得的SNP位點(diǎn)，利用豫芝11號(hào)基因組數(shù)據(jù)，確定了 5YDt27-l位點(diǎn)所在的基因，將該基因序列命名為5??Λ7。對(duì)序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因在 芝麻基因組(豫芝11號(hào)）被注釋為TFL基因（5?Ζ??)。
[0042] 隨后，根據(jù)基因組數(shù)據(jù)，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了擴(kuò)增芝麻花序有限 基因57出7的引物對(duì)，具體設(shè)計(jì)如下： 正向引物 Dtl Primer F 序列為：5'_ ATGGCAAAAATGTCATCGGACC -3' ； 反向引物 Dtl Primer R 序列為：5'_ CTAGCGCCTTCTAGCAGCAGTC -3'。
[0043] 以豫芝DS899的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3分鐘；之后94°C變性30秒，55°C復(fù)性30秒，72°C延伸1 分鐘，循環(huán)30次；最后72 °C延伸5分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存?zhèn)溆茫蛘咧苯踊厥諗U(kuò)增條 帶并測(cè)序。
[0044] 結(jié)果顯示，該基因的基因組全長(zhǎng)序列為1809bp，共包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子 (圖5)，序列如SEQ IDl所示。
[0045] 同時(shí)，利用上述引物對(duì)對(duì)豫芝11號(hào)基因組DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了 測(cè)序。
[0046] 將花序有限基因與正常株（即豫芝11號(hào)）的等位基因行序列比對(duì)， 結(jié)果如圖6。從圖6中可以看出，在花序無(wú)限型和花序有限型種質(zhì)基因組中，57出7序列的 差異僅在于編碼區(qū)第236位堿基是否發(fā)生了 G/A突變。當(dāng)花序類型由無(wú)限型突變?yōu)閐tl有 限型時(shí)，編碼區(qū)第236位的堿基G就突變?yōu)榱藟A基A，導(dǎo)致編碼蛋白的第79個(gè)氨基酸序列由 絲氨酸⑶突變?yōu)榱颂於０罚∟)(圖7)。
[0047] (2 )依照上述DNA提取方法，提取豫芝DS899幼嫩植株的RNA，并利用TaKaRa RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA ;相關(guān)操作參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō) 明書(shū)進(jìn)行操作即可； 需要說(shuō)明的是，反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，PCR反應(yīng)時(shí)所采用的引物對(duì)(利用Primer Premier5.0 設(shè)計(jì)獲得）設(shè)計(jì)如下： TFLl CDs-F (5，- ATGGCAAAAATGTCATCGGACC -3,）， TFLICDs-R (5'_ CTAGCGCCTTCTAGCAGCAGTC -3'）； PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得的cDNA編碼區(qū)序列，對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物測(cè)序即可獲得Sidtl基因 的cDNA序列；該基因的cDNA序列為53 Ibp，共編碼176個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID2所示。
[0048] (3)花序有限基因的SNP引物設(shè)計(jì)與SNP位點(diǎn)驗(yàn)證 進(jìn)行SNP位點(diǎn)驗(yàn)證時(shí)，引物設(shè)計(jì)方法參照Wei等（Development of SNP and InDel markers via de novo transcriptome assembly in Sesamum indicum L ，2014,Molecular Breeding)進(jìn)行，另外需要解釋的是，為區(qū)分待檢測(cè)基因組DNA中不同SNP等位位點(diǎn)，研究人 員通常需要注意以下2方面的問(wèn)題： 第一，將SNP引物對(duì)設(shè)計(jì)成3條，并需在特異引物的3'末端第3位的堿基引入錯(cuò)配以 增加擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；引入錯(cuò)配的原則為：引物3'端的第3位錯(cuò)配堿基與3'末端的SNP 錯(cuò)配堿基能形成穩(wěn)定性互補(bǔ)的錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，即強(qiáng)錯(cuò)配型（C / T或G / A)與弱錯(cuò)配型（C / A 或G / T)搭配，中等錯(cuò)配型（A / A、C / C、G / G或T / T)與中等錯(cuò)配型搭配； 第二，在含有SNP位點(diǎn)的2個(gè)正向或反向引物中，將其中1條引物序列的5'端隨機(jī)增 加5個(gè)堿基，其主要目的是為了不同位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物在后續(xù)凝膠電泳圖譜區(qū)分能夠較為便 捷地區(qū)分開(kāi)來(lái)。
[0049] 利用Primer premier 5. 0軟件所設(shè)計(jì)的SNP位點(diǎn)的引物對(duì)序列如下： 正向引物 HSDtOl-IF 序列：5' CCTGATGTTCCTGGTCCGAA 3' ； 正向引物 HSDt01-2F 序列；5' CTATTCCTGATGTTCCTGGTCCGAG3' ； 反向引物 HSDtOl-R 序列：5' TAAATCAATCAGGTCTTAAGCAGT 3' ； 需要說(shuō)明的是，當(dāng)正向引物HSDtOl-IF與反向引物HSDtOl-R配對(duì)時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大 小為92bp (dtl型）;當(dāng)正向引物HSDt01-2F與反向引物HSDtOl-R配對(duì)時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大 小為 97bp (dtO 型）。
[0050] 為確認(rèn)57出7基因即是調(diào)控芝麻花序類型的基因，我們配置了三個(gè)組合？2群體進(jìn) 行了驗(yàn)證。F 2群體具體為：隨機(jī)從豫芝DS899分別與豫芝11號(hào)、JS102和武寧黑構(gòu)建的F 2 群體中挑選50個(gè)株系，同時(shí)田間調(diào)查各株系單株的花序類型。
[0051] 從此50個(gè)株系隨機(jī)選擇50個(gè)單株，采集50個(gè)單株和4個(gè)親本單株的幼嫩葉片， 提取各植株DNA，并以此作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0052] PCR反應(yīng)采用10 PL反應(yīng)體系，設(shè)置如下： 模板 DNA (50ng/^L)，I. 〇μL ; 10XPCR Buffer (Mg2+), I. 〇μL ； Taqase 酶（5U/>L)，0· 2μL ; dNTP (lOmmol/L),0. 2μL ； Forward Primer I (1〇μΜ) ,0. 5)J-L ； Forward specific Primer 2 (1〇μΜ), 0. 5)J-L ； Reverse Primer (1〇μΜ), I. 0)J-L ； 加入超純水5. 6PL。
[0053] PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3分鐘，之后94°C變性30秒，55 °C復(fù)性30秒，72 °C延 伸30秒，循環(huán)30次，最后72°C延伸5分鐘，擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0054] 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，凝膠濃度為8~10%，凝膠大小 180mmX120mmX2mm，電泳緩沖液為0· 5XTBE，150V恒壓交流電電泳L 5~2小時(shí)。電泳結(jié)束 后，在凝膠加入濃度為0. 1%的硝酸銀水溶液，置于水平搖床上滲透銀染IOmin ;再加入2% 氫氧化鈉和〇. 4%甲醛混合溶液，置于水平搖床中適度顯色；最后清水漂洗凝膠并記錄讀取 數(shù)據(jù)。
[0055] 部分電泳圖譜如圖8所示。
[0056] 結(jié)果顯示，表現(xiàn)為花序有限的植株，其擴(kuò)增結(jié)果為92bp條帶；花序無(wú)限的親本擴(kuò) 增結(jié)果為97bp條帶；雜合型植株擴(kuò)增出92bp和97bp條帶，性狀表現(xiàn)為無(wú)限型。
[0057] 綜上，我們可以認(rèn)為該57出7基因是引起芝麻花序有限突變發(fā)生的基因，該基因 可用于芝麻等作物花序發(fā)育機(jī)理研究。
[0058] 實(shí)施例3 本實(shí)施例主要進(jìn)行芝麻花序有限基因序列特征分析。
[0059] 為進(jìn)一步確定芝麻花序有限基因5??Λ7的特征，并同時(shí)確定其在芝麻基因組中的 拷貝數(shù)，我們開(kāi)展了花序有限基因57出7的Southern雜交印跡驗(yàn)證工作。
[0060] (1)花序有限基因的Southern雜交探針設(shè)計(jì)及制備 利用Primer Premier 5. 0軟件，依據(jù)芝麻品種"豫芝11號(hào)"基因組DNA和5?價(jià)序列， 設(shè)計(jì)引物對(duì)，具體如下： Dt-Gs 正向引物：5' - GAGCCCTCTTTCAAAAACACC-3'， Dt-Gs 反向引物：5' - AGCAGCAACAGGGAGACCTA -3'）； 以芝麻品種"豫芝11號(hào)"基因組DNA為模板，利用上述引物對(duì)Dt-Gs進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物大小459 bp。
[0061] PCR反應(yīng)中，各成分及反應(yīng)體積如下： 模板 DNA (50ng/^L)，2· 〇μL ; 10 X PCR Buffer (Mg2+), 5. 〇μL ； Taqase 酶（5U/>L)，0· 5μL ; dNTP (lOmmol/L)，L 〇μL ; Dt-Gs 正向引物（1〇μΜ)，1·〇μΜ Dt-Gs 反向引物（1〇μΜ)，1·〇μΜ 加超純水至總體積5〇μL。
[0062] PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，55 °C復(fù)性30秒，72 °C延伸30 秒，循環(huán)30次；最后72°C延伸5分鐘；4°C保存。
[0063] PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后測(cè)序確認(rèn)。
[0064] 該 PCR 產(chǎn)物即用作 Southern 雜交探針，利用 DIG-High Prime DNA Labeling & Detection Starter Kit I (Roche試劑公司），進(jìn)行探針標(biāo)記并檢測(cè)；具體操作步驟參照 DIG-High Prime DNA Labeling & Detection Starter Kit I 的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0065] (2)重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建 將步驟（1)中所述探針片段連入pGEM-T Easy載體，構(gòu)建成帶有探針序列的pGEM-T Easy質(zhì)粒，用于Southern雜交陽(yáng)性對(duì)照； 連接、回收、純化等步驟采用連接試劑、回收試劑盒(相關(guān)產(chǎn)品均為Promega公司產(chǎn)品） 完成；采用〇. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒連接質(zhì)量； 采用DNA提取試劑盒（TaKaRa公司)提取帶有探針序列的pGEM-T Easy質(zhì)粒，并將其濃 度稀釋為l-5Kg/L，用于下一步Southern雜交；具體步驟參考DNA提取試劑盒使用說(shuō)明。
[0066] (3)花序有限基因的Southern雜交印跡 選取豫芝11號(hào)、豫芝Ds899和5： raiZ/?ω?(野生種)等3個(gè)芝麻品種的幼嫩葉片各200 克，