oster City，USA)分析由條帶產(chǎn)生的峰高。
實(shí)施例10檢測(cè)水稻雜種純度的PCR檢測(cè)從來(lái)源于CMS系IR 58025 A、恢復(fù)系IR40750和這兩個(gè)親本的雜種(DRR H1)中按實(shí)施例1(b)所述分離基因組DNA。用微衛(wèi)星標(biāo)記RM164[正向5’-TCTTGCCCGTCACAGCAGATATCC-3’(SEQ ID No.14)，反向5’-GCAGCCCTAATGCTACAATTCTTC-3’(SEQ ID No.15)](Wu和Tanksley，1993，Mol.Gen.Genet.241225-235)。兩個(gè)親本間在這個(gè)位置的多態(tài)性可以觀察到。PCR的條件是DNA樣品(50ng)在含有1×PCR緩沖液[10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％的明膠]，每一種dNTPs(AmershamPharmacia Biotech，Sweden)0.2mM，每種引物10pmol，一個(gè)單位的Taq聚合酶的25ml反應(yīng)體系中進(jìn)行。于95℃下初始變性7分鐘，接著進(jìn)行94℃下1分鐘、55℃下1分鐘、72℃下2分鐘這樣的一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，在72℃最后延伸7分鐘，樣品儲(chǔ)存于4℃，備下一步用。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上被分離，用溴乙錠染色且紫外燈下觀察可見。用SEQ IDNo.14和SEQ ID No.15做引物進(jìn)行的PCR的結(jié)果如圖8所示。真正的雜種呈現(xiàn)兩個(gè)DNA片段，一個(gè)片段是由恢復(fù)親本提供的，另一個(gè)片段是由CMS親本提供的。非正常型呈現(xiàn)了一個(gè)和親本中任一個(gè)DNA條帶共轉(zhuǎn)移的單個(gè)的片段(圖8)。在圖8中，非正常型和CMS的DNA條帶的共轉(zhuǎn)移表明這個(gè)特定的雜種群被IR 5802 A(CMS)污染了。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中所用的微衛(wèi)星的例子證明的僅僅是被用于檢測(cè)水稻雜種純度的許多個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中的一個(gè)例子。
檢測(cè)水稻雜種純度的PCR方法可以在一個(gè)集合的樣品中被完成。讓從雜種原種種子發(fā)芽得到的400株幼苗生長(zhǎng)到15天，切除每一株第二片葉片頂部2cm，然后在這個(gè)區(qū)域以下切下一個(gè)1cm長(zhǎng)的葉片。收集從所有植株切下的葉片，按照Kochert等(1989)的程序如實(shí)施例1所述分離基因組DNA。按標(biāo)準(zhǔn)程序用熒光染料標(biāo)記引物對(duì)(正向或反向)中的一個(gè)的5’末端。用熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，通常如實(shí)施例7中所描述的一樣。循環(huán)的條件根據(jù)所用的引物而變化。重點(diǎn)要提到的是，所用的模板DNA應(yīng)僅僅是2-3ng，而且應(yīng)該用AmpliTaq Gold酶(ABI，F(xiàn)oster City，USA)。PCR后，取1μl的PCR產(chǎn)物和上樣(loading)染料[甲酰胺和右旋(Blue dextron)為5∶1的比率)和1.5μl的標(biāo)記(ABI，F(xiàn)oster City，USA)混合。加熱變性，加1.5μl在自動(dòng)DNA測(cè)序儀377中(ABI，F(xiàn)osterCity，USA)。在凝膠上進(jìn)行電泳直到條帶被很好的分離。用基因掃描分析儀(ABI，F(xiàn)oster City，USA)分析由條帶產(chǎn)生的峰高。
通過(guò)這個(gè)檢測(cè)，純度可以通過(guò)測(cè)量期望的兩個(gè)峰中每一個(gè)高度來(lái)檢測(cè)，這兩個(gè)峰(每個(gè)峰代表被一個(gè)親本提供的等位基因)具有可通過(guò)儀器檢測(cè)的雜種特性。在PCR檢測(cè)中，用從一個(gè)單一雜種植物中分離的基因組做一個(gè)模板，峰高被期望是相等的，產(chǎn)生了1∶1比率(或50∶50)。在PCR檢測(cè)中，用從400株苗的群體中分離的基因組DNA作為一個(gè)模板，任何兩個(gè)峰高度的1∶1(50∶50)的偏離都將是在雜種種子原種中雜質(zhì)程度的指標(biāo)。峰高比率為1.02∶0.98(51∶49)將和一個(gè)98％純度的雜種種子原種的樣品對(duì)應(yīng)，峰高比率為1.1∶0.9(55∶45)將和一個(gè)90％純度的雜種種子原種的樣品對(duì)應(yīng)。
最后，可以這樣說(shuō)，本發(fā)明提供了確保親本品系純度的方法，這個(gè)方法是確保水稻雜種純度的必要的先決條件。用在三系培育系統(tǒng)進(jìn)行雜交水稻生產(chǎn)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系常常被等同細(xì)胞核的保持系所污染。在本發(fā)明中報(bào)告的一個(gè)DNA序列對(duì)于水稻線粒體DNA是同源的，但是它是水稻W(wǎng)A細(xì)胞質(zhì)雄性不育系所特有的。在一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中，用基因組的總的DNA作為模板，基于上述的DNA序列的基礎(chǔ)上的寡聚核苷酸引物從水稻的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系擴(kuò)增一個(gè)片段，但不能從與它同族的保持系中擴(kuò)增這個(gè)片段，這表明這個(gè)PCR檢測(cè)能被用于檢測(cè)在CMS系原種種子中的保持系的雜質(zhì)。對(duì)含有CMS和保持系的混合的植物樣品進(jìn)行的編代碼實(shí)驗(yàn)中，這個(gè)PCR檢測(cè)被用于正確預(yù)測(cè)這些植物的基因型。在Southern雜交分析中，用這些寡聚核苷酸引物獲得的PCR擴(kuò)增片段檢測(cè)在CMS系和保持系間的多態(tài)性。本申請(qǐng)描述了用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)多態(tài)性這樣的共顯性的PCR可檢測(cè)的標(biāo)記檢測(cè)在CMS系繁育期間污染的雜交授粉方面的應(yīng)用，此外還描述了用此標(biāo)記評(píng)估水稻雜種純度。
表1.水稻系分析研究*CMS系IR 58025 AIR 62829 APMS 8 APMS 10 A78897 A保持系IR58025 BIR 62829 BPMS 8 BPMS 10 B78897 B恢復(fù)系IR40750雜種DRRH 1(IR 58025 A×IR 40750)*在本研究中所使用的所有水稻系的提供單位為水稻研究理事會(huì)，印度農(nóng)業(yè)研究委員會(huì)，海德拉巴，印度。
表2.用于PCR檢測(cè)以區(qū)別水稻的CMS和保持系的特定的寡聚核苷酸序列

表3.在PCR檢測(cè)中用于區(qū)別CMS和保持系的可用SEQ ID No.4和SEQ ID No.5多重復(fù)合的寡聚核苷酸引物對(duì)

F＝正向?qū)?，R＝反向?qū)?br> 權(quán)利要求
1.一種在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估水稻雜種的親本系純度的方法，其中遵循一個(gè)兩系系統(tǒng)方法進(jìn)行雜種水稻生產(chǎn)；這些親本系包括一個(gè)雌性親本，其具有由溫度、光周期及能夠誘導(dǎo)雄性配子致死的化學(xué)試劑處理誘導(dǎo)的條件的雄性不育性。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中DNA是從單個(gè)的幼苗中被分離的，PCR的分析是被進(jìn)行的，通過(guò)在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)基因型進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)通過(guò)溴乙錠染色、銀染進(jìn)行或如果一個(gè)放射性的標(biāo)簽或一個(gè)非放射性的熒光標(biāo)簽被結(jié)合進(jìn)PCR的擴(kuò)增片段中可適用的檢測(cè)方法。
3.一種在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估水稻雜種的親本系純度的方法，其中遵循一個(gè)兩系系統(tǒng)方法進(jìn)行雜種水稻生產(chǎn)；這些親本系包括一個(gè)雌性親本，其具有由溫度、光周期及能夠誘導(dǎo)雄性配子致死的化學(xué)試劑處理等誘導(dǎo)的條件的雄性不育性；其中所述DNA是從一個(gè)群體的苗中被分離的(在這個(gè)群體中具有代表性的個(gè)體數(shù)可能是100)，這些苗是通過(guò)親本系種子發(fā)芽被獲得的；PCR的分析是被進(jìn)行，而且通過(guò)估計(jì)在被評(píng)估位置群體中等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度；估計(jì)在群體中等位基因頻率的方法包括通過(guò)凝膠電泳使帶有熒光標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增片段的分離，以及同特定的等位基因相應(yīng)的峰高的評(píng)估進(jìn)行。
4.一種在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估任何具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要的雜種的親本系純度的方法，其中遵循一個(gè)兩系系統(tǒng)方法進(jìn)行雜種生產(chǎn)；這些親本系包括一個(gè)雌性親本，其具有由溫度、光周期及能夠誘導(dǎo)雄性配子致死的化學(xué)試劑處理等誘導(dǎo)的條件的雄性不育性。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中所述DNA是從單個(gè)的幼苗中被分離的，PCR的分析是被進(jìn)行的，通過(guò)在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)基因型進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)通過(guò)溴乙錠染色、銀染進(jìn)行或如果一個(gè)放射性的標(biāo)簽或一個(gè)非放射性的熒光標(biāo)簽被結(jié)合進(jìn)PCR的擴(kuò)增片段中可適用的檢測(cè)方法。
6.一種在PCR檢測(cè)中用象微衛(wèi)星和序列標(biāo)簽位點(diǎn)這樣的共顯性的序列特異的DNA標(biāo)記評(píng)估任何具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要的雜種的親本系純度的方法，其中遵循一個(gè)兩系系統(tǒng)方法進(jìn)行雜種生產(chǎn)；這些親本系包括一個(gè)雌性親本，其具有由溫度、光周期及能夠誘導(dǎo)雄性配子等致死的化學(xué)試劑處理等誘導(dǎo)的條件的雄性不育性；其中所述DNA是從一個(gè)群體的苗中被分離的(在這個(gè)群體中具有代表性的個(gè)體數(shù)可能是100)，這些苗是通過(guò)每個(gè)親本系種子發(fā)芽被獲得的；PCR的分析是被進(jìn)行，而且通過(guò)估計(jì)在被評(píng)估位置群體中等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度。
7.如權(quán)利要求6的方法，其中估計(jì)在群體中等位基因頻率的方法包括通過(guò)凝膠電泳使帶有熒光標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增片段的分離，以及同特定的等位基因相應(yīng)的峰高的評(píng)估進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)水稻W(wǎng)A細(xì)胞質(zhì)雄性不育系專一的DNA標(biāo)記，利用這種DNA堿基標(biāo)記來(lái)評(píng)估種子純度和為了確保水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的純度的一種方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1740339SQ200510099098
公開日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2001年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月28日
發(fā)明者亞什陶拉·賈米爾, 拉梅什·V·松迪 申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會(huì)