專利名稱：用于評估種子純度的dna標記和應用dna序列評估種子純度的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種利用DNA序列作為評估種子純度的方法，尤其涉及具有同源性的DNA序列和水稻的線粒體DNA，其對于含有水稻細胞質(zhì)雄性不育系的野生敗育(WA)的細胞質(zhì)是特有的，且在聚合酶鏈式反應(PCR)檢測中應用這些序列去區(qū)別水稻的雄性不育系(CMS)和它們的同族雄性可育保持系。本發(fā)明涉及利用DNA堿基標記確保水稻細胞質(zhì)雄性不育系的純度的一種方法。
背景技術(shù)：
雜種優(yōu)勢是在兩個近親繁殖系的一個雜交的后代比它雙親中的任一個有高的生產(chǎn)潛力的一種現(xiàn)象。雜種能產(chǎn)生比最好的品系高10-30％的產(chǎn)量，而且對于增加產(chǎn)量它也是一個受歡迎的選擇。
在世界上水稻是主要的禾谷類作物，而且在亞洲的許多地區(qū)它是飲食的主要部分。據(jù)估計，在亞洲的許多國家，象印度，到2025年為止，水稻的產(chǎn)量必須加倍才能滿足日益增長的人口需要[Hossain，1996.InKhush(ed)水稻遺傳學(Rice Genetics)III，Proc.Third Intl.RiceGenet.Symp.，Los Banos馬尼拉，菲律賓，16-20 Oct.1995.國際水稻研究院，馬尼拉，菲律賓]。就象在中國所證明的那樣，在中國，幾乎水稻種植面積的50％都是被雜種覆蓋。雜種水稻的廣泛種植對于增加產(chǎn)量是一個理想的可行的選擇。相比之下，在象印度這樣的國家，雜交水稻的種植面積不到水稻總的種植面積的1％。這證明了增加雜交水稻種植面積的巨大的潛力，而且，人們預計，雜交水稻種子的市場在許多種植水稻的國家將增加，這包括印度。
對于雜交水稻的生產(chǎn)應用最廣泛的系統(tǒng)是三系雜交系統(tǒng)(表1)。三系雜交系統(tǒng)包括1、一個被稱做細胞質(zhì)雄性不育系(CMS)的雄性不育的雌性可育系，因為它在基因組的細胞質(zhì)成分中攜帶有一個給予它突變的雄性不育；2、保持系；以及3、恢復系。保持系和恢復系是雄性可育和雌性可育的。CMS和保持系與基因組的細胞核的成分實際上是完全相同的(常常作為等同一細胞核系被提到)，但是基因組的細胞質(zhì)的成分是互不相同的。CMS系的雄性不育是母性遺傳的，而且最有可能是由于在線粒體DNA上突變。CMS系(雌性可育)可通過用來源于保持系的花粉受精被繁殖。因為基因組的細胞質(zhì)不能通過花粉進行轉(zhuǎn)移，這樣雜交的后代將僅僅遺傳有來源于CMS系的細胞質(zhì)，而且將因此是雄性不育的。即使后代基因組的細胞核成分有一半來源于保持系，由于在這兩個系的基因組的成分沒有什么區(qū)別，后代基因組的細胞核成分同CMS系的細胞核成分也是完全相同的。
在CMS系和另一個近親繁殖的親本系雜交中產(chǎn)生的雜種種子被稱做恢復系，就象上面所指明的那樣是雄性可育和雌性可育的。在這個雜交中，CMS系作為雌性的親本起作用，而恢復系是作為雄性的親本。恢復系在其細胞核基因組中帶有一個Rf基因/或多個Rf基因(可育的恢復)，它將恢復細胞質(zhì)源于CMS系遺傳的植物的雄性可育性。因此，在如

圖1所示的雜交中產(chǎn)生的雜種的種子是可育的。CMS和恢復系要恰當?shù)剡x擇，這樣雜交呈現(xiàn)充分的雜種優(yōu)勢(雜種優(yōu)勢)以得到比近交的品種實際上更高的產(chǎn)量。
目前在世界上具有商業(yè)價值種植的雜交水稻的絕大多數(shù)(90％或更多)是從一個單一的資源衍生它們的細胞質(zhì)[Yuan，1995，雜交水稻生產(chǎn)技術(shù)，水稻研究理事會(Directorate of Rice Research)，海得拉巴，印度]，這種細胞質(zhì)被稱作野生敗育(WA)細胞質(zhì)，是在中國的野生稻中被發(fā)現(xiàn)的。隨后，利用循環(huán)的親體做為雄性供體，通過重復回交使這個細胞質(zhì)同幾種不同細胞核遺傳背景進行雜交。在這個方法里，幾個不同的CMS系已被培育。它們中每一個都按順序同不同的恢復系雜交而培育出大量的雜種，它們所有都具有相同的WA細胞質(zhì)。
保持雜種的純度是重要的，因為任何雜質(zhì)都會降低期望的產(chǎn)量。據(jù)估計，在雜種種子中每1％的雜質(zhì)會使產(chǎn)量降低達100kg/公頃[Mao等，1996In Virmani，S.S.，E.A.Siddiq，和K.Muralidharan(eds)，雜交水稻技術(shù)的進展(Advances in Hybrid Rice Technology)Proc.Third Intl.Symp.on Hybrid Rice，水稻研究理事會(Directorate of Rice Research)，海得拉巴，印度]。印度種子法規(guī)定雜交水稻期望的純度應該是98％(Verma，1996.Seed Tech.News 241-4)。在中國雜交水稻的純度被規(guī)定至少是96％(Wengui Yan，2000.，US Patent#6066779)。為了確保雜交種子純度要求的水平，用于雜交種子生產(chǎn)的親本系應有高的純度(幾乎99％)水平。
一個最常見的出現(xiàn)在雜交種子生產(chǎn)期間的雜質(zhì)是CMS系種子中的保持系雜質(zhì)。因為它們都是等同細胞核系，除了雄性不育僅在開花期能被判斷，基于形態(tài)上的標準去區(qū)分這些系是極其困難的。區(qū)分CMS和保持系的DNA標記可能被研究開發(fā)和被應用在苗的水平上去進行做為雜質(zhì)出現(xiàn)在CMS系的原種中保持系種子的實際檢測。基于聚合酶鏈式反應基礎上的DNA標記對于這個目的是極其適用的。因為它們比基于限制性片段長度多態(tài)性的方法基礎上的雜交能更為有效地處理大量的樣品。
聚合酶鏈式反應是基于應用短寡聚核苷酸序列做為引物的DNA序列的酶[促]擴增的基礎上的，這樣的DNA序列出現(xiàn)在兩個結(jié)合在靶DNA位點適當間隔的引物之間。當寡聚核苷酸引物在已知靶DNA序列的基礎上被設計時，PCR工作是重復的?；诘亩痰?8-10個堿基長)，隨機設計的寡聚核苷酸引物[Williams等，1990；核酸研究(Nucleic acidsresearch)186531-6535]的PCR的程序已被研究開發(fā)。這些引物不是以已知的靶DNA序列為基礎的，而且包含有大量的這些隨機產(chǎn)生的引物的試劑盒現(xiàn)在都已商品化供應。用這種方法被研究開發(fā)的DNA標記就是被稱為隨機擴增多態(tài)(RAPD)DNA標記。由于大量的引物是可用的，即使是極其相關(guān)的品系，其遺傳(基因)的多態(tài)性也可以用這種方法檢測。然而，RAPD標記的重復性是不好的，這是由于RAPD的寡聚核苷酸引物長度短，也可能是由于對靶特異性的要求程度的缺乏。這嚴重限制了RAPD標記做為一種區(qū)分不同基因型的診斷標記的實際應用。
用于區(qū)分水稻CMS(WA細胞質(zhì))和保持系的RAPD標記，曾有過報道(Jena和Pandey 1999；Hybrid Rice Newsletter，213-14)。然而，由于這些標記的低可重復性使在實際中不可能應用它們以常規(guī)方法對CMS和保持系進行區(qū)分。因此，基于這些方法基礎上的可重復PCR的研究開發(fā)是必要的，且其能被應用于區(qū)分CMS和保持系，如果寡聚核苷酸引物是基于在CMS和保持系之間的具有多態(tài)性的水稻DNA一個區(qū)域已知序列的基礎上的，那么可能獲得理想的重復水平。因為這些引物在長度上比用在RAPD分析上的引物長且對靶DNA序列特異，所以基于這樣引物基礎上的PCR檢測將是高度可重復的。

發(fā)明內(nèi)容
在本申請中，對于含有野生敗育型細胞質(zhì)(WA)的CMS水稻系特異的水稻線粒體DNA一個區(qū)域的序列確定和識別進行了描述。在這個序列基礎上，可以被用于在PCR檢測中區(qū)分CMS系(WA)和與它等同細胞核保持系的特異的寡聚苷酸引物已被研究開發(fā)。這些引物已被用于區(qū)分幾種不同的水稻CMS系(所有均含有WA細胞質(zhì))和它們同源的保持系。在一個編代碼試驗中，這個檢測被用于預測水稻CMS(WA)保持系混合物的基因型，其具有100％的準確性。因此育種者可以應用這個檢測去成功地檢測在CMS系的原種種子中保持質(zhì)的雜質(zhì)，確保了這個親本系及其由它衍生的雜種純度。
在CMS系的原種種子中另一個雜質(zhì)的來源是由不是指定保持系的水稻花粉雜交引起的。對于水稻CMS系的繁殖[Virmani，1993.農(nóng)學進展(Advances in Agronmy)57377-462]，規(guī)定的最小隔離距離為300米，在這個距離內(nèi)除了保持系(優(yōu)先的花粉供體或雄性親本)外，沒有其它品系的水稻被培育，這是基于來源于這個距離以外的正在生長的水稻的花粉不能傳粉給雌性親本的觀察為基礎的。偶爾，這個最小的隔離距離或者沒有被嚴格遵守或者由于當?shù)氐臈l件(例如風流和天氣)可能允許花粉從正在生長的水稻作物上被轉(zhuǎn)移到300米以外的距離。因此，監(jiān)測在CMS繁育期間出現(xiàn)的劣種花粉供體遠源雜交的程度是重要的。在本專利中，描述了象微衛(wèi)星和序列標簽位點(STSs)這樣用于估計在CMS系的原種種子繁育期間出現(xiàn)的遠源雜交的程度的序列特異的PCR標記的應用方法。
盡管這個應用是用于估計水稻CMS系出現(xiàn)的遠源雜交的程度，但是用于估計遠源雜交程度的相似方法已被應用于其它作物CMS系中，其非限制性包括玉米、珍珠谷子、高粱、麥子、太陽花、芥子、卷心菜、花木郁菜、西紅柿、胡椒、秋葵等。在這里CMS系被用于雜種的生產(chǎn)而且合適的微衛(wèi)星或STS標記也是可行的。
雜種種子純度的評估在傳統(tǒng)上是通過生長測試(GOT)試驗完成，這是基于生長成熟的具有代表性的植物樣品的形態(tài)和花的特性(區(qū)分雜種)基礎上的，水稻植株要花幾個月的時間才能成熟而且這些種子不得不貯存在適宜的條件下，因此它們要等到這些試驗結(jié)果是可行后才能被銷售。此外，象在印度出現(xiàn)的那樣，如果在雜交種子生產(chǎn)后被GOT所占據(jù)的第一個生長季節(jié)也是雜種培育的優(yōu)選季節(jié)的情況下就會引起相當大的耽擱。在這樣情況下，種子不得不被貯存達一年至到在它們能銷售之前的隨后的生長季節(jié)到來。對于種子公司在延長的周期中大量的資金因此被以雜種原種的形式擱死，同時等待GOT的結(jié)果。GOT的另一個缺陷是它對由于環(huán)境影響形態(tài)特征的表達是敏感的。而且，也存在這種可能性，即不利的氣候條件(象大風或大雨)可能損害或毀掉作物，這樣使收集數(shù)據(jù)變得困難了。
從速度和準確性方面考慮，以一個優(yōu)越的試驗取代GOT為目標，基于檢測的一個PCR被描述用于評估雜種種子純度。這些實驗包括區(qū)別水稻雜種親本系的微衛(wèi)星或STS(序列標簽位點)多態(tài)性的應用。這些多態(tài)性是共顯性的，而且等位基因是做為在PCR及瓊脂糖凝膠電泳中不同大小的DNA片段被檢測的。雜種能被鑒定，因為它有被兩個親本提供的等位基因，即從雜種植物中分離的DNA在PCR中做為一個模板的應用后，PCR擴增的兩個不同大小的片段被獲得。這些等位基因中的一個被雄性不育、雌性可育的(CMS)親本提供，而另一個被雄性可育、雌性可育的親本(恢復系)提供。這個試驗是用從6天的水稻幼苗分離的DNA而進行的，且檢測能在48小時之內(nèi)被完成。這個基于種子純度試驗的PCR的實施在種子工業(yè)上將引起相當大的節(jié)約。在本實驗中描述的對這個檢測的另外的修改不需要在單獨的苗上進行實驗，而能夠在從雜種種子原種所獲得的一個群體苗上進行實驗。
本發(fā)明涉及用于評估種子純度的新的DNA標記和用基于標記的DNA確保水稻細胞質(zhì)的雄性不育系純度的方法。該方法是基于對水稻W(wǎng)A細胞質(zhì)雄性不育系特異的一個DNA序列的確認識別的基礎上的，也是關(guān)于來源相同的特異的DNA標記的研究開發(fā)。這些DNA標記能被用于檢測CMS系的雄性可育保持系的雜質(zhì)。這個應用可能對于雜交水稻工業(yè)是非常有利的，因為上述的混合物類型常常導致雜交種子有一個下降的純度和在商品交易中產(chǎn)品的不利的銷售。本發(fā)明還提供了在親本系、雜交水稻及其它作物中應用象微衛(wèi)星和STSs這樣的共顯性序列特異的PCR標記檢測的方法。
在世界的許多地方，水稻是主要的禾谷類作物。中國正在大規(guī)模地實踐雜交水稻的種植，據(jù)報道，雜交水稻種植后產(chǎn)量增加了10-30％。人們期望在不久的將來，雜交水稻技術(shù)也將在許多其它的生長水稻的國家被大規(guī)模實踐。目前，大多數(shù)雜交水稻，通過一個三系系統(tǒng)生產(chǎn)，其包括1、一個細胞質(zhì)雄性不育系(CMS)，由于在水稻基因組細胞質(zhì)成分上的一個突變(最可能是線粒體)，所以其是雌性可育的但雄性不育的；2、一個雄性可育的、雌性可育的保持系，它和CMS系基因組細胞核成分是完全相同的，但有一個不能誘導雄性不育的不同的細胞質(zhì)基因型；3、一個雄性可育的、雌性可育的恢復系。CMS系做為雌性親本在雜交中起作用，而恢復系是雄性親本。在雜種種子生產(chǎn)期間，CMS和恢復系在很近的距離內(nèi)被培育，這樣，來源于恢復系的花粉將被傳粉給CMS系的花上。因為CMS系是雄性不育的，它將不能通過自花傳粉結(jié)種，而且在CMS系上形成的任何種子都注定是由于來源于恢復系的花粉受精的結(jié)果。恢復系帶有一個或多個編碼基因的細胞核，它將恢復雜種的雄性可育，即使它帶有一個CMS細胞質(zhì)。因此雜種是自交可稔的。
CMS系由于本身是雄性不育的，它不能通過自交繁育。實際上，CMS系的繁育是通過用CMS系做為一個雌性親本和保持系做為一個雄性親本被完成的。從這雜交中出現(xiàn)的后代的基因型將同CMS系的基因型是完全相同的，因為保持系和CMS系實際上在基因組的細胞核成分上是完全相同的。后代將有CMS系的雄性不育的特性，因為基因型的細胞質(zhì)成分是由雌性親本提供的，在本試驗情況下是CMS系。還應注意到保持系不帶有CMS系的細胞質(zhì)雄性不育表型的任何恢復。
CMS和保持系的細胞核基因型的等同性意味著這兩個品系通過形態(tài)學的標準幾乎是不可區(qū)分的。這就產(chǎn)生了一個實際問題，因為去檢測在CMS系種子原種中的保持系雜質(zhì)是極其困難的。因為保持系是自交可稔的，這些雜質(zhì)能在雜交水稻的生產(chǎn)田中不需要恢復系授精就能產(chǎn)生種子，這導致了保持系的種子污染了雜種的種子。這種類型的污染在雜交水稻種子的生產(chǎn)期間是最常被觀察的，而且導致期望產(chǎn)量的減少及在田里雜種的弱的生產(chǎn)能力。如果雜種的純度達不到種子證明處(seed certificationagencies)制定的規(guī)定的限制(在印度是98％，在中國96％)，所有的種子都被拒絕，這對種子生產(chǎn)者(公司)是相當大的損失。
在雜交水稻的商品生產(chǎn)中用的CMS系絕大多數(shù)是基于WA細胞質(zhì)應用的基礎上的。在本專利中，我們描述了對于含有WA細胞質(zhì)水稻品系特有的DNA序列的識別確認，而且這是和水稻線粒體DNA高度同源的，基于這個DNA序列的對寡聚核苷酸引物特異的序列已被研究開發(fā)，它能被用于PCR檢測中可靠地區(qū)分含有WA細胞質(zhì)水稻細胞質(zhì)雄性不育系和它的同族的保持系。困此這些引物能被雜種種子培育者/種子公司利用去檢測在CMS系中保持系的雜質(zhì)，通過確保CMS系的純度，一個主要的雜種種子污染源被除去，對種子工業(yè)和農(nóng)場主產(chǎn)生了明顯的利益。
附圖的簡要描述圖1是雜交水稻生產(chǎn)的三系系統(tǒng)；該圖是在三系系統(tǒng)中，一個雜種如何被生產(chǎn)出來的示意圖。細胞質(zhì)雄性不育(CMS)系(花粉不育的)做為雌性親本在和作為雄性親本的保持系(花粉可育的)的雜交中起作用。除了在CMS系中花粉不育外，CMS和保持系是等同細胞核的。因此，保持系對于CMS系的繁育是非常必要的。一旦CMS系被獲得，它就和一個恢復系雜交，該恢復系擁有大量的我們想要的農(nóng)藝學上的特性，且能恢復后代的可育性。因此通過這樣雜交產(chǎn)生的雜種是可育的。
圖2為對水稻CMS系特異的一個DNA序列的PCR擴增；PCR就如實施例3描述的用微衛(wèi)星引物RM9(SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7)進行的。PCR產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠上進行分離，用EB(溴乙錠)染色，在紫外燈下可見。第一泳道含有DNA分子量標記[λDNA用Hind III酶切消化(NEW England Biolabs，USA)]；第二泳道是含有保持系的PCR擴增產(chǎn)物(IR 62829B)；第三泳道是雜種(DRR H1)，第四泳道是CMS系(IR 62829A)，一個多余的DNA條帶僅在雜種和CMS系中出現(xiàn)，在保持系中未出現(xiàn)的用一個黑色的箭頭在膠的右角標明了。
圖3為一個水稻CMS系特異的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)；用微衛(wèi)星引物RM9對一個CMS特異的DNA條帶進行確定，而且其如實施例4所描述的一樣被純化。該DNA條帶用一個自動的DNA測序儀測序(ABI 3700；ABI，F(xiàn)oster city，USA)。這個序列由325堿基對組成，同源查詢表明它同水稻線粒體DNA有高度的同源性，DBJ登記號#D21251，除了從1-36位置的堿基有一點(不同)外，PCR引物是基于這個序列信息被設計的，僅在CMS系中獲得了擴增。正向引物是基于對水稻線粒體DNA(從位置1-36)沒有呈現(xiàn)同源性的區(qū)域基礎上的，反向引物是基于線粒體DNA序列基礎上的。
圖4為CMS特異DNA序列和水稻線粒體DNA的同源性(SEQ.ID.NO.2)；通過測序獲得的DNA序列的信息如實施例4描述的一樣和水稻線粒體DNA進行比較，DBJ登記號#D21251，用Boxshade服務器，在http//www.ch.embnet.org/software/Box-form.html.上可用。
圖5為區(qū)分水稻CMS和保持系的一個PCR檢測；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5擴增的PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上被分離，用EB(溴乙錠)染色，在紫外燈下可見。第一泳道為1kb(干對堿基)的DNA標記；第二泳道含有IR58025A(CMS)；第三泳道，DRR H2(雜種)；第四泳道，IR 58025B(保持系)；第五泳道，IR 62829A(CMS)；第六泳道，DRR H1(雜種)；第七泳道，IR 62829B(保持系)。三個其它組的CMS-保持系被分析；而且在所有情況下，觀察到擴增僅在CMS系中，而未觀察到雜種在保持系中。
圖6為用CMS特異的DNA序列做為探針在水稻CMS和保持系間進行限制片段長度多態(tài)性(RFLP)的檢測；從IR 58025A(CMS)和IR 58025B(保持系)分離的基因組DNA用EcoR V限制性酶消化在瓊脂糖凝膠上過夜分離。用CMS特異的DNA序列作為探針如在實施例7中所描述的進行Southern雜交。這個探針雜交上一個2.3kb的在IR 58025A(CMS)系的區(qū)域，而在IR 58025B(保持系)，其與一個0.6kb的區(qū)域雜交。
圖7是為了區(qū)分水稻的CMS系和保持系而進行的一個多重PCR檢測；第一泳道是DNA分子量標記[λDNA用Hind III消化(NEW EnglandBiolabs，USA)]；第二泳道是IR 58025 A(CMS)；第三泳道是IR 58025B(保持系)，在第二、三泳道中樣品是通過SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5單獨擴增的PCR產(chǎn)物；第四泳道是IR 58025A(CMS)；第五泳道，IR 58025B(保持系)，第四、五泳道中樣品是通過多重SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ.ID NO.8和SEQ.ID No.9擴增的PCR產(chǎn)物。單態(tài)性片段是SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9的PCR產(chǎn)物，多態(tài)性片段是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的PCR產(chǎn)物。
圖8為測定水稻雜種純度的PCR檢測；第一泳道是一條1kb DNA分子量標記，用引物對RM164微衛(wèi)星基因座進行的PCR擴增；第二泳道是IR 40750(恢復系)；第三泳道是DRR H1(雜種)；第四泳道是IR 62829A(CMS)。注意，一個單一的多態(tài)PCR擴增的片段在第二、四泳道中被觀察到。雜種顯示了由雙親提供的具有特征性的等位基因的兩個DNA片段。第5-12泳道代表了確定來源于DRR H1雜種原種中種子純度而進行的一個PCR檢測。兩條帶的出現(xiàn)表明了第5、6、8、9、10、11和13電泳泳道代表真正的雜種，單一條帶的出現(xiàn)表明被7、12帶代表的植物是雜質(zhì)(非正常型的)。
簡而言之，本發(fā)明提供了和水稻線粒體DNA有極大同源性的一個DNA序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3)，這里提到的序列對于含有水稻細胞質(zhì)雄性不育的野生敗育細胞質(zhì)(WA)是特有的。本發(fā)明提供了基于這個序列在PCR檢測中用于區(qū)分水稻的雄性不育系(CMS)和與它同源的雄性可育的保持系基礎上的寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5)的寡聚核苷酸引物。
在另個具體體現(xiàn)中，本發(fā)明提供了基于DNA序列在PCR檢測中用于區(qū)分水稻細胞質(zhì)雄性不育系(CMS)和它同源的雄性保持系的基礎上的應用寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了基于DNA序列在PCR檢測中用于區(qū)分水稻細胞質(zhì)雄性不育系(CMS)和它同源的雄性保持系的基礎上的應用含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法。這里所說的雄性不育系含有WA(野生敗育)細胞質(zhì)。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了基于DNA序列在PCR檢測中用于區(qū)分水稻W(wǎng)A細胞質(zhì)雄性不育系(CMS)和它同源的雄性保持系的基礎上的應用含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法。在這里如果模板DNA來源于CMS系則DNA擴增產(chǎn)物是可得到的，如果模板DNA來源于同源的雄性可育的保持系則DNA擴增產(chǎn)物不可得到。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了基于這個DNA序列在PCR檢測中用于水稻W(wǎng)A細胞質(zhì)雄性不育系(CMS)和與它同源的雄性可育的保持系基礎上的含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法，在這里PCR擴增片段的檢測是通過瓊脂糖凝膠電泳和隨后的EBC(溴乙錠)染色。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了基于這個DNA序列在PCR檢測中用于區(qū)分水稻的WA細胞質(zhì)雄性不育系(CMS)和與它同源的雄性可育的保持系基礎上的含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法，在這里PCR擴增片段的檢測是通過檢測被結(jié)合進PCR擴增產(chǎn)物中的放射性標記的核苷酸來完成的。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了基于這個DNA序列在PCR檢測中用于區(qū)分水稻的WA細胞質(zhì)雄性不育系(CMS)和與它同源的雄性可育的保持系基礎上的含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法，在這里非放射性標記的核苷酸被結(jié)合進PCR擴增產(chǎn)物，而且它的檢測是通過比色法、化學發(fā)光法、或熒光測量法進行的。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了基于DNA序列在PCR-ELISA(酶連免疫吸附檢測)設計反應用于區(qū)分水稻的WA細胞質(zhì)雄性不育系和它同源的可育保持系的方法。所述PCR-ELISA設計反應可能包括(a)一個被標記的捕獲探針或一個被標記的PCR引物的應用，它們能對適當?shù)挠删郾揭蚁?、苯乙烯、玻璃等組成的包被固體表面起作用；(b)在PCR中非放射性標記的[標簽為地高辛DIG(digoxigen)、熒光素等]核苷酸和隨后用抗-DIG或抗熒光素的抗體進行檢測，這些抗體被共價連到用于ELISA的酶上，這些酶包括辣屋過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等。對于PCR-ELISA設計反應的修改包括對標記PCR擴增產(chǎn)物片段的可替代的方法及探針吸附到固體表面的檢測方法等。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了基于這個DNA序列在PCR檢測中用于區(qū)分水稻W(wǎng)A細胞質(zhì)雄性不育系和它們同源的雄性可育的保持系基礎上的含又SEQ ID NO.4和SED ID NO.5引物的方法。在這里的檢測方法是基于是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer)(FRET)的應用基礎上的，而FRET基于包括Taqman、Beacon分子等的檢測系統(tǒng)基礎上，這對于精通這個領域的人是熟悉的。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了基于這個DNA序列基礎上，用第一對含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的多重PCR檢測的方法，其與第二對寡聚核苷酸引物配合。在這里只要模板DNA是從WA細胞質(zhì)雄性不育系中而不是雄性保持系中被獲得，用第一對引物就可以獲得DNA擴增產(chǎn)物。而且，無論模板DNA是來源于一個CMS系還是一個雄性不育保持系，用第二套引物都能獲得另一個DNA擴增產(chǎn)物，第二對寡聚核苷酸引物能從第一對引物的靶區(qū)域以外的水稻基因組的任何序列部分衍生而來，另一個需要考慮的是即使當兩對引物被包含在同樣的PCR的混合物中，各個靶DNA序列的成功的擴增應該出現(xiàn)。屬于這個第二套的幾個寡聚核苷酸引物對和第一套寡聚核苷酸引物對在PCR檢測中能夠被成功的進行多重擴增反應。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了在Southern雜交檢測中用CMS特異的DNA序列區(qū)分水稻的WA細胞質(zhì)雄性不育系和它的同族的雄性保持系的方法。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測中用象微衛(wèi)星和序列標簽位點(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標記評估在水稻的細胞質(zhì)雄性不育的繁育期間，用劣種的花粉供體(即水稻的品系不是指定的保持系)和作為結(jié)果出現(xiàn)的遺傳上有雜質(zhì)的種子遠源雜交程度。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了從單一苗中分離DNA的方法。進行PCR分析，通過在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對基因型進行評估，檢測通過EB(溴乙錠)染色，銀染進行或如果一個放射性的標簽或一個非放射性的熒光標簽被結(jié)合進PCR的擴增的產(chǎn)物中可適用的檢測方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測中用象微衛(wèi)星和序列標簽位點(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標記評估在水稻的細胞質(zhì)雄性不育的繁育期間，用劣種的花粉供體(即水稻的品系不是指定的保持系)和作為結(jié)果出現(xiàn)的遺傳上有雜質(zhì)的種子遠源雜交程度的方法。在這里的DNA是從一個群體的苗中被分離的(在這個群體中具有代表性的個體數(shù)可能是100)，這些苗是通過CMS原種種子發(fā)芽而獲得的。進行PCR的分析，而且通過估計在被評估位置群體中等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度。估計在群體中等位基因頻率的方法包括通過凝膠電泳使帶有熒光標簽的PCR擴增片段的分離，以及同特定的等位基因相應的峰高的評估。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測中用象微衛(wèi)星和序列標簽位點(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標記評估在任何作物或雜種的生產(chǎn)是遵循三系的具有經(jīng)濟價值的植物的細胞質(zhì)雄性不育的繁育期間，用劣質(zhì)的花粉供體(即水稻的品系不是指定的保持系)和作為結(jié)果出現(xiàn)的遺傳上有雜質(zhì)的種子遠源雜交程度的方法。DNA是從單一的苗中分離出來的。進行PCR分析，通過在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對基因型進行評估，檢測通過EB(溴乙錠)染色、銀染進行或如果一個放射性的標簽或一個非放射性的熒光標簽被結(jié)合進PCR的擴增的產(chǎn)物中可適用的檢測方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測中用象微衛(wèi)星和序列標簽位點(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標記評估在任何作物或雜種的生產(chǎn)是遵循三系的具有經(jīng)濟價值的植物的細胞質(zhì)雄性不育的繁育期間，用劣質(zhì)的花粉供體(即水稻的品系不是指定的保持系)和作為結(jié)果出現(xiàn)的遺傳上有雜質(zhì)的種子遠源雜交程度的方法。DNA是從一個群體的苗中被分離的(在這個群體中具有代表性的個體數(shù)可能是100)。進行PCR的分析，而且通過估計在被評估的位置群體中等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度。估計在群體中等位基因頻率的方法包括通過凝膠電泳使帶有熒光標簽的PCR擴增片段的分離，以及同特定的等位基因相應的峰高的評估。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測中用象微衛(wèi)星和序列標簽位點(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標記評估水稻雜種的親本系純度的方法。在這里采用了生產(chǎn)雜交水稻的一個兩系系統(tǒng)。這些親本系包括一個雌性親本，它具有由溫度、光周期引起不育的及能夠誘導雄性配子致死的化學試劑處理的條件雄性不育性。DNA是從單一的苗中進行分離的。進行PCR分析，通過在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對基因型進行評估，檢測通過EB(溴乙錠)染色、銀染進行或如果一個放射性的標簽或一個非放射性的熒光標簽被結(jié)合進PCR的擴增的產(chǎn)物中可適用的檢測方法。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測中用象微衛(wèi)星和序列標簽位點(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標記評估水稻雜種的親本系純度的方法。在這里采用了生產(chǎn)雜交水稻的一個兩系系統(tǒng)。這些親本系包括一個雌性親本，它具有由溫度、光周期引起不育的及能夠誘導雄性配子致死的化學試劑處理的條件雄性不育性。這里要求保護的是將DNA從一個群體的苗中分離的方法(在這個群體中具有代表性的個體數(shù)可能是100)，這些苗是通過親本系發(fā)芽的種子被獲得的。進行PCR分析，而且通過估計在被評估位置群體中的等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度。估計在群體中的等位基因頻率的方法包括通過凝膠電泳使帶有熒光標簽的PCR擴增片段的分離，以及同特定的等位基因相應的峰高的評估。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測中用象微衛(wèi)星和序列標簽位點(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標記評估任何具有經(jīng)濟重要性的雜種的親本系純度的方法。在這里采用了雜交生產(chǎn)的一個兩系系統(tǒng)。這些親本系包括一個雌性親本，它具有由溫度、光周期引起不育的及能夠誘導雄性配子致死的化學試劑處理的條件雄性不育性。DNA是從單一的苗中進行分離的。進行PCR分析，通過在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對基因型進行評估，檢測通過EB(溴乙錠)染色、銀染進行或如果一個放射性的標簽或一個非放射性的熒光標簽被結(jié)合進PCR的擴增的產(chǎn)物中可適用的檢測方法。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了在PCR檢測中用象微衛(wèi)星和序列標簽位點(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標記評估任何具有經(jīng)濟重要性的雜種的親本系純度的方法。在這里采用了雜交生產(chǎn)的一個兩系系統(tǒng)。這些親本系包括一個雌性親本，它具有由溫度、光周期引起不育的及能夠誘導雄性配子致死的化學試劑處理的條件雄性不育性。這里要求保護的是DNA是從一個群體的苗中被分離的方法(在這個群體中具有代表性的個體數(shù)可能是100)，這些苗是通過親本系發(fā)芽的種子被獲得的。進行PCR分析，而且通過估計在被評估位置群體中等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度。估計在群體中等位基因頻率的方法包括通過凝膠電泳使帶有熒光標簽的PCR擴增片段的分離，以及同特定的等位基因相應的峰高的評估。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了當水稻的種子或苗及一個三系或二系的系統(tǒng)被應用于雜種的生產(chǎn)時，在PCR檢測中用象微衛(wèi)星和序列標簽位點(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標記評估雜種純度的方法。DNA是從單一的苗中進行分離的。進行PCR分析，通過在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對基因型進行評估，檢測通過EB(溴乙錠)染色、銀染進行或如果一個放射性的標簽或一個非放射性的熒光標簽被結(jié)合進PCR的擴增的產(chǎn)物中可適用的檢測方法。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了當水稻的種子或苗及一個三系或二系的系統(tǒng)被應用于雜種的生產(chǎn)時，在PCR檢測中用象微衛(wèi)星和序列標簽位點(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標記評估雜種純度的方法。DNA是從一個群體的苗中被分離的(在這個群體中具有代表性的個體數(shù)可能是100)，這些苗是通過雜種原種發(fā)芽的種子被獲得的。進行PCR分析，而且通過估計在被評估位置群體中等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度。估計在群體中等位基因頻率的方法包括通過凝膠電泳使帶有熒光標簽的PCR擴增片段的分離，以及同特定的等位基因相應的峰高的評估。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了當任何作物或有經(jīng)濟價值植物的種子或苗及一個三系或二系的系統(tǒng)被應用于雜種的生產(chǎn)時，在PCR檢測中用象微衛(wèi)星和序列標簽位點(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標記評估雜種純度的方法。DNA是從單一的苗中進行分離的。進行PCR分析，通過在瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳對基因型進行評估，檢測通過EB(溴乙錠)染色、銀染進行或如果一個放射性的標簽或一個非放射性的熒光標簽被結(jié)合進PCR的擴增的產(chǎn)物中可適用的檢測方法。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了當任何作物或有經(jīng)濟價值植物的種子或苗及一個三系或二系的系統(tǒng)被應用于雜種的生產(chǎn)時，在PCR檢測中用象微衛(wèi)星和序列標簽位點(STSs)這樣的共顯性的序列特異的DNA標記評估雜種純度的方法。DNA是從一個群體的苗中被分離的(在這個群體中具有代表性的個體可能是400)，這些苗是通過雜種原種發(fā)芽的種子被獲得的。進行PCR分析，而且通過估計在被評估位置群體中等位基因的頻率判斷雜質(zhì)的程度。估計在群體中等位基因頻率的方法包括通過凝膠電泳使帶有熒光標簽的PCR擴增片段的分離，以及同特定的等位基因相應的峰高的評估。
為詳細描述本發(fā)明，最初，PCR檢測是在單獨從構(gòu)成CMS(WA細胞質(zhì))的一套水稻品系中分離的DNA模板上進行的。保持品種和相應的雜種用寡聚核苷酸引物擴增RM9水稻微衛(wèi)星位置(McCouch等，1996.Rice GeneticsIII，Proc.Third Intl.Rice Genet.Symp.Los Banos馬尼拉，菲律賓16-20Oct.1995.國際水稻研究院，馬尼拉，菲律賓).PCR擴增片段通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，而且通過溴乙錠(EB)染色進行檢測。就象對PCR檢測所期望的一樣，RM9位點被檢測到，利用來源于所有三系的模板DNA，一個大約250bp的PCR擴增片段被觀察到(圖2)。除此之外，僅模板DNA從CMS系或雜種中獲得時，一個大約350bp的PCR擴增片段才能在此反應中被觀察到(圖2)。然而，這個片段的PCR擴增被發(fā)現(xiàn)對反應條件是高度敏感的，即使模板DNA從CMS系或雜種中獲得時，也常常觀察不到它。這表明引向RM9微衛(wèi)星位置的引物不能可靠地被用于區(qū)分CMS系和保持系。我們認為這種重復性的缺乏出現(xiàn)是由于在RM9引物和含有CMS細胞質(zhì)的品系的靶序列中不能完好地配對。
隨后，在圖2中表明的CMS系特異的PCR擴增的片段(大小為325bp)被純化，而且通過應用來源于RM9位置的正向和反向的寡聚核苷酸引物在DNA自動測序儀上進行核苷酸序列的確定。被確定的PCR核苷酸序列如圖3所示。
用BLAST計算程序通過國家生物技術(shù)信息中心(Bethesda，Maryland，USA)的網(wǎng)點，在GenBank DNA數(shù)據(jù)庫中進行同源DNA序列的查詢[Altschul等，1997.核酸研究(Nucleic Acid Res.)253389-3402]。所述DNA序列同數(shù)據(jù)庫中的特定的記載[登記號#D21251；日本的DNA數(shù)據(jù)庫(DBJ)，在這作為一個參考]是高度同源的。這個記載來源于基因組區(qū)域的水稻(Oryza sativa)線粒體的一個序列，其編碼核糖體蛋白S3、L16、S12及NADH脫氫酶的亞單位3。這里所說的DNA序列同水稻線粒體DNA同源的程度如圖4所描述的。很清楚，除了在登記號#D21251所描述的水稻線粒體DNA缺乏的一段DNA序列[同核苷酸序列ACGGCCCTCATCACCTTCTTTCACTTTTTGTTTTTG(SEQ ID No.3)相應的]外，區(qū)域是高度同源性的。
被用在PCR檢測中區(qū)分水稻CMS(WA)和保持系的一對寡聚核苷酸引物是以這個序列為基礎被設計的(表2在描述的末尾進行了表明)。其中一個引物(正向引物)是以對CMS系(圖3)特異的序列為基礎的，而另一個引物(反向引物)是基于核糖體蛋白S3基因的基因組的上游區(qū)域的水稻的線粒體DNA，其位于核苷酸#s1362和1384之間，如DBJ登記號#D21251所表明的，寡聚核苷酸引物[正向引物5’-ACTTTTTGTTTTTGTGTAGG-3’(SEQ ID No.4)；反向引物5’-TGCCATATGTCGCTTAGACTTTAC-3’(SEQ ID No.5)]被用在以來源于水稻CMS系和保持系的模板DNA進行PCR檢測，這些模板DNA被列在表1中(如描述的末尾所示)。
當模板DNA是從CMS系(IR 58025 A，IR 62829 A，PMS 8A，PMS 10A，78897 A)分離的，利用引物SEQ ID No.4和SEQ ID No.5作為引物，可獲得一個PCR擴增的325bp的產(chǎn)物(圖5)，而當模板DNA來源是保持系時(IR 58025 B，IR 62829 B，PMS 8B，PMS 10B，78897 B)卻不能得到。在這個測試的進一步的證據(jù)中，一個編碼實驗在從35種不同的水稻植物中提取的基因組DNA中進行的，它們中有15種是CMS系的IR 58025A，20種是保持系的IR 58025B。在不了解這35種植物那些是CMS系，那些是保持系的情況下，進行PCR檢測。這個檢測被精確地用于預測35種不同植物的每個基因型，表明了PCR檢測作為區(qū)分水稻CMS和保持系方法的可應用性。
這里所說的CMS特異的PCR擴增片段是用α32p-dATP放射標記的。從同族的成對的CMS(IR 58025A和IR 62829A)和保持系(IR 58025B和IR 62829B)被分離的基因組DNA用不同的限制酶消化，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，和放射性標記的探針雜交(如Sambrook等，1989，ColdSpring Harbor，NY，USA)。圖6表明在水稻CMS(WA)系和保持系間的一個限制性片段長度的多態(tài)形，它通過用探針及EcoR V限制性酶被檢測到的。用上述提到的探針-酶聯(lián)合對來源于水稻CMS和保持系的線粒體DNA的純化及RFLP分析揭示了同那個可檢測在線粒體DNA中多態(tài)性相似的一個多態(tài)性的證實。
多重PCR檢測被發(fā)展用以區(qū)分水稻的CMS和保持系。在這個檢測中，用在上面提到的PCR檢測中的第一套寡聚核苷酸引物和屬于第二套寡聚核苷酸引物進行多重復合。這個第二套寡聚核苷酸引物或是以從正在進行的國際水稻基因組計劃(公共可用的就象在GenBank登記號#AP001859，在這里引入作為參考)的一部分獲得的水稻的染色體I上的一段序列為基礎的，或在DBJ中登記號為#D21251可用的水稻線粒體DNA序列為基礎的。第二套引物被這樣設計，因此屬于第二套中的任一引物對都可被加到含有屬于第一套寡聚核苷酸引物的引物的PCR檢測的混合物中，而不會影響通過第一套寡聚核苷酸引物擴增CMS特異的DNA片段。在這個多重PCR檢測中，無論模板DNA是來源于一個CMS系還是來源于一個保持系(圖7)，第二套寡聚核苷酸引物擴增一個特異的DNA片段。當從CMS和保持系中獲得一個PCR擴增的片段時，第二套引物作為影響PCR結(jié)果的外在的因素(象PCR的抑制劑，模板DNA的質(zhì)量不好等)的對照。第二套寡聚核苷酸引物，它們在水稻基因組上的位置及通過用這些引物擴增的DNA片段的大小在表2中被表明了(在描述的末尾所示)。
微衛(wèi)星(也稱單序列重復或SSRs)是簡單的，一前一后重復的二至四-核苷酸序列的基元，它位于一個獨特的序列的側(cè)翼。微衛(wèi)星是豐富的，而且很規(guī)則地分散在水稻(McCouch等1997)及其它作物的基因組中(Powell等，1996，Trends Plant Sci.1215-222)。因為微衛(wèi)星是共顯性的，可以檢測高水平的等位基因的多樣性，且能通過PCR進行有效的檢測，所以它作為遺傳標記很有價值。目前通用的被微衛(wèi)星提供的水稻中基因組寬度的覆蓋水平為每6cM一個(Temnykh等，2000.Theor.App.Genet.100697-712)對于評估雜種純度和基因型的確定是充分有用的。同微衛(wèi)星相似的是STS，一個STS是一段短的DNA序列，它可以通過PCR進行檢測，而且在基因組中可以作為一個地標對特定的位點做圖譜。在水稻中作圖譜的一些STSs是多態(tài)的(Ghareyazie等，1995.Theor.Appl.Genet.91218-227；Robenoil等，1996.Inkhush，G.S.(ed)Rice Genetics III，Proc.Third Intl，Rice Genet，Symp，Los Banos馬尼拉，菲律賓，16-20 Oct.1995.國際水稻研究院，馬尼拉，菲律賓)。
水稻CMS系的繁育規(guī)定最小的隔離距離是300米[Virmani，1993.雜交水稻在農(nóng)藝學方面的進展(Hybrid Rice Advances in Agronomy)57377-462]，也就是在這個隔離距離內(nèi)除了保持系的水稻以外，沒有水稻系應被培育。這是基于來源于這個距離以外的正在生長的水稻的植株的花粉不能傳粉給CMS系的觀察的基礎上的。在偶然的情況下，這個最小的隔離距離或是由于沒有被嚴格的遵守或是由于當?shù)氐臈l件(象風流和天氣)有可能允許花粉被轉(zhuǎn)移到300米以外的正在生長的植物上。
CMS系同來源于生長在大田附近的水稻品系(保持系除外)的劣質(zhì)花粉的雜交授粉的程度，可以通過微衛(wèi)星和STS標記進行評估，這兩種方法在這些水稻品系和CMS系間具有多態(tài)性。這些多態(tài)性的標記可用來源于有潛在的生產(chǎn)能力的供體系(一個具有代表性的情況是1-3個系)和CMS系中的任一個的模板DNA通過PCR、瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色鑒定。一個優(yōu)選標記是一個能夠檢測來源于這些劣質(zhì)系任一個的雜交授粉。來源于雜交授粉的植物在雜合性存在的情況下將用這樣的標記檢測[即在兩個大小不同的DNA片段存在的情況下，這兩個片段中的一個是被雌性(CMS)親本提供的，而另一個是由雄性的親本提供的(劣質(zhì)花粉供體)]。和這種情況形成對照的是，如果授粉象我們希望的那樣出現(xiàn)，且花粉來源于保持系，那么純合子(以單個的DNA片段存在的)將在后代中被觀察到，這是因為CMS和保持系相互是等同細胞核的，意味著除了細胞核DNA標記外，它們在實質(zhì)上是完全相同的。DNA分離、PCR及瓊脂糖凝膠電泳的程序如實施例9所描述的一樣。
這種檢測的修改方法也在實施例9中被描述了，其中的DNA是從屬于CMS原種的苗(從100或更多的種子庫中獲得的)的群體中獲得的葉片中分離的。用于檢測多態(tài)性標記的引物中的一個在5’末端用象熒光素、若丹明、和其它的這樣的染料染色標記，它們可以用象ABI 377 DNA測序儀的基因描掃設備或?qū)@個領域熟悉的人來講所知道的其它相似的儀器，隨后的PCR或電泳被檢測到。通過這種檢測，雜交授粉的程度可以通過測量每個峰的高度進行檢測(每個峰的具有一個等位基因特性)，就象通過儀器進行檢測一樣。如果僅有一個峰被檢測到(相對應于一個等位基因)，那么CMS種子的樣品能被認為是100％純的。通過在樣品中出現(xiàn)多個等位基因(峰)，檢測雜質(zhì)。雜質(zhì)的峰高(被劣質(zhì)種子供體提供給群體的等位基因)和期望峰高(具有CMS系特性的等位基因)的比率表明了曾出現(xiàn)在隨后的用劣種花粉供體的雜交授粉的CMS原種中的種子的頻率。
盡管本申請如前面所表明的一樣是用于評估出現(xiàn)在水稻CMS系的繁育期間的遠源雜交的程度的，一個相似的方法能被用于評估出現(xiàn)在其它作物CMS系的繁育期間的遠源雜交的程度，這些作物非限制性包括玉米、珍珠谷子、高梁、麥子、太陽花、芥子、卷心菜、花椰菜、西紅柿、胡椒、秋葵等。在這里，CMS系用于雜種的生產(chǎn)，而且適當?shù)奈⑿l(wèi)星或STS標記是可用的。
種子純度的評估是雜交水稻程序的一項重要質(zhì)量控制成分。在傳統(tǒng)上這是通過生長測試(GOT)完成的，它(GOT)是基于在生長到成熟(Ref)的植物上的形態(tài)的或花的特性的評估的基礎上的。對于種子工業(yè)來講，大量資金因為延長的周期以貯存的雜種種子形式被擱死，同時等待著GOT的結(jié)果。以檢測基礎上的DNA取代GOT為目標，用微衛(wèi)星和序列標簽位點(STS)多態(tài)性，水稻細胞質(zhì)雄性不育(CMS)、恢復和雜交系被篩選以用于區(qū)分。這些共顯性多態(tài)性在PCR、瓊脂糖凝膠電泳、溴乙淀染色后被鑒定。這個方法的原理是雜種將是雜合的(即兩個親本的等位基因?qū)⒃陔s種中出現(xiàn))，當用在親本系間具有多態(tài)性的微衛(wèi)星或STS標記評估基因型時(即檢測在兩個親本上的一個不同的等位基因)，用3天齡的水稻苗進行DNA分離、檢測雜合性及純度的一個簡單程序已被標準化(如下所描述)，而且已被用于在雜種種子組中雜質(zhì)的檢測(實施例10)。盡管多重多態(tài)性的標記能被用于(或是單獨地或是多重地)評估種子純度，但是考慮到花費上的原因，建議一個單一的適當選擇的微衛(wèi)星標記足以評估雜種種子純度。
這個檢測的一個修改也是在實施例10中被描述，其中DNA是從屬于雜種種子原種的400棵小苗(從400粒種子庫中獲得的)群體的葉片中被分離的用于檢測多態(tài)性標記物中一個在5’末端用象熒光素、若丹明和其它染料這樣的熒光標簽進行標記，這些熒光標簽標記可用象ABI 377 DNA測序儀的基因掃描設備的儀器或熟悉這個領域的人所知道的其它儀器在隨后的PCR和電泳在被檢測到。通過這個檢測，純度可以通過測量期望的兩個峰中每一個高度檢測，這兩個峰(每個峰代表被一個親本提供的等位基因)具有可通過儀器檢測的雜種特性。在PCR檢測中，用從一個單一雜種植物中分離的基因組DNA做一個模板，峰高被期望是相等的，產(chǎn)生了1∶1的比率(或50∶50)。在PCR檢測中，用從400株苗的群體中分離的基因組DNA作為一個模板，任何兩個峰高度的1∶1的比率(50∶50)的偏離都將是在雜種種子原種中雜質(zhì)程度的指標。峰高比率為1.02∶0.98(51∶49)將和一個98％純度的雜種種子原種的樣品對應，峰高比率為1.1∶0.9(55∶45)將和一個90％純度的雜種種子原種的樣品對應。
用于評估雜種種子純度的方法在認真考慮后應被仔細地篩選。生長在鄰近大田的品種作為一個有潛在生產(chǎn)能力花粉供體或在CMS系繁育期間(在這里僅保持系應是一個花粉供體)或在雜種生產(chǎn)期間(在這里僅恢復系應是一個花粉受體)起作用。如果授粉是通過劣種花粉供體進行的(即既不是保持系也不是恢復系的品系被發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)的情況下)，而且那個劣種供體對應于所選擇的微衛(wèi)星或STS標記在CMS系是中具有多態(tài)性，那么雜合性即使在我們想要的雜種不存在的情況下也可以被觀察到，因此，篩選用于評估雜種純度的標記應在CMS系和有潛在生產(chǎn)能力的花粉供體之間是單態(tài)性的，而不應在CMS系和恢復系之間有多態(tài)性。那么我們期望的雜合性的檢測將是雜種種子生產(chǎn)的一個指標。這些特異的標記在用或微衛(wèi)星或STS標記于CMS，恢復系和有潛在生產(chǎn)能力的劣種的供體系中所進行的多態(tài)性測量中被鑒定。對于以前熟知這一個領域的人說，這些多態(tài)性標記的檢測并不困難，因為目前有大量的微衛(wèi)星標記對水稻是適用的(Temnykh等，2000)。
DNA標記檢測從速度和準確度角度來講優(yōu)于GOT，而且它的應用在種子工業(yè)上將引起相當大的節(jié)省。盡管這個方法被標準化了，用于評估如圖1所描述的那種類型的通過三系培育系統(tǒng)生產(chǎn)水稻雜種的純度，它也可用于評估通過兩系培育系統(tǒng)獲得的水稻雜種的純度。在這個兩系培育系統(tǒng)中，一個條件型的雄性不育系通過生長在誘導雄性不育的條件下，被用做雜種生產(chǎn)的雌性親本。當生長在不會誘導雄性不育的條件下，該系可通過自我授粉繁殖。因此，可以避免對細胞質(zhì)雄性不育和保持系的需要。兩系培育系統(tǒng)總的說來處于實驗階段(除了在中國有一個小的規(guī)模)，然而，即使對于雜種種子生產(chǎn)的兩系系統(tǒng)，評估雜種種子純度的方法也將和三系培育系統(tǒng)所描述的那樣是相同的。在這種情況下，區(qū)分雌、雄性親本(而不是CMS和恢復系)的微衛(wèi)星和STS多態(tài)性將象前述的一樣被鑒定及應用。
盡管這個方法是用于評估水稻雜種的純度的標準化的方法，它也能被用于評估任何其它作物中雜種的純度，這些作物非限制性包括玉米、珍珠谷子、高梁、麥子、太陽花、芥子、卷心菜、花郁菜、西紅柿、胡椒、秋葵等，對于它們合適的微衛(wèi)星和STS標記也是可用的。人們期望這個檢測方法(或由此所做的修改對于熟知這一領域的人是明顯的)在雜交種子質(zhì)量控制程序中發(fā)現(xiàn)廣泛的應用。用這個過程進行種子試驗的農(nóng)民也將獲利，因為他們正在得到一個適合的真正的產(chǎn)品。
具體實施例方式
實施例1從水稻CMS和保持系進行基因組DNA的分離水稻基因組DNA的分離用或是被(a)Kochert等(1989)RockefellerProgram on Rice Biotechnology，Cornell Univ.，New York，USA描述的程序或(b)Chunwongse等(1993)Theor.Appl.Genet.86694-698的程序，有稍微改動(a)簡要的，用Kochert等的分離程序如下5-10g來源于20天齡的溫室中生長的植物的葉片在一個液態(tài)氮的研缽和杵中被研磨至到形成一個均勻的粉末，不要讓粉末解凍。樣品然后被轉(zhuǎn)到抗氯仿的50ml試管中(聚丙醇試管)，試管中含有預先溫熱到60℃的25ml提取緩沖液[420g尿素，70ml 5M NaCl，50ml 1M Tris-HCl pH8.0，80ml 0.25M EDTA，200ml10％SDS 50ml苯酚試劑，用滅過菌的重蒸水(double distilled water)定容到1L]。用玻璃棒攪拌不要形成任何的塊狀物，加入0.750ml的20％的十二烷基苯磺酸鈉，混合好。這個混合物在60℃溫育10分鐘，同時不時有規(guī)律地上下倒置混勻。冷卻到室溫，加15ml氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻得到一個乳液。試管被離心而分成水和氯仿相，用吸移管將上層水相移到一個新鮮的50ml試管中，將2/3體積的異丙醇加到最終的水相中，顛倒混合直到DNA開始聚集。DNA被沉淀析出并轉(zhuǎn)移到一個含有70％乙醇的新鮮的試管中。DNA通過離心而成粒狀沉淀并在倒掉乙醇后于真空干燥器中被吸干。DNA被溶解在TE中(Tris-HCl 10mM pH8.0，EDTA 1mM pH8.0)。
(b)應用Chunwongse等(1993)進行DNA分離的程序如下種子在培養(yǎng)皿濕潤的濾紙上在黑暗中28℃下發(fā)芽。三天齡的苗用一個杵在一個1.5ml的含有200μl提取緩沖液的試管中單獨地被搗碎，此緩沖液由5％W/V chelex-100(Bio-Rad實驗室、美國)在無菌蒸餾水中組成。組織勻漿在95℃中溫育10分鐘，于12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘。10-15μl上清液被用于每個PCR反應。
實施例2從水稻CMS和保持系中分離線粒體DNA線粒體DNA根據(jù)Saleh等，(1989)Theor.Appl.Genet.77617-619的程序從CMS和保持系中分離。表面消過毒的種子在溫室中發(fā)芽生長14天。這些植物然后在黑暗中被保存3天，以使植株褪色發(fā)白。這一步之后，所有的實驗均在4℃條件下進行。收集來源于14天齡植株的20g葉片并將其切成小片。葉片在一個100ml緩沖液A的研缽和杵中被勻漿。緩沖液A(10mM TES pH7.2，0.5M甘露糖醇，0.2％BSA，0.05％半胱氨酸。組織勻漿通過4層的奶酪布過濾，在5000rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，收集上清液。粒狀沉淀被輕輕重懸浮在30ml的緩沖液A中，再于5000rpm下離心10分鐘?；旌仙锨逡海?2000rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，收集粒狀沉淀。將上清液再一次在12000rpm下離心10分鐘，混合兩次粒狀沉淀。該沉淀在緩沖液A中重懸浮而且于5000rpm下離心10分鐘，收集上清液。1M MgCl2和10mg/ml新配制的Dnase I(在0.15M NaCl和50％甘油中)加到使終濃度為10mM的MgCl2和10μg DNase/g新鮮的葉片組織按時，4℃溫育1h。一個蔗糖梯度是用緩沖液B(10mM TES pH7.2，20mM EDTA，0.6M蔗糖)和2ml線粒體懸浮液被加到每個試管中形成的。于16000rpm下離心10分鐘，粒狀沉淀在4ml緩沖液C(50mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTApH8.0，2％肌氨酰，100μg/ml蛋白酶K)中被重懸浮，并在37℃的水浴搖床(Jolabo，德國)中溫育2小時，同時進行輕輕攪拌。裂解液用0.2M乙酸銨補足，而且用3個循環(huán)的苯酚-氯仿抽提進行純化。用95％乙醇洗滌沉淀顆粒，再用70％乙醇洗滌。在真空中干燥沉淀顆粒，DNA溶解在TE中，用RNA酶(Rnase A)處理，-20℃下保存。
實施例3對水稻CMS系特異的DNA序列的確定所用的引物對于水稻RM9微衛(wèi)星位置的寡聚核苷酸引物(McCouch等，1996.Rice Genetics III，Proc.Third Intl.Rice Genet.Symp.LosBanos馬尼拉，菲律賓16-20 Oct.1995.國際水稻研究院，馬尼拉，菲律賓)。
正向5’-CAAAAACAGAGCAGATGAC-3’(SEQ ID No.6)反向5’-CTCAAGATGGACGCCAAGA-3’(SEQ ID No.7)引物被Oswel DNA Service，Southamton，U.K合成的。聚合酶鏈式反應(PCR)條件如McCouch等，[(1996).Rice Genetics III，Proc.ThirdIntl.Rice Genet.Symp.Los Banos馬尼拉，菲律賓16-20 Oct.1995.國際水稻研究院，馬尼拉，菲律賓]的略帶修改的描述。簡言之，PCR是在含有50-100ng模板DNA，每個引物5pmol，200μM(每)脫氧核糖核苷酸，50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，0.01％明膠和1個單位的Taq聚合酶的25μl反應體系中進行的。PCR條件是95℃，7分鐘(為初變性)，接著是94℃下變性1分鐘，55℃下退火1分鐘，72℃下延伸2分鐘這樣三個重復步驟組成一個循環(huán)，共進行35個這樣循環(huán)，最后在72℃下延長5分鐘。樣品在4℃下貯存，備下一步使用。PCR產(chǎn)物的檢測是通過在1％或2％的瓊脂糖凝膠上分離、電泳、溴乙錠染色，以便在紫外燈下可見DNA片段來進行的。
PCR是用一個保持系、CMS系和同族的雜種進行的。除希望的由RM9引物擴增DNA片段外，僅在CMS系和雜種中觀察到了一個額外的條帶，但在保持系中沒有觀察到(圖2)。
實施例4對水稻CMS系特異的核苷酸序列的確定用RM9引物，PCR是在含有50-100ng模板DNA，每個引物5pmol，200μM(每)脫氧核糖核苷酸，50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，0.01％明膠和1個單位的Taq聚合酶的25μl反應體系中進行的。PCR條件是95℃，7分鐘(為初變性)，接著是94℃下變性1分鐘，55℃下退火1分鐘。72℃下延伸2分鐘這樣三個重復步驟組成一個循環(huán)，共35個這樣循環(huán)，最后在72℃下延長5分鐘。在4℃下貯存，備下一步使用。擴增的PCR產(chǎn)物被分離在瓊脂糖凝膠上、被溴乙錠染色并且其在紫外燈下可被觀察到。對CMS系(圖2)特異的大約350bp的DNA序列從凝膠上切下用Qiaquick凝膠提取試劑盒(Qiaquick Gel Extraction Kit)(Qiagen，德國)根據(jù)操作指南進行純化，純化后DNA的用自動DNA測序儀ABI 3700(ABI，F(xiàn)oster City，USA)排序，所獲得序列如圖3所示，在GenBank中對DNA同源性查詢表明(圖4)這個序列大多數(shù)和水稻線粒體體DNA(DBJ，登記號#D21251)一個區(qū)域有同源性。然而，這個序列有一小部分同水稻線粒體DNA并沒有呈現(xiàn)任何同源性。
實施例5
用于PCR檢測區(qū)分水稻CMS和保持系的特異的寡聚核苷酸引物的設計PCR引物設計是基于用在實施例4所描述的程序獲得的序列信息基礎上的。一個引物是以那個序列的一部分為基礎的，這個序列對于CMS系是獨有的(圖3中1-36的堿基位置)，而另一個引物是以水稻線粒體DNA序列為基礎的，這個引物是正向5’-ACTTTTTGTTTTTGTGTAGG-3’(SEQ ID No.4)反向5’-TGCCATATGTCGCTTAGACTTTAC-3’(SEQ ID No.5)實施例6用于區(qū)分水稻CMS和保持系的PCR檢測用實施例6中描述的引物對，PCR在以CMS和保持系做為模板DNA的25μl反應體系中進行的。反應組成為50-100ng模板DNA、1X PCR緩沖液(50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，0.01％明膠)、200μM(每)脫氧核糖核苷酸(dNTP)、1個單位的Taq聚合酶、每個引物5pmol。PCR條件是在95℃下進行7分鐘的初變性，接著是94℃下變性30秒、44℃下退火1分鐘、72℃下延伸2分鐘這樣三個重復步驟組成一個循環(huán)，共進行35個這樣循環(huán)，最后在72℃下延長7分鐘。樣品在4℃貯存，備下一步使用。PCR產(chǎn)物是在1％瓊脂糖凝膠上被分離、DNA條帶用溴乙錠染色，且在紫外燈下可見。用這個引物對，在CMS系中有一個350bp的DNA片段的擴增，但在保持系中(圖5)沒有觀察到PCR擴增。
實施例7用CMS特異的PCR擴增的DNA片段作為探針對區(qū)分CMS和保持系的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)檢測的DNA-DNA雜交檢測如實施例1(a)所描述的那樣，從水稻的IR 58025A(CMS)和IR 58025B(保持系)分離的基因組DNA用各種各樣的限制性酶即EcoR I、Hina III、Dra I、EcoR V、Hinc II、Sau96 I、Taqα I(New England BiolabsInc.，MA，USA)消化。來源于CMS和保持系的消化完全的3-4mg的DNA在0.7％的瓊脂糖(Sigma，USA)凝膠上電泳分離、變性、中和和真空轉(zhuǎn)移到Hybond N(Amersham Life Science，Buckinghamshire)膜上，這是按照由Sambrook等(1989)Cold Spring Harbor，NY，USA.提供的程序進行的。用一個紫外(UV)Stratalinker(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，DNA被雜交連到膜上。印跡在0.5M磷酸鈉(pH7.2)、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1％的牛血清蛋白、1mM的EDTA溶液中，于65℃預雜交3小時。用一個隨機引物標記試劑盒(JONAKI-BRTT，Mumbai，印度)，按照制造商所描述的方法，用α32P-dATP標記探針(SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5的PCR擴增產(chǎn)物)，于65℃下保持18小時，同時進行不斷的搖蕩。印跡在65℃下，用2×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)、0.1％SDS、5mM磷酸鈉(pH7.0)沖洗3×20分鐘，再用0.5×SSC、0.1％SDS和3mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)沖洗3×20分鐘。在-70℃下，通過暴露印跡于X-射線的膠片進行發(fā)射自顯影。作為一個圖解，用限制酶EcoR V所獲得的RFLP在表6中被描述。
實施例8區(qū)分水稻CMS和保持系的多重PCR檢測我們已研究開發(fā)了一種多重PCR檢測，其中第一套寡聚核苷酸引物(如在表2描述的末尾所示)能和屬于第二套寡聚核苷酸引物(表3)的任一個引物對在一個單PCR中進行成功的多重復合以區(qū)分CMS和保持系。
用來源于CMS系的DNA模板作為一個靶，第一套引物可以擴增一個325bp的片段，但是用來源于保持系的基因組DNA作為一個靶不能獲得擴增的產(chǎn)物。無論靶DNA是來源于CMS系還是來源于保持系，屬于第二套寡聚核苷酸引物的任一引物對將擴增出一單一片段。這個程序敘述如下在公共領域(GenBank)可用的水稻基因組序列被下載，而且引物是基于這些序列的基礎上被設計的。一個引物對是以水稻1號染色體的序列為基礎的(登記號#AP001859；在數(shù)據(jù)庫序列的1372和2598的位置)。寡聚核苷酸引物的序列如下正向5’-AACACAAGGGACAGCACATTGAGC-3’(SEQ ID No.8)反向5’-GAAAGAGGAGCTAGAGGTGGGTGC-3’(SEQ ID No.9)這一引物產(chǎn)生了一個1.1kb的PCR擴增產(chǎn)物。其它的兩個引物對是以數(shù)據(jù)庫中水稻線粒體DNA(登記號#D21251)序列為基礎設計的，其在序列的4981和5641位置之間是SEQ ID No.10和SEQ ID No.11，在序列的6660和7303位置之間的是SEW ID No.12和SEQ ID No.13。
(1)正向5’-GGGCAATTCCATCGTGCTATGAGC-3’(SEQ ID No.10)反向5’-GCGTTGGGTTTTCCAACGAAAAAC-3’(SEQ ID No.11)這一引物對產(chǎn)生了一個660bp的PCR擴增產(chǎn)物。
(2)正向5’-CAGGCGAAGGTCATAATTCGCAGG-3’(SEQ ID No.12)反向5’-CGAAGAAGGCAGTCTTGCTTCCTC-3’(SEQ ID No.13)這一引物對產(chǎn)生了一個600bp的PCR擴增產(chǎn)物。
這三個引物對中的每一個單獨地與表2(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)中所說明的寡聚核苷酸引物混合，在一個PCR中進行多重擴增，所用的條件如下50-100ng的模板DNA，1×PCR緩沖液(50mM KCl，10mMTris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，0.01％的明膠)，200μM dNTP(每一種)，一個單位的Taq聚合酶，來自于表2的引物(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)每個5pmol，來自表3任一引物對的每個引物1pmol。PCR反應的條件如下95℃、初始變性7分鐘；接著94℃下30秒、44℃下1分鐘、72℃下2分鐘這樣的一個循環(huán)，共進行35次；在72℃最后延伸7分鐘，樣品儲存于4℃，備下一步用。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上進行分離，DNA條帶用溴乙錠染色并且在紫外燈下可見。如圖7所描述的一樣，僅當模板DNA來源于CMS系時，用引物SEQ ID No.4和SEQ ID No.5擴增才能得到一個325bp的片段。無論模板是來源于CMS還是保持系，用在表3(SEQID No.8和SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SFQ ID No.13)中的引物對中的每一個都可擴增一個特異的DNA片段。因此，在多重PCR檢測中，當模板是來源于CMS系時，有兩個DNA片段被觀察到；當模板是來源于保持系時，僅有一個單的DNA片段被獲得。在表7中(第2泳道，第3泳道)展示了用對CMS特異的單一的引物對(SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5)進行PCR的例子和用引物對SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5和SEQ ID No.8和SEQ ID No.9(第4、5泳道)進行多重PCR的例子。
實施例9用于由于和劣種花粉供體雜交授粉而出現(xiàn)的CMS系中雜質(zhì)檢測的PCR檢測如實施例1(b)所描述的一樣，通過CMS原種種子發(fā)芽得到的100株3天齡的幼苗，從這些幼苗中進行基因組DNA的分離。通過用可以靶向大量的用于檢測CMS系和劣質(zhì)花粉供體之間的多態(tài)性的微衛(wèi)星標記中的任何一個的寡聚核苷酸引物，PCR如實施例7中所描述的一樣被操作(隨每個來源的引物不同，循環(huán)條件有一些改動)。PCR以后，產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進行分離，通過溴乙錠染色進行檢測。如果DNA是來自于CMS系，一個單個的條帶就可以被觀察到，但是如果來自于劣種花粉供體的雜交授粉已出現(xiàn)，那么除了CMS特異的帶，還有一個額外的條帶(劣種花粉供體)將被觀察到。
用于由于和劣種花粉供體雜交授粉而出現(xiàn)的CMS系中雜質(zhì)檢測的PCR檢測也可從通過CMS原種種子發(fā)芽得到的100株幼苗庫分離的DNA進行。切除100株生長到15天的CMS的水稻苗中的每一株的第二片葉片頂部2cm，然后在這個區(qū)域以下切下一個1cm長的葉片。收集從所有植株切下的葉片，按照Kochert等(1989)的程序如實施例1所述分離基因組DNA。按標準程序用熒光染料標記引物對(正向或反向)中的一個的5’末端。用熒光標記的引物進行PCR反應，通常如實施例7中所描述的一樣。循環(huán)條件根據(jù)所用的引物而變化。重點要提到的是，所用的模板DNA應僅僅是2-3ng，而且應該用AmpliTaq Gold酶(ABI，F(xiàn)oster City，USA)。PCR后，取1μl的PCR產(chǎn)物和上樣(loading)染料[甲酰胺和右旋蘭(Bluedextron)為5∶1的比率]和1.5μl的標記(ABI，F(xiàn)oster City，USA)混合。加熱變性，加1.5μl在自動DNA測序儀377中(ABI，F(xiàn)oster City，USA)。在凝膠上進行電泳直到條帶被很好的分離。用基因掃描分析儀(ABI，F(xiàn)oster City，USA)分析由條帶產(chǎn)生的峰高。
實施例10檢測水稻雜種純度的PCR檢測從來源于CMS系IR 58025A、恢復系IR40750和這兩個親本的雜種(DRR H1)中按實施例1(b)所述分離基因組DNA。用微衛(wèi)星標記RM164[正向5’-TCTTGCCCGTCACAGCAGATATCC-3’(SEQ ID No.14)，反向5’-GCAGCCCTAATGCTACAATTCTTC-3’(SEQ ID No.15)](Wu和Tanksley，1993，Mol.Gen.Genet.241225-235)。兩個親本間在這個位置的多態(tài)性可以觀察到。PCR的條件是DNA樣品(50ng)在含有1×PCR緩沖液[10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％的明膠]，每一種dNTPs(AmershamPharmacia Biotech，Sweden)0.2mM，每種引物10pmol，一個單位的Taq聚合酶的25ml反應體系中進行。于95℃下初始變性7分鐘，接著進行94℃下1分鐘、55℃下1分鐘、72℃下2分鐘這樣的一個循環(huán)，共進行35個循環(huán)，在72℃最后延伸7分鐘，樣品儲存于4℃，備下一步用。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上被分離，用溴乙錠染色且紫外燈下觀察可見。用SEQ IDNo.14和SEQ ID No.15做引物進行的PCR的結(jié)果如圖8所示。真正的雜種呈現(xiàn)兩個DNA片段，一個片段是由恢復親本提供的，另一個片段是由CMS親本提供的。非正常型呈現(xiàn)了一個和親本中任一個DNA條帶共轉(zhuǎn)移的單個的片段(圖8)。在圖8中，非正常型和CMS的DNA條帶的共轉(zhuǎn)移表明這個特定的雜種群被IR 5802A(CMS)污染了。在這個實驗中所用的微衛(wèi)星的例子證明的僅僅是被用于檢測水稻雜種純度的許多個微衛(wèi)星標記中的一個例子。
檢測水稻雜種純度的PCR方法可以在一個集合的樣品中被完成。讓從雜種原種種子發(fā)芽得到的400株幼苗生長到15天，切除每一株第二片葉片頂部2cm，然后在這個區(qū)域以下切下一個1cm長的葉片。收集從所有植株切下的葉片，按照Kochert等(1989)的程序如實施例1所述分離基因組DNA。按標準程序用熒光染料標記引物對(正向或反向)中的一個的5’末端。用熒光標記的引物進行PCR反應，通常如實施例7中所描述的一樣。循環(huán)的條件根據(jù)所用的引物而變化。重點要提到的是，所用的模板DNA應僅僅是2-3ng，而且應該用AmpliTaq Gold酶(ABI，F(xiàn)oster City，USA)。PCR后，取1μl的PCR產(chǎn)物和上樣(loading)染料[甲酰胺和右旋(Blue dextron)為5∶1的比率)和1.5μl的標記(ABI，F(xiàn)oster City，USA)混合。加熱變性，加1.5μl在自動DNA測序儀377中(ABI，F(xiàn)osterCity，USA)。在凝膠上進行電泳直到條帶被很好的分離。用基因掃描分析儀(ABI，F(xiàn)oster City，USA)分析由條帶產(chǎn)生的峰高。
通過這個檢測，純度可以通過測量期望的兩個峰中每一個高度來檢測，這兩個峰(每個峰代表被一個親本提供的等位基因)具有可通過儀器檢測的雜種特性。在PCR檢測中，用從一個單一雜種植物中分離的基因組做一個模板，峰高被期望是相等的，產(chǎn)生了1∶1比率(或50∶50)。在PCR檢測中，用從400株苗的群體中分離的基因組DNA作為一個模板，任何兩個峰高度的1∶1(50∶50)的偏離都將是在雜種種子原種中雜質(zhì)程度的指標。峰高比率為1.02∶0.98(51∶49)將和一個98％純度的雜種種子原種的樣品對應，峰高比率為1.1∶0.9(55∶45)將和一個90％純度的雜種種子原種的樣品對應。
最后，可以這樣說，本發(fā)明提供了確保親本品系純度的方法，這個方法是確保水稻雜種純度的必要的先決條件。用在三系培育系統(tǒng)進行雜交水稻生產(chǎn)的細胞質(zhì)雄性不育系常常被等同細胞核的保持系所污染。在本發(fā)明中報告的一個DNA序列對于水稻線粒體DNA是同源的，但是它是水稻W(wǎng)A細胞質(zhì)雄性不育系所特有的。在一個聚合酶鏈式反應(PCR)中，用基因組的總的DNA作為模板，基于上述的DNA序列的基礎上的寡聚核苷酸引物從水稻的細胞質(zhì)雄性不育系擴增一個片段，但不能從與它同族的保持系中擴增這個片段，這表明這個PCR檢測能被用于檢測在CMS系原種種子中的保持系的雜質(zhì)。對含有CMS和保持系的混合的植物樣品進行的編代碼實驗中，這個PCR檢測被用于正確預測這些植物的基因型。在Southern雜交分析中，用這些寡聚核苷酸引物獲得的PCR擴增片段檢測在CMS系和保持系間的多態(tài)性。本申請描述了用象微衛(wèi)星和序列標簽位點多態(tài)性這樣的共顯性的PCR可檢測的標記檢測在CMS系繁育期間污染的雜交授粉方面的應用，此外還描述了用此標記評估水稻雜種純度。
表1.水稻系分析研究*CMS系IR 58025 AIR 62829 APMS 8APMS 10A78897 A保持系IR 58025 BIR 62829 BPMS 8BPMS 10B78897 B恢復系IR40750雜種DRRH1(IR 58025A×IR 40750)*在本研究中所使用的所有水稻系的提供單位為水稻研究理事會，印度農(nóng)業(yè)研究委員會，海德拉巴，印度。
表2.用于PCR檢測以區(qū)別水稻的CMS和保持系的特定的寡聚核苷酸序列

表3.在PCR檢測中用于區(qū)別CMS和保持系的可用SEQ ID No.4和SEQ ID No.5多重復合的寡聚核苷酸引物對

F＝正向?qū)?，R＝反向?qū)?br> 權(quán)利要求
1.一種利用放射性或非放射性標記的方法在Southern雜交檢測中用CMS特異的DNA序列區(qū)分WA水稻的細胞質(zhì)雄性不育系和與它的同族的雄性可育保持系的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及對水稻W(wǎng)A細胞質(zhì)雄性不育系專一的DNA標記，利用這種DNA堿基標記來評估種子純度和為了確保水稻細胞質(zhì)雄性不育系的純度的一種方法。
文檔編號C12Q1/68GK1740337SQ20051009909
公開日2006年3月1日 申請日期2001年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月28日
發(fā)明者亞什陶拉·賈米爾, 拉梅什·V·松迪 申請人:科學與工業(yè)研究委員會