析芝麻等農(nóng)作 物花發(fā)育機(jī)理提供了遺傳信息； (3) 本發(fā)明所提供的SNP分子標(biāo)記5YDt27-l，為建立芝麻分子輔助育種技術(shù)提供了重 要分子標(biāo)記，為篩選花序有限的芝麻新品種提供了快速檢測(cè)方法。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為豫芝DS899 (dtl型，花序有限，右側(cè))和親本豫芝11號(hào)（dtO型，花序無(wú)限， 左側(cè)）植株田間對(duì)照； 圖2為本發(fā)明利用匕群體建立的芝麻SNP高密度遺傳圖譜； 圖3為本發(fā)明的芝麻花序有限基因在芝麻SNP遺傳圖譜中的定位結(jié)果； 圖4為本發(fā)明的花序有限3即標(biāo)記&饑27-1的引物對(duì)批0切1-1?、批0切1-2卩和 HSDtOl- R在部分芝麻種質(zhì)中的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中：泳道M為DL 2000 marker，顯示的條 帶從上到下分別為750bp、500bp、250bp和IOObp ;泳道1為含5??/以等位位點(diǎn)2(即dtO型） 的豫芝11號(hào)材料(無(wú)限型）;泳道2為含等位位點(diǎn)I (即dtl型）的材料(有限型）;泳 道3為豫芝11號(hào)X豫芝DS899組合的F1中間雜合型材料；泳道4為以水為模板的PCR擴(kuò) 增對(duì)照； 圖5為本發(fā)明的芝麻花序有限基因的基因結(jié)構(gòu)； 圖6為本發(fā)明的芝麻花序有限基因與正常株等位基因(芝麻基因組注釋命 名為Λ?/7)序列比對(duì)結(jié)果；其中：箭頭指不基因與正常等位基因的核昔酸序列 差異位點(diǎn)；上排為正常等位基因的核苷酸序列，下排為57出7基因的核苷酸序列； 圖7為本發(fā)明的芝麻花序有限基因與正常株等位基因基酸編碼序列比對(duì) 結(jié)果；其中：箭頭指不5"/J以蛋白與正?；虻鞍椎臍饣嵝蛄胁町愇稽c(diǎn)； 圖8為本發(fā)明的SNP標(biāo)記5YDt27-l的引物對(duì)HSDt01-lF、HSDt01-2F和HSDtOl- R在 ?2群體中的PCR驗(yàn)證；其中泳道M為DL 2000 marker，顯示的條帶從上到下分別為200bp和 IOObp ;泳道1-11為5??/以純合(花序有限型）F2植株；泳道12、13、19、20和22為屯 合(無(wú)限花序型）F 2植株；泳道14-18和21為雜合(無(wú)限花序型）F 2植株； 圖9為本發(fā)明的芝麻花序有限基因與正常株等位基因的Southern印跡雜 交結(jié)果；其中：泳道M為Marker ;泳道1 :包含正常等位基因5?價(jià)探針序列的陽(yáng)性質(zhì)粒雜交 印跡； 泳道2-4從左到右分別為Hind III酶切的豫芝11號(hào)(野生型無(wú)限，dtO)、豫芝DS899 (dtl型有限)和5： raiZ/?ω?野生種芝麻（dtO型，無(wú)限)基因組DNA的雜交結(jié)果；泳道5-7從 左到右分別為Hind III和EcoR I雙酶切的豫芝11號(hào)(野生型無(wú)限，dtO)、豫芝Ds899 (dtl 型有限）和5： 野生種芝麻（dtO型，無(wú)限）基因組DNA的雜交結(jié)果； 圖10為本發(fā)明的SNP標(biāo)記5YDt27-l在育種材料選擇中的應(yīng)用；其中：泳道M為DL 2000 Marker，泳道 1-20 為 純合（花序有限型）F2植株；泳道 21、29、30、33、35、37、38 和40為純合(無(wú)限花序型）F2植株；泳道22~28、31、32、34、36和39為雜 合(無(wú)限花序型）F2植株。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明。介紹具體實(shí)施例前，首先對(duì)本發(fā) 明中所用主要芝麻種質(zhì)資源及品種簡(jiǎn)要介紹如下。
[0022] 現(xiàn)有技術(shù)中，芝麻品種豫芝11號(hào)是我國(guó)重要的芝麻育種優(yōu)異親本材料。本申請(qǐng) 中所采用的芝麻花序有限型新品系豫芝DS899,是由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心采用 EMS誘變技術(shù)從豫芝11號(hào)選出的新品種。2015年3月對(duì)該品系申請(qǐng)了國(guó)家新品種權(quán)保護(hù) (【申請(qǐng)?zhí)枴?0150395. 2)，并參加了 2015年度省級(jí)芝麻新品種區(qū)試鑒定。其主要特征為：花序 有限，平均節(jié)位15-20個(gè)，每葉腋3花，單桿，蒴果四棱，白粒。
[0023] 本申請(qǐng)中所采用的芝麻資源JS012,來(lái)自于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心種質(zhì) 資源庫(kù)，主要特征為：花序無(wú)限，每葉腋單花，分枝，蒴果四棱，黑粒。
[0024] 實(shí)施例中涉及到的08TP092、武寧黑、鄭芝98N09、野生種等其他芝麻種質(zhì)資源，均 來(lái)自于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心種質(zhì)資源庫(kù)；這些種質(zhì)材料均可從公開(kāi)渠道獲得 (或直接從河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心種質(zhì)資源庫(kù)獲得)，并種植應(yīng)用。
[0025] 另外需要說(shuō)明的是，下述實(shí)施例中PCR反應(yīng)采用PTC-100 (MJ research公司產(chǎn) 品）熱循環(huán)儀進(jìn)行；PCR反應(yīng)中相關(guān)酶類、緩沖液等試劑產(chǎn)品均采購(gòu)于上海生工試劑公司； 相關(guān)引物均由華大基因公司合成提供。PCR反應(yīng)中植株DNA提取均參照魏利斌等的改良 CTAB法進(jìn)行(芝麻DNA和RNA同步提取方法，2008,分子植物育種)。下述實(shí)施例中相關(guān)基因 測(cè)序由天津基因芯片生物公司完成。
[0026] 實(shí)施例1 本實(shí)施例主要介紹一下芝麻花序有限基因5'/出7及其3即分子標(biāo)記5YDt27-l的篩選 過(guò)程，具體過(guò)程如下。
[0027] -、花序有限性狀遺傳背景介紹 為研究分析花序有限性狀，2012年，發(fā)明人選用豫芝DS899與豫芝11號(hào)、JS102和武寧 黑等三個(gè)花序無(wú)限型種質(zhì)進(jìn)行正反交組合配置(具體組合配置如下表所示)，并對(duì)Fl后代進(jìn) 行1花序類型調(diào)查。豫芝DS899與豫芝11號(hào)、JS102和武寧黑的正反交組合配置類型為：
[0028] 其中豫芝DS899 (花序有限）和無(wú)限型親本豫芝11號(hào)的性狀對(duì)比如圖1所示。
[0029] F1調(diào)查結(jié)果顯示，F(xiàn) i均為正常的無(wú)限花序，說(shuō)明該突變性狀(有限花序）受隱性基 因控制。隨后，對(duì)豫芝DS899與豫芝11號(hào)、JS102及武寧黑的3個(gè)正交匕后代群體進(jìn)行了 加代種植，每個(gè)群體均大于200株?；ㄆ陂_(kāi)展了田間性狀調(diào)查，結(jié)果如下表所示。
[0030] F2及測(cè)交后代群體中花序有限性狀分離結(jié)果：
[0031] 上述數(shù)據(jù)顯示，花序有限型突變體與野生型性狀的分離比分別為64: 215、78: 242和71: 229。適合性檢驗(yàn)結(jié)果顯示其符合1:3分離比，表明該突變性狀受1對(duì)隱性基因 控制。進(jìn)一步進(jìn)行豫芝DS899突變體與豫芝11號(hào)、JS102及武寧黑的3個(gè)測(cè)交后代群體檢 測(cè)。結(jié)果顯示，突變性狀后代分離比例分別為94: 92、108: 125和78: 84。適合性檢驗(yàn)結(jié) 果顯示，花序有限性狀在測(cè)交后代中符合1:1分離比，再次表明該突變性狀受1對(duì)隱性基因 控制。
[0032] 二、芝麻花序有限與無(wú)限型親本的F2遺傳群體構(gòu)建 2013年7月，利用純化的花序有限型系豫芝DS899和花序無(wú)限型種質(zhì)JS012重新配置 雜交組合，獲得F1; 2013年11月，將上述組合的F1種子采用營(yíng)養(yǎng)缽點(diǎn)播，種植在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研 究中心三亞基地，2對(duì)真葉后，適時(shí)移栽各植株，確保株系數(shù)量大于200個(gè)。
[0033] 三、F2群體SNP遺傳圖譜構(gòu)建及花序有限基因 Sidtl定位 (I)F2群體親本及122 AF2單株基因組重測(cè)序 從？2群體中隨機(jī)挑選120個(gè)株系，采集120個(gè)株系單株和2個(gè)親本單株的幼嫩葉片， 提取各植株DNA，采用Illumina測(cè)序方法對(duì)122份材料進(jìn)行基因組重測(cè)序，測(cè)序覆蓋度 彡 30 X 〇
[0034] (2)參考豫芝 11 基因組數(shù)據(jù)（Zhang et al.，Genome sequencing of the important oilseed crop Sesamum indicum L. ，2013， Genome Biology ；Miao et al.， The sesame genome project and genome sequencing. XXII International Plant and Animal Genome Conference (San Diego, USA)，2014 (Conference poster abstract))， 選用BWA (Burrows- Wheeler Aligner)軟件將各株系的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接。
[0035] (3)利用]〇1]11]^口_1;[111?^6 1]^口軟件構(gòu)建芝麻？2群體5即高密度遺傳圖譜。所構(gòu) 建遺傳連鎖圖譜如圖2所示。圖譜共有13個(gè)連鎖群，包含3101個(gè)bin區(qū)段，12. 4萬(wàn)個(gè)標(biāo) 記，圖譜全長(zhǎng)1872. 2 cM，平均144. 0 cM/連鎖群，0.015 cM/標(biāo)記區(qū)間。
[0036] (4)在初花期-終花期，對(duì)F2群體120個(gè)株系及2個(gè)親本進(jìn)行花序類型鑒定，共 鑒定3次。結(jié)合上述SNP高密度遺傳圖譜，采用WinQTL cart軟件，確定了 1個(gè)與芝麻有 限花序性狀緊密連鎖的區(qū)間，見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，該突變基因位于第8連鎖群，遺傳距離 18. OcM-19. 2cM，兩標(biāo)記之間的物理距離約為480kb。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，此區(qū)間內(nèi)共包含了 15個(gè)SNP/InDel多態(tài)位點(diǎn)。
[0037] 隨后，將15個(gè)候選的SNP/InDel多態(tài)位點(diǎn)轉(zhuǎn)換為分子標(biāo)記(換言之，根據(jù)已知序列 設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增獲得相應(yīng)序列)，具體的15個(gè)候選花序有限SNP/InDel位點(diǎn)分子標(biāo)記如下 表所示：
[0038] 隨機(jī)從上述親本和Fi群體中選出50個(gè)植株，提取DNA，利用上述15組分子標(biāo)記引 物對(duì)，進(jìn)行關(guān)聯(lián)性篩查。結(jié)果顯示，僅5YDt27-l位點(diǎn)與花序有限性狀緊密連鎖（圖4)。
[0039] 實(shí)施例2 本實(shí)施例主要進(jìn)行芝麻花序有限基因 Sidtl克隆及基因序列分析。
[0040] 在實(shí)施例1基礎(chǔ)上，為獲知花序有限基因的具體序列，可采用PCR擴(kuò)增方法 擴(kuò)增獲得相關(guān)序列后進(jìn)一步測(cè)序獲知，相關(guān)過(guò)程介紹如下。
[0041] (1)根據(jù)上述實(shí)施例1中獲