一種淡水魚靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物基因技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種淡水魚靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞位于肌膜和基底膜之間，當(dāng)受到激活信號刺激時(shí)，肌衛(wèi)星細(xì)胞 即被激活、增殖，并與原有的骨骼肌細(xì)胞相互融合，形成新的肌纖維細(xì)胞。靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì) 胞（quiescentmusclesatellitecells,QMSC)形態(tài)上表現(xiàn)為胞質(zhì)少、細(xì)胞器疏松、與相鄰 肌纖維核大小相近、異染色質(zhì)與常染色質(zhì)的比例高和轉(zhuǎn)錄活性低等特點(diǎn)。在多種刺激因素 作用下，體內(nèi)靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞的胞質(zhì)發(fā)生擴(kuò)張，體積增大，高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和線 粒體等細(xì)胞器變得清晰明顯時(shí)，表明肌衛(wèi)星細(xì)胞開始進(jìn)入激活態(tài)，肌衛(wèi)星細(xì)胞激活后進(jìn)入 分裂、增殖期，產(chǎn)生成肌前體細(xì)胞（myogenicprecucells，MPCs)，并進(jìn)一步分化、融合形成 肌管，再分化、融合形成新的肌細(xì)胞。目前已確定了一些在靜息期、激活期及擴(kuò)增期特異表 達(dá)的肌衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)志?；墒且衙鞔_的靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)記物，在肌衛(wèi)星細(xì)胞激活期和 擴(kuò)增期其表達(dá)量明顯下調(diào)。激活后，肌衛(wèi)星細(xì)胞分化受到諸多因子調(diào)控，如血清應(yīng)答因子 (serumresponsefactor,SRF)和生肌調(diào)節(jié)因子（myogenicregulatoiTfactor,MRF)等。
[0003] 與哺乳動(dòng)物不同，魚類胚后發(fā)育過程中肌纖維不僅能增長增粗，而且通過成熟肌 纖維周圍肌衛(wèi)星細(xì)胞的不斷激活、分化和自我更新使肌纖維不斷增殖。目前體內(nèi)外實(shí)驗(yàn) 都表明魚類靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞很難維持穩(wěn)定，敲除生肌調(diào)節(jié)因子能抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞激活分 化，但此類方法不僅花費(fèi)較高、治療繁瑣，而且無法從源頭上維持肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息水平。因 此開發(fā)相應(yīng)穩(wěn)定劑是維持肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息水平的新途徑，本發(fā)明通過化學(xué)合成一對特異抑 制淡水魚類血清應(yīng)答因子表達(dá)的核巧酸短鏈，從降低肌肉血清應(yīng)答因子含量方面來維持肌 衛(wèi)星細(xì)胞靜息水平，既為闡明維持淡水魚類肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息狀態(tài)的分子調(diào)控機(jī)理，W期為 更深一步掲示魚類肌肉胚后生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也將為我國魚類肉質(zhì)品質(zhì)改良和 促進(jìn)水產(chǎn)業(yè)優(yōu)質(zhì)、高效和健康發(fā)展提供重要的理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種能降低淡水魚促肌衛(wèi)星細(xì)胞激活的主要蛋白含量的 淡水魚靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定劑。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案： 一種淡水魚靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定劑，其成分是經(jīng)過標(biāo)記與化學(xué)修飾的化學(xué)合成的雙 鏈小RNA分子，其中： 雙鏈小RNA分子的正向序列為：5' -AAAUGUAGUAGACUAUAAGUAU-3'，如沈QIDNo. 1所 示； 雙鏈小RNA分子的反向序列為：5' -AsUsACUUAUAGUCUACUACAsUsUsUs-Chol3'，如沈Q IDNo. 2 所示； 反向序列進(jìn)行化學(xué)修飾：3'端膽固醇修飾，5'端兩個(gè)硫代修飾，3'端4個(gè)硫代修飾， 反向序列全堿基甲基化修飾。
[0006] 所述的淡水魚靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定劑的用途，用于維持淡水魚肌衛(wèi)星細(xì)胞的靜 息狀態(tài)。
[0007] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的淡水魚靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定劑的用途，用于 抑制淡水魚血清應(yīng)答因子的表達(dá)。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是： (1)本發(fā)明是綜合運(yùn)用分子生物學(xué)、組織學(xué)和化學(xué)合成原理，對淡水魚肌衛(wèi)星細(xì)胞深入 研究基礎(chǔ)上，研究開發(fā)的具有高效、穩(wěn)定等特點(diǎn)的靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定劑。
[0009] (2)本發(fā)明生產(chǎn)工藝成熟、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、價(jià)格合理、核屯、技術(shù)先進(jìn)和易操作性，是 目前比較新型的魚類靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定劑，具有廣闊的市場前景。
[0010] (3)本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)是人工合成了維持淡水魚肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息態(tài)的新型小RNA 化合物，制作的穩(wěn)定劑能夠明顯抑制促肌衛(wèi)星細(xì)胞激活的主要蛋白含量（即抑制血清應(yīng)答 因子的表達(dá))，維持淡水魚肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息狀態(tài)。
【附圖說明】
[0011] 圖1為穩(wěn)定劑對賴魚肌肉血清應(yīng)答因子表達(dá)的影響（n=5)的柱形圖； 圖2為穩(wěn)定劑對草魚肌肉血清應(yīng)答因子表達(dá)的影響（n=5)的柱形圖； 圖3為穩(wěn)定劑對草魚靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量的影響（n=5)的柱形圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0013] 實(shí)施例1穩(wěn)定劑對賴魚肌肉血清應(yīng)答因子表達(dá)的影響 通過賴魚肌肉局部注射的方式，研究穩(wěn)定劑在降低肌肉中血清應(yīng)答因子的作用： W不注射任何試劑為陰性對照組，W注射憐酸鹽緩沖液（PBS)為陽性對照組，W注射穩(wěn) 定劑為試驗(yàn)組，試驗(yàn)組注射劑量為20μg/g體重，連續(xù)注射Ξ天，每天一次，注射完成后一 周取賴魚背部肌肉對血清應(yīng)答因子表達(dá)定量分析，具體結(jié)果如圖1所示。
[0014] 由圖1可知：注射穩(wěn)定劑的試驗(yàn)組賴魚肌肉血清應(yīng)答因子表達(dá)量比陽性對照組和 陰性對照組顯著降低；陽性對照組和陰性對照組的賴魚血清應(yīng)答因子表達(dá)量差異不顯著； 因此，可W判斷，注射穩(wěn)定劑能降低賴魚肌肉血清應(yīng)答因子表達(dá)量。
[0015] 實(shí)施例2穩(wěn)定劑對草魚肌肉血清應(yīng)答因子表達(dá)的影響 通過草魚肌肉局部注射的方式，研究穩(wěn)定劑在降低肌肉中血清應(yīng)答因子的作用： 實(shí)驗(yàn)分組如實(shí)施例1，實(shí)驗(yàn)一周后，取草魚背部肌肉對血清應(yīng)答因子表達(dá)定量分析，具 體結(jié)果如圖2所示。
[0016] 由圖2可知：注射穩(wěn)定劑的試驗(yàn)組草魚肌肉血清應(yīng)答因子表達(dá)量比陽性對照組和 陰性對照組顯著降低；陽性對照組和陰性對照組草魚血清應(yīng)答因子表達(dá)量差異不顯著；因 此，可W判斷，注射穩(wěn)定劑能降低草魚肌肉血清應(yīng)答因子表達(dá)量。
[0017] 實(shí)施例3穩(wěn)定劑對草魚靜息狀態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量的影響 實(shí)驗(yàn)分組如實(shí)施例2,實(shí)驗(yàn)一周后，取草魚背部肌肉進(jìn)行指標(biāo)測量，具體結(jié)果如圖3所 /J、- 〇
[0018] 由圖3可見：與陽性對照組和陰性對照組兩組相比，注射穩(wěn)定劑的試驗(yàn)組化巧陽 性肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量顯著高于陽性對照組和陰性對照組；陽性對照組和陰性對照組化巧陽 性肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量差異不顯著。因此，可W判斷，注射穩(wěn)定劑能維持草魚肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息狀 態(tài)。
[0019] 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在 不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠W其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論 從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán) 利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有 變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0020] 此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加W描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包 含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的運(yùn)種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可W經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員 可W理解的其他實(shí)施方式。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種淡水魚靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定劑，其特征在于，其成分是經(jīng)過標(biāo)記與化學(xué)修飾 的化學(xué)合成的雙鏈小RNA分子，其中： 雙鏈小RNA分子的正向序列為W -AAAUGUAGUAGACUAUAAGUAIKV，如SEQ IDNo. 1所 示； 雙鏈小RNA分子的反向序列為：5' -AsUsACUUAUAGUCUACUACAsUsUsUs-Chol3'，如SEQ ID No. 2所示； 反向序列進(jìn)行化學(xué)修飾：3'端膽固醇修飾，5'端兩個(gè)硫代修飾，3'端4個(gè)硫代修飾， 反向序列全堿基甲基化修飾。2. 如權(quán)利要求1所述的淡水魚靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定劑的用途，其特征在于，用于維 持淡水魚肌衛(wèi)星細(xì)胞的靜息狀態(tài)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的淡水魚靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定劑的用途，其特征在于，所述 的淡水魚靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定劑的用途，用于抑制淡水魚血清應(yīng)答因子的表達(dá)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種淡水魚靜息態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)定劑，其成分是經(jīng)過標(biāo)記與化學(xué)修飾的化學(xué)合成的雙鏈小RNA分子，其中：雙鏈小RNA分子的正向序列為：5′-AAAUGUAGUAGACUAUAAGUAU-3′；雙鏈小RNA分子的反向序列為：5′-AsUsACUUAUAGUCUACUACAsUsUsUs-Chol3′；反向序列進(jìn)行化學(xué)修飾：3′端膽固醇修飾，5′端兩個(gè)硫代修飾，3′端4個(gè)硫代修飾，反向序列全堿基甲基化修飾。本發(fā)明人工合成了維持淡水魚肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息態(tài)的新型小RNA化合物，制作的穩(wěn)定劑能夠明顯抑制促肌衛(wèi)星細(xì)胞激活的主要蛋白含量，維持淡水魚肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息狀態(tài)。
【IPC分類】A01K67/027, C12N15/113
【公開號】CN105368835
【申請?zhí)枴緾N201510735082
【發(fā)明人】褚武英, 唐利芝, 胡博旸, 李玉瓏
【申請人】湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年11月3日