芝麻花序有限基因Sidt1及其SNP標記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種芝麻花序有限基因57出1及其 SNP 標記 5YDt27-l。
【背景技術(shù)】
[0002] 芝麻L，2n=26)是世界上最古老的優(yōu)質(zhì)油料作物之一，也是我 國的特色農(nóng)產(chǎn)品，在食品加工中具有重要地位。自解放以來，我國共育成芝麻品種約140 個，在很大程度上推動了我國芝麻生產(chǎn)的快速發(fā)展。但是與其他油料作物相比，芝麻仍屬于 低產(chǎn)作物。
[0003] 芝麻是花序無限型且生育期較短的農(nóng)作物，通常我國芝麻品種的生育期在85-95 天。植株生長發(fā)育過程的表現(xiàn)主要包括：植株花序無限，花期較長，約為25-35天。下部蒴 果成熟開裂時，多數(shù)植株的頂端仍在進行花芽分化，植株蒴果成熟度不一致，從而影響到芝 麻的產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量。
[0004] 目前，在世界芝麻生產(chǎn)中，收獲指數(shù)低、籽粒成熟度不一致、抗病抗逆性差等是限 制芝麻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要因素，開展高產(chǎn)高抗病抗逆、適于機械化生產(chǎn)的芝麻新材料創(chuàng)制和 新品種選育是當(dāng)前我國芝麻育種研究工作的重點。
[0005] 在此背景下，自2007年起，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心積極開展了芝麻EMS 誘變育種和種質(zhì)創(chuàng)制工作。2009年采用EMS誘變方法，從我國主導(dǎo)芝麻品種豫芝11號中誘 變創(chuàng)制出了花序有限型芝麻優(yōu)異新品系，命名為豫芝DS899。該突變體在田間表現(xiàn)主要包括 以下方面：（1)植株單桿，一葉三花，蒴果四棱，下部葉片較大，葉片深綠、肥厚，葉綠素含量 高，光和效率強；（2)花序有限，植株具有典型的有限生長習(xí)性，株高130-150厘米；在黃淮 區(qū)，該品種生長發(fā)育形成15-20個節(jié)位后，植株頂端生長點停止生長并自動封頂；封頂后頂 端形成4-6個蒴果群；該特性受隱性單基因控制，能穩(wěn)定遺傳，繁殖后代中有限習(xí)性植株達 到98%以上；（3)該品系生長發(fā)育速度快，現(xiàn)蕾早，花期20-25天，結(jié)蒴集中，無空稍尖，生育 期80天左右；平均單株結(jié)蒴60-80個；平均蒴粒數(shù)50-55粒，千粒重4. 0-4. 5g，籽粒含油量 51. 43%，蛋白質(zhì)含量26. 75% (2014年鄭州收獲種子)，屬于高蛋白型優(yōu)質(zhì)育種新材料。（4) 品種對莖點枯病和枯萎病抗性高；適于密植和機械化管理與收獲。
[0006] 除豫芝DS899外，在當(dāng)前世界芝麻種質(zhì)資源庫中，還保存另一類花序有限型芝麻 種質(zhì)（河南省農(nóng)科院芝麻研究中心芝麻種質(zhì)資源庫存編號為08TP092)。該種質(zhì)的田間性狀 主要表現(xiàn)為：植株分支型，花序有限，蒴果節(jié)位數(shù)為2-3節(jié)，單株蒴果數(shù)30-40個，結(jié)蒴性低， 不適宜直接用于生產(chǎn)，該種質(zhì)花序有限性狀受單隱性基因控制。
[0007] 基于現(xiàn)有的有限花序的芝麻種質(zhì)資源進行分析，對芝麻有限花序基因進行分析和 標記，對于培育新的芝麻種子資源具有十分重要研究和應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明主要目的是提供一種芝麻花序有限基因57出1的基因序列，同時提供了該 有限基因基因序列的cDNA序列；本發(fā)明另一目的是提供了對有限基因基因序 列的SNP標記5?Ζ??27-1，從而便于新品種的篩選和培育。
[0009] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的解釋說明。
[0010] 芝麻花序有限基因該基因有1809bp，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，位于 芝麻第4條染色體上，在芝麻SNP遺傳圖譜中的位置為第8連鎖群，18. 0-19. 2cM，對花序有 限性狀的解釋率為100% (Vg/Vp);其DNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 芝麻花序有限基因的CDNA序列，長度為531 bp，編碼176個氨基酸，具體如 SEQ ID. 2 所示。
[0012] 需要說明的是，與正常株（dtO)基因序列的唯一不同點就在于，花序有限基因 的cDNA序列中，第236位核苷酸由G突變成了 A ;當(dāng)G變?yōu)锳時，導(dǎo)致編碼蛋白的第 79個氨基酸序列由絲氨酸（S)突變?yōu)榱颂於０罚∟)，植株花序就由無限（dtO型）變成了 dtl有限型。
[0013] 所述芝麻花序有限基因的SNP分子標記5YDt27-l，有92bp，為花序有限基 因中第378至469處堿基序列，具體序列為： CCTGATGTTCCTGGTCCTAATGATCCATATCTGAGGGAGCACCTGCACTGGTATGCTTTCATTTTTAACTGCT TAAGACCTGATTGATTTAA。
[0014] 利用所述SNP分子標記SiDt27-l檢測芝麻花序有限基因57出1的檢測方法，具體 包括以下步驟： (1) 提取待測芝麻種質(zhì)資源的基因組DNA ; (2) 以步驟（1)中所提取DNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴增時，采用如下引物序列： 正向引物 HSDtOl-IF 序列：5' CCTGATGTTCCTGGTCCGAA 3' ； 正向引物 HSDt01-2F 序列；5' CTATTCCTGATGTTCCTGGTCCGAG3' ； 反向引物 HSDtOl- R 序列：5' TAAATCAATCAGGTCTTAAGCAGT 3' ； 對PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，判斷待測芝麻種質(zhì)資源的基因組DNA中是否含有SNP 分子標記SiDt27-l，判斷規(guī)則如下： 如果僅含有SNP分子標記5YDt27-l標記位點，當(dāng)采用引物HSDtOl-IF與HSDtOl- R配 對進行PCR擴增時，能擴增出條帶大小為92bp的產(chǎn)物，則該待測種質(zhì)屬于dtl型，花序有 限，可用于培育花序有限型芝麻新品種； 如果不含有SNP分子標記5YDt27-l標記位點，當(dāng)采用引物HSDtO 1-2F與HSDtOl- R配 對進行擴增時，能擴增出條帶大小為97bp的產(chǎn)物，則該待測種質(zhì)屬于dtO型，花序無限，不 能用于培育花序有限型芝麻新品種； 如果所擴增條帶大小既有92bp的產(chǎn)物，也有97bp的產(chǎn)物，則該待測種質(zhì)屬于雜合型， 花序無限，但其后代可以出現(xiàn)形狀分離，從后代中可進一步獲得花序有限型材料以便用于 新品種的培育； (3) 為進一步準確判斷待測種質(zhì)資源是否含有花序有限基因57出1，可以步驟（1)中所 提取的基因組DNA為模板，PCR擴增特定序列，PCR擴增時，采用如下引物序列： 正向引物 Dtl Primer F 序列為：5'_ ATGGCAAAAATGTCATCGGACC -3' ； 反向引物 Dtl Primer R 序列為：5'_ CTAGCGCCTTCTAGCAGCAGTC -3' ； 對PCR擴增產(chǎn)物進一步進行測序，并與花序有限基因的基因序列（即SEQ ID NO. 1中的序列)進行比對，如果相同，則待測種質(zhì)屬于花序有限，可用于培育新的芝麻品種。
[0015] 2012年，發(fā)明人將豫芝DS899 (單桿，節(jié)位15-20個）和08TP092 (分支，節(jié)位2-3 個）配置了雜交組合并調(diào)查了 Fl、F2代特征特性。結(jié)果顯示，F(xiàn)l后代均表現(xiàn)為花序有限， 節(jié)位3-5個；F2后代均表現(xiàn)為花序有限，節(jié)位3-15個不等。同其他研究結(jié)果相結(jié)合，發(fā)明 人認為，在豫芝DS899和08TP092兩個花序有限型芝麻材料中，花序有限性狀受同一基因位 點控制，但突變性狀表現(xiàn)有一定差異。因此，推測2種花序有限型種質(zhì)在花序有限基因的序 列上可能有一定差異。隨之，將2個種質(zhì)中的花序有限基因分別命名為57出7(來源于豫芝 DS899)和(來源于08TP092)。相應(yīng)地，豫芝DS899和08TP092突變體分別為dtl型 和dt2型，花序無限型正常株為dtO型。
[0016] 后期研究結(jié)果顯示，dtl型和dt2型有限種質(zhì)之間的差異在于，基因在序列的 不同堿基片段發(fā)生了變異。2013年以來，發(fā)明人利用已構(gòu)建的豫芝DS899(dtl型）XJS012 (dtO型）的F2群體，參考芝麻群體作圖、芝麻基因組精細圖和重測序技術(shù)（Zhang et al.， 2013; Miao and Zhang, 2014; Li et al·，2013)，成功克隆了豫芝 DS899 的花序有限基 因在芝麻基因組注釋中，該基因命名為5? ?/7。最終，發(fā)明人確定了芝麻花序有限的 突變基因位點，為下一步探明芝麻花序發(fā)育調(diào)控機理、選育dtl型花序有限芝麻新品種奠 定了堅實基礎(chǔ)，并較好地推動了芝麻分子輔助育種研究的發(fā)展。
[0017] 在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明針對獲得的芝麻花序有限基因進行分子標記開發(fā)和應(yīng) 用，為加快芝麻重要性狀遺傳基礎(chǔ)和新品種選育提供技術(shù)支撐。
[0018] 本發(fā)明創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面： (1) 本發(fā)明對花序有限型芝麻突變體豫芝DS899開展了基因組重測序和芝麻種質(zhì)資源 遺傳圖譜構(gòu)建，克隆提供了一種芝麻花序有限基因57出7,開發(fā)了其SNP標記5YDt27-l，同 時提供了一種鑒定種質(zhì)資源中是否含有該基因及標記位點的PCR鑒定方法，該方法可以較 為便捷和快速地初步確定待測芝麻品種的花序類型，為新品種培育提供參考； (2) 本發(fā)明所獲得的芝麻花序有限基因 57出7及SNP標記5YDt27-l序列明確，檢測結(jié) 果穩(wěn)定可靠；本發(fā)明所涉及的花序有限基因?qū)χヂ楫a(chǎn)量、品質(zhì)以及芝麻生產(chǎn)等具有重要影 響，并對開展芝麻等農(nóng)作物花發(fā)育機理研究以及培育適于機械化生產(chǎn)的芝麻新品種具有重 要意義； (3) 本發(fā)明所提供的芝麻花序有限基因及其SNP標記5YDt27-l的檢測方法，技 術(shù)成熟，檢測結(jié)果穩(wěn)定性好，對提高芝麻育種工作效率、提升我國芝麻遺傳育種研究技術(shù)水 平具有重要意義。
[0019] 與現(xiàn)有芝麻育種方法相比，本發(fā)明優(yōu)點可以概括為： (1) 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了芝麻花序有限基因 (2) 本發(fā)明開發(fā)了芝麻花序有限基因的SNP標記5YDt27-l，為分