通過人成肌細胞移植的疾病預防和緩解的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了使用成肌細胞轉移用于疾病的人基因組預防和治療的方法和材料。這些方法導致多條途徑中基因轉錄物的改變。結合從DMD、心肌病和II型糖尿病的成肌細胞轉移技術的發(fā)展，成肌細胞轉移通過正常的成肌細胞細胞核的轉移明確地介導其作用，所述正常的成肌細胞細胞核的轉移除了只是補充缺失的一個或多個基因或異常的一個或多個基因之外，還提供完整的人基因組。替換基因隨后轉錄來產(chǎn)生對于基因修復必要的蛋白或因子。描述了此技術的多種用途，包括用于疾病治療、疾病預防、藥物發(fā)現(xiàn)和選擇用于治療的優(yōu)秀細胞和克隆的用途。
【專利說明】通過人成肌細胞移植的疾病預防和緩解
發(fā)明領域
[0001]實施方案涉及使用成肌細胞轉移治療的疾病的人基因組治療。
[0002]發(fā)明背景
Peter K.Law先前證明在Duchenne型肌肉營養(yǎng)不良(DMD)肌肉中的成肌細胞轉移產(chǎn)生肌養(yǎng)蛋白(一種蛋白)，并且心肌中的成肌細胞轉移產(chǎn)生重肌球蛋白(另一種蛋白)。 相關專利和出版物包括 Ye 等 2009 (Diabetologia 52:1925-1934 “Skeletal myoblast transplantation…”)關注確定治療肌肉營養(yǎng)不良、心肌退化和糖尿病的安全性和有效性。
[0003]這些工作依賴于增加的肌肉強度、更多肌纖維、更好的細胞結構和蛋白補充作為監(jiān)測終點。然而，他們沒有鑒定任何潛在的遺傳/生化機制，所述遺傳/生化機制可以用來改善治療或用作工具用于預防性或治療性試劑諸如細胞移植劑或先導藥物化合物的鑒定和選擇。相反，這些研究指示它們的作用經(jīng)由供體細胞存活、發(fā)育和行使功能本身起作用。 在疾病的臨床預防和治療中尚未認真地解決導向基因修復的基因轉錄和翻譯。
[0004]一種重要的疾病是糖尿病。糖尿病是在世界上成人中腎衰竭和非創(chuàng)傷性下肢截肢的主要原因。在2010年，估計美國已經(jīng)在糖尿病治療上花費了 1980億美元i。估計2.85億成人患有II型糖尿病，占2010年中糖尿病病例的約90%2。糖尿病影響~25%的西方人群， 穩(wěn)定增加3，并且是重要的心血管疾病風險因素4。流行病學和雙生子研究已經(jīng)清楚地指示在胰島素抵抗的發(fā)展中主要的多源發(fā)生因素，II型糖尿病的關鍵特征，其也受環(huán)境因素影響 5’6。
[0005]先前的研究證明了胰島素抵抗的發(fā)展中骨骼肌的重要性。肌肉特異性Glut-4敲除的小鼠從幼年起即為胰島素抵抗和葡萄糖不耐受的7。肌肉中蛋白激酶C-X單獨的缺陷將誘發(fā)腹部肥胖和其它代謝異常8。相反，肌肉特異性的LKBl ( 一種絲氨酸/蘇氨酸激酶， 其是胰島素敏感性的負調`節(jié)蛋白)敲除增加胰島素敏感性并改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)9。這些研究暗示骨骼肌葡萄糖轉運中的缺陷可以是胰島素抵抗的發(fā)展中的關鍵因素。
[0006]KK小鼠的減弱的高血糖和高胰島素血癥以及改善的葡萄糖耐受隨人骨骼肌成肌細胞(hSkMs)的異種移植而發(fā)生1(1。骨骼肌成肌細胞是單核的肌肉前體細胞，其能夠與不同類型的肌纖維融合并發(fā)育成宿主表型n。通過與KK小鼠骨骼肌纖維的自然融合，植入的人成肌細胞在KK小鼠中形成雜交肌纖維。
[0007]雖然對糖尿病已完成此工作，但尚無人鑒定出多基因或基因組任何潛在的基因轉錄物的改變。事實上，那些工作的教導和結論表明，所發(fā)現(xiàn)的任何改善都可以是無基因修復的情況下供體細胞存活、發(fā)育和行使功能的結果。因此，此領域內超出此基本知識的任何新的信息和治療形式可以為疾病的臨床預防和治療提供不可估量的益處。
[0008]發(fā)明概沭
開始于Peter K.Law的起始性工作，多年來，在肌肉移植治療中已經(jīng)有一些進展。然而，一直沒有具體認識或理解各種疾病的疾病癥狀可以通過在多個基因的直接轉錄物的質量和數(shù)量中的變化來緩解。在本文所述的實施方案中，第一次驚人地顯示使用II型糖尿病遺傳異常的動物模型在多個基因的直接轉錄物的數(shù)量和質量中的變化可以導致疾病減輕。
[0009]令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在II型糖尿病肌肉中的成肌細胞的轉移在胰島素抵抗相關的多種途徑中產(chǎn)生基因轉錄物(而不是蛋白質)的變化。結合從DMD、心肌病和II型糖尿病的成肌細胞轉移技術的發(fā)展，該發(fā)現(xiàn)無法預料地證明，成肌細胞轉移通過正常的成肌細胞細胞核的轉移介導其作用，所述正常的成肌細胞細胞核的轉移除了只是補充缺少的一個或多個基因或異常的一個或多個基因之外，還供應完整的人基因組。替換的基因然后轉錄來產(chǎn)生對于基因修復必要的蛋白或因子。發(fā)現(xiàn)了此發(fā)現(xiàn)的多種用途，包括用于疾病治療、疾病預防、藥物發(fā)現(xiàn)和選擇用于治療的優(yōu)秀細胞和克隆。
[0010]附圖簡述
圖1.空腹狀態(tài)下在KK hSkM、KK對照和KK成纖維細胞組中胰島素信號傳遞途徑基因轉錄物水平的比較。
[0011]圖2.空腹狀態(tài)下在KK hSkM、KK對照和KK成纖維細胞組中線粒體基因轉錄物水平的比較。
[0012]疾病治療和預防
一個實施方案預防或緩解DMD癥狀。另一個實施方案預防或緩解心肌病癥狀。仍另一個實施方案預防或緩解II型糖尿病癥狀。
[0013]根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，提供治療需要其的患者中II型糖尿病的方法，包括: 確定或驗證患者的II型糖尿病狀態(tài)；通過成肌細胞細胞核的轉移為患者供應完整的人基因組，包括步驟:a.培養(yǎng)來自關于胰島素敏感性遺傳正常的供體的肌肉活組織檢查樣品的成肌細胞的供應物；b.向患者施用治療有效劑量的免疫抑制劑；c.之后對患者的至少一種肌肉從供應物選擇并施用治療有效劑量的成肌細胞；d.允許供體成肌細胞將其細胞核 (其每一個都包 含正?；虻耐暾パa物)插入患者的遺傳異常的肌細胞以進行基因互補修復；和e.允許供體成肌細胞彼此融合以形成遺傳正常的肌纖維；由此肌肉介導的葡萄糖穩(wěn)態(tài)得到改善，并通過測定患者的II型糖尿病狀態(tài)的改善而得到檢測。
[0014]在一個實施方案中，培養(yǎng)的成肌細胞是與患者組織不相容的，并且來源于遺傳正常的供體。在另一個實施方案中，供體選自遺傳正常的組，包括但不限于宿主的父親或男性同胞。
[0015]在仍另一實施方案中，在患者已經(jīng)發(fā)展II型糖尿病之前，從患者肌肉活組織檢查樣品中獲得培養(yǎng)的成肌細胞。在仍另一實施方案中，通過檢測提供疾病癥狀減輕的多個基因的直接轉錄物的數(shù)量或質量的變化進行患者的II型糖尿病狀態(tài)的改善的測定。
[0016]在仍另一實施方案中，培養(yǎng)的成肌細胞的治療有效劑量對于II型糖尿病是約500 億個細胞，并且此劑量以每毫升約I億個細胞施用。在另一個實施方案中，免疫抑制劑包括以每天5至7mg/Kg體重口服施用的環(huán)孢菌素，其在成肌細胞植入前五天開始，并且在手術后三周完全斷藥?？梢悦恐鼙O(jiān)測環(huán)孢菌素全血谷的水平，并且環(huán)孢菌素劑量根據(jù)需要重新調整以保持約250ng/mL的血液水平直至斷藥開始時前一周。
[0017]一個實施方案提供預防患者中II型糖尿病的方法，包括:檢查患者的II型糖尿病潛在狀態(tài)；通過成肌細胞細胞核的轉移為患者供應完整的人基因組，包括步驟:a.培養(yǎng)來自關于胰島素敏感性遺傳正常的供體的肌肉活組織檢查樣品的成肌細胞的供應物；b.向患者施用治療有效劑量的免疫抑制劑；和c.之后對患者的至少一種肌肉從供應物選擇并施用治療有效劑量的成肌細胞；d.允許供體成肌細胞將其細胞核(其每一個都包含正?；虻耐暾パa物)插入患者的異常肌細胞以進行遺傳互補預防；和e.允許供體成肌細胞彼此融合以形成遺傳正常的肌纖維；由此肌肉介導的葡萄糖穩(wěn)態(tài)得到改善，并通過測定患者的II型糖尿病狀態(tài)的改善而得到檢測。仍另一個實施方案提供測定在患者的II型糖尿病狀態(tài)中的改善。[0018]仍另一個實施方案提供治療宿主中遺傳疾病的方法，其通過經(jīng)由成肌細胞細胞核的轉移供應宿主物種的完整的基因組而實現(xiàn)，包括步驟:a.培養(yǎng)來自遺傳正常的供體的肌肉活組織檢查樣品的遺傳正常的成肌細胞的供應物；b.向宿主施用治療有效劑量的免疫抑制劑；和c.之后對宿主的至少一種肌肉從所述供應物選擇并施用治療有效劑量的成肌細胞；d.允許供體成肌細胞將其細胞核(其每一個都包含正常基因的完整互補物)插入患者的異常肌細胞以進行基因互補修復；和e.允許供體成肌細胞彼此融合以形成遺傳正常的肌纖維；由此進行宿主中改善的檢測，包括肌肉功能改善、運動能力增加、血液噴射/血管化、和生化物質或離子跨肌細胞膜的轉移的測定的至少一種。
[0019]藥物發(fā)現(xiàn)中的用途
仍另一實施方案提供了藥物發(fā)現(xiàn)測定，其包括檢測參與胰島素信號傳遞途徑的22個基因的組中的一個或多個的增加的基因轉錄。在一個實施方案中，測定RNA轉錄物并且使用RNA轉錄的存在或數(shù)量以選擇用于臨床前景或在疾病(諸如糖尿病)預防或癥狀緩解中使用的先導藥物化合物。在另一個實施方案中，使用基因轉錄產(chǎn)物活性的生物測定來選擇先導藥物化合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，基因是選自Acaca、AebpU Cfd、Gpd-U Jun、 PPARgamma> Ptpnl和UCPl的一個或多個基因。
[0020]這些基因、基因轉錄物和由它們產(chǎn)生的蛋白可以通過如技術人員將容易地理解的很多種方法檢測。藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)涉及鑒定和選擇關鍵標志物。雖然多種基因已知參與胰島素信號傳遞途徑，但實施方案提供了一組更有價值的基因，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)其在成肌細胞治療的背景下更有價值并且是優(yōu)選的。上面所列基因的優(yōu)先表達對選擇在預防或治療II 型糖尿病和其它遺傳疾病諸如粘多糖貯積癥的藥物發(fā)現(xiàn)中的先導化合物是尤其優(yōu)選的。
[0021]仍另一實施方案提供了藥物發(fā)現(xiàn)測定，其包括檢測參與線粒體生物合成和功能的 27個基因的組中的一個或多個的增加的基因轉錄。在一個實施方案中，測定RNA轉錄物并且使用RNA轉錄的存在或數(shù)量以選擇用于臨床前景或在疾病(諸如糖尿病)預防或癥狀緩解中使用的先導藥物化合物。在另一個實施方案中，使用基因轉錄產(chǎn)物活性的生物測定來選擇先導藥物化合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，基因是選自Bcl211、CoxlO, Cptlb, Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timml7b 和 Tomm40 的一個或多個基因。
[0022]這些基因、基因轉錄物和由它們產(chǎn)生的蛋白可以通過如技術人員將容易地理解的很多種方法檢測。藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)涉及鑒定和選擇關鍵標志物。雖然多種基因已知參與線粒體生物合成和功能，但實施方案提供了一組更有價值的基因，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)其在成肌細胞治療的背景下更有價值并且是優(yōu)選的。上面所列基因的優(yōu)先表達對選擇在預防或治療 II型糖尿病、肥胖和其它由于異常線粒體生物合成和功能導致的遺傳疾病的藥物發(fā)現(xiàn)中的先導化合物是尤其優(yōu)選的。
[0023]另一個實施方案提供發(fā)現(xiàn)用于糖尿病治療的藥物化合物或細胞治療候選物的方法，包括將試驗化合物暴露于細胞的體外、先體外后體內(ex vitro)或體內的組，測定選自Bcl211、CoxlO、Cptlb、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timml7b 和 Tomm40 的基因的一個或多個的基因活性，并使用陽性基因活性結果以確定用于糖尿病治療的試驗化合物的值。在一個實施方案中，所述方法包括檢測基因轉錄物。在一個實施方案中，所述方法包括檢測從轉錄的基因翻譯的蛋白的活性。在一個實施方案中，所述方法包括免疫檢測從轉錄的基因翻譯的蛋白。在一個實施方案中，所述方法包括將試驗化合物暴露于細胞的體外、先體外后體內或體內的組，測定選自Acaca、AebpU Cfd、Gpd-U Jun、PPAR y , Ptpnl和UCPl的基因的一個或多個的基因活性，并使用陽性基因活性結果以確定用于糖尿病治療的試驗化合物的值。
[0024]經(jīng)由細胞注射供應基因組
此前，本領域技術人員總是使用鹽溶液和其它確定的或部分確定的介質作為載體溶液在患者中注射細胞。本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)使用宿主的血清注射成肌細胞促進細胞存活和發(fā)育。雖然也考慮添加血管生成因子的血清和使用患者血漿作為介質用于注射的細胞， 但由于易于制備，因此優(yōu)選凝結的血清。
[0025]發(fā)現(xiàn)注射液的高細胞濃度(每毫升I億個細胞)在注射后增強了細胞融合和發(fā)育。優(yōu)選的技術是對年幼患者諸如年齡在5至12歲之間的DMD男孩的下身治療，和對于年長患者諸如年齡在12至18歲之間的DMD男孩的上身治療。最優(yōu)選的是對于年齡在5至18 歲之間的患者的全身治療(“WBT”)。對于所有年齡的II型糖尿病患者而言，WBT均是最優(yōu)選的。WBT涉及將500億個成肌細胞注射入患者的80個大肌肉群中。
[0026]在一個實施方案中，使用更小體積大小的細胞注射，以提供更大的DNA對細胞質量比。在一個實施方案中，優(yōu)選的平均直徑細胞大小是7到IOii m。在一個實施方案中，平均細胞大小是12 y m或更小并且可以小至7 ii m。在一個實施方案中，提供在患者血液蛋白介質諸如血清或血漿中的細胞懸液，用于治療需要其的患者中的II型糖尿病的方法，所述方法包括:確定或驗證患者的II型糖尿病狀態(tài)；通過成肌細胞細胞核的轉移為患者供應完整的人基因組，包括步驟:a.培養(yǎng)來自關于胰島素敏感性遺傳正常的供體的肌肉活組織檢查樣品的成肌細胞的供應物；b.向患者施用治療有效劑量的免疫抑制劑；和c.之后對患者的至少一種肌肉從供應物選擇并施用治療有效劑量的成肌細胞；d.允許供體成肌細胞將其細胞核(其每一個都包含正?；虻耐暾パa物)插入患者的遺傳異常的肌細胞以進行基因互補修復；和e.允許供體成肌細胞彼此融合以形成遺傳正常的肌纖維；由此肌肉介導的葡萄糖穩(wěn)態(tài)得到改善，并通過測定患者的II型糖尿病狀態(tài)的改善而得到檢測。在其它實施方案中， 供應該細胞懸液用于如本文詳述的其它方法。
[0027]用于選擇在移植治療中使用的細胞的標志物
在另一個實施方案中，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，對某些基因表現(xiàn)出異常高的轉錄活性的細胞為疾病諸如糖尿病的細胞治療提供優(yōu)越的益處。具體而言，該基因表達可以用于細胞選擇， 其用于克隆和用于培養(yǎng)以提供用于治療的增強的細胞制劑。在一個實施方案中，使用基因轉錄產(chǎn)物活性的檢測以選擇更好的細胞或細胞培養(yǎng)物。在一個優(yōu)選的實施方案中，基因是選自 Bcl211、Coxl0、Cptlb、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timml7b 和 Tomm40 的一個或多個基因。在另一個優(yōu)選的實施方案中，基因是選自Acaca、Aebpl、Cfd、Gpd_l、Jun、PPARgamma、 Ptpnl和UCPl的一個或多個基因。這些基因、基因轉錄物和由它們產(chǎn)生的蛋白可以通過如技術人員將容易地理解的很多種方法檢測。
[0028]進一步地，本發(fā)明還提供下列方面:
1.組合物，其用于治療宿主中的II型糖尿病，包含:
供應量的培養(yǎng)的來自供體的遺傳正常的成肌細胞，其以治療有效劑量向宿主的至少一種肌肉施用；和
治療有效劑量的向所述宿主施用的免疫抑制劑，
由此通過成肌細胞細胞核轉移向患者供應完整的人基因組，導致所述患者的基因轉錄物改變、肌肉介導的葡萄糖穩(wěn)態(tài)改善和癥狀減輕。
[0029]2.方面I的組合物，其中所述培養(yǎng)的成肌細胞獲自選自遺傳正常組的供體，包括但不限于所述宿主的父親或男性同胞。
[0030]3.方面I的組合物，其中對于II型糖尿病，所述培養(yǎng)的成肌細胞的所述選擇的治療有效劑量是約500億個細胞，并且其中所述劑量以每毫升患者血清約I億個細胞施用。
[0031]4.方面I的組合物，其中所述免疫抑制劑包含環(huán)孢菌素，所述環(huán)孢菌素在成肌細胞植入前5天開始以每天5到7mg/Kg體重口服施用，并且其中每周監(jiān)測環(huán)孢菌素全血谷水平，并且所述環(huán)孢菌素劑量根據(jù)需要重新調整以保持約250 ng/mL的血液水平，直至斷藥開始時第三周的開始，在操作后第三周的結束時完全斷藥。
[0032]5.方面I的組合物，其中通過檢測提供疾病癥狀減輕的多個基因的直接轉錄物的數(shù)量或質量的變化進行所述患者的II型糖尿病狀態(tài)的改善的測定。
[0033]6.方面I的組合物，用于預防宿主中II型糖尿病癥狀的發(fā)生，由此通過成肌細胞細胞核的轉移向所述患者供應完整的人基因組，導致基因轉錄物改變、正常葡萄糖穩(wěn)態(tài)的保持和糖尿病癥狀的缺失。
[0034]7.供應量的培養(yǎng)的來自供體的遺傳正常的成肌細胞和治療有效劑量的向宿主施用的免疫抑制劑在制備用于治療所述宿主中II型糖尿病的藥劑中的用途，所述遺傳正常的成肌細胞以治療有效劑量向所述宿主的至少一種肌肉施用，由此通過成肌細胞細胞核轉移向所述患者供應完整的人基因組，導致所述患者的基因轉錄物改變、肌肉介導的葡萄糖穩(wěn)態(tài)改善和癥狀減輕。
[0035]8.方面7的用途，其中所述培養(yǎng)的成肌細胞獲自選自遺傳正常組的供體，包括但不限于所述宿主的父親或男性同胞。
[0036]9.方面7的用途，其中對于II型糖尿病，所述培養(yǎng)的成肌細胞的所述治療有效劑量是約500億個細胞，并且其中所述劑量以每毫升患者血清約I億個細胞施用。
[0037]10.方面7的用途，其中所述免疫抑制劑包含環(huán)孢菌素，所述環(huán)孢菌素在成肌細胞植入前5天開始以每天5到7mg/Kg體重口服施用，并且其中每周監(jiān)測環(huán)孢菌素全血谷水平，并且所述環(huán)孢菌素劑量根據(jù)需要重新調整以保持約250 ng/mL的血液水平，直至斷藥開始時第三周的開始，在操作后第三周的結束時完全斷藥。
[0038]11.方面7的用途，其中通過檢測提供疾病癥狀減輕的多個基因的直接轉錄物的數(shù)量或質量的變化進行所述患者的II型糖尿病狀態(tài)的改善的測定。
[0039]12.方面7的用途，用于預防宿主中II型糖尿病癥狀的發(fā)生，由此通過成肌細胞細胞核的轉移向所述患者供應完整的人基因組，導致基因轉錄物改變、正常葡萄糖穩(wěn)態(tài)的保持和糖尿病癥狀的缺失。[0040]13.組合物，其用于治療宿主中的遺傳疾病，包含:
供應量的培養(yǎng)的來自供體的遺傳正常的成肌細胞，其以治療有效劑量向宿主的至少一種肌肉施用；和
治療有效劑量的向所述宿主施用的免疫抑制劑，
由此通過成肌細胞細胞核的轉移向所述宿主供應完整的人基因組，導致下列至少一種:基因轉錄物改變、肌肉生化改善、肌肉功能改善、肌肉結構改善、運動能力增加、血液噴射/血管化增加、和生化物質或離子跨肌細胞膜的轉移增加。
[0041]14.方面13的組合物，其中所述培養(yǎng)的成肌細胞與所述宿主是組織不相容的，其來源于選自遺傳正常組的供體，包括但不限于所述宿主的父親或男性同胞。
[0042]15.方面13的組合物，其中通過檢測提供疾病癥狀減輕的多個基因的直接轉錄物的數(shù)量或質量的變化進行所述宿主中改善的檢測。
[0043]16.方面13的組合物，其中對于肌肉營養(yǎng)不良，所述培養(yǎng)的成肌細胞的所述治療有效劑量是約500億個細胞，對于心肌病約10億個細胞，和對于II型糖尿病約500億個細胞，所述劑量以每毫升宿主血清約I億個細胞的劑量施用。
[0044]17.方面13的組合物，其中所述免疫抑制劑包含環(huán)孢菌素，所述環(huán)孢菌素在成肌細胞植入前五天開始以每天5至7mg/Kg體重口服施用，并且在操作后三周完全斷藥。
[0045]18.方面13的組合物，其中每周監(jiān)測環(huán)孢菌素全血谷水平，并且如果需要重新調整環(huán)孢菌素劑量以保持約250ng/mL直至斷藥開始時前一周。
[0046]19.供應量的培養(yǎng)的來自供體的遺傳正常的成肌細胞和治療有效劑量的向宿主施用的免疫抑制劑在制備用于治`療所述宿主中遺傳疾病的藥劑中的用途，所述遺傳正常的成肌細胞以治療有效劑量向宿主的至少一種肌肉施用，由此通過成肌細胞細胞核的轉移向所述患者供應完整的正常基因組，導致下列至少一種:基因轉錄物改變、肌肉生化改善、肌肉功能改善、肌肉結構改善、運動能力增加、血液噴射/血管化增加、和生化物質或離子跨肌細胞膜的轉移增加。
[0047]20.方面19的用途，其中所述培養(yǎng)的成肌細胞與所述宿主是組織不相容的，其來源于選自遺傳正常組的供體，包括但不限于所述宿主的父親或男性同胞。
[0048]21.方面19的用途，其中通過檢測提供疾病癥狀減輕的多個基因的直接轉錄物的數(shù)量或質量的變化進行所述宿主中改善的檢測。
[0049]22.方面19的用途，其中對于肌肉營養(yǎng)不良，所述培養(yǎng)的成肌細胞的所述治療有效劑量是約500億個細胞，對于心肌病約10億個細胞，和對于II型糖尿病約500億個細胞，所述劑量以每毫升宿主血清約I億個細胞的劑量施用。
[0050]23.方面19的用途，其中所述免疫抑制劑包含環(huán)孢菌素，所述環(huán)孢菌素在成肌細胞植入前五天開始以每天5至7mg/Kg體重口服施用，并且在操作后三周完全斷藥。
[0051]24.方面19的用途，其中每周監(jiān)測環(huán)孢菌素全血谷水平，并且如果需要重新調整環(huán)孢菌素劑量以保持約250ng/mL直至斷藥開始時前一周。
[0052]25.組合物，其用于通過成肌細胞細胞核的轉移供應宿主物種的全基因組而治療或預防宿主中遺傳疾病的癥狀的發(fā)生，包含:供應量的培養(yǎng)的遺傳正常的成肌細胞，其以治療有效劑量向所述宿主的至少一種肌肉施用。
[0053]26.方面25的組合物，其中對于肌肉營養(yǎng)不良，所述培養(yǎng)的成肌細胞的所述選擇的治療有效劑量是約500億個細胞，對于心肌病約10億個細胞，和對于II型糖尿病約500億個細胞，所述劑量以每毫升宿主血清約I億個細胞的劑量施用。
[0054]27.方面25的組合物，其中所述培養(yǎng)的成肌細胞與所述宿主是組織不相容的，其來源于選自遺傳正常組的供體，包括但不限于所述宿主的父親或男性同胞。
[0055]28.方面25的組合物，其中所述培養(yǎng)的成肌細胞與所述宿主是組織相容的，供體肌肉活組織檢查樣品在成為肌病之前已從所述宿主中獲得。
[0056]29.供應量的培養(yǎng)的遺傳正常的成肌細胞在制備藥劑中的用途，所述遺傳正常的成肌細胞以治療有效劑量向所述宿主的至少一種肌肉施用，所述藥劑用于通過經(jīng)成肌細胞細胞核轉移供應宿主物種的完整基因組而治療或預防所述宿主中遺傳疾病的癥狀發(fā)生。
[0057]30.方面29的用途，其中對于肌肉營養(yǎng)不良，所述培養(yǎng)的成肌細胞的所述選擇的治療有效劑量是約500億個細胞，對于心肌病約10億個細胞，和對于II型糖尿病約500億個細胞，所述劑量以每毫升宿主血清約I億個細胞的劑量施用。
[0058]31.方面29的用途，其中所述培養(yǎng)的成肌細胞與所述宿主是組織不相容的，其來源于選自遺傳正常組的供體，包括但不限于所述宿主的父親或男性同胞。
[0059]32.方面29的用途，其中所述培養(yǎng)的成肌細胞與所述宿主是組織相容的，供體肌肉活組織檢查樣品在成為肌病之前已從所述宿主中獲得。
[0060]33.發(fā)現(xiàn)用 于糖尿病治療的藥物化合物或細胞治療候選物的方法，包括將試驗化合物暴露于細胞的體外、先體外后體內或體內的組，測定選自Bcl211、CoxlO, Cptlb,Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timml7b和Tomm40的基因的一個或多個的基因活性，并使用陽性基因活性結果以確定用于糖尿病治療的試驗化合物的值。
[0061]34.方面33的方法，其中所述方法包括檢測基因轉錄物。
[0062]35.方面33的方法，其中所述方法包括檢測從轉錄的基因翻譯的蛋白的活性。
[0063]36.方面33的方法，其中所述方法包括免疫檢測從轉錄的基因翻譯的蛋白。
[0064]37.發(fā)現(xiàn)用于糖尿病治療的藥物化合物或細胞治療候選物的方法，包括將試驗化合物暴露于細胞的體外、先體外后體內或體內的組，測定選自Acaca、AebpU CfcU Gpd-UJun、PPAR y , Ptpnl和UCPl的基因的一個或多個的基因活性，并使用陽性基因活性結果以確定用于糖尿病治療的試驗化合物的值。
[0065]38.方面37的方法，其中所述方法包括檢測基因轉錄物。
[0066]39.方面37的方法，其中所述方法包括檢測從轉錄的基因翻譯的蛋白的活性。
[0067]40.方面37的方法，其中所述方法包括免疫檢測從轉錄的基因翻譯的蛋白。
[0068]實施例:人骨骼肌成肌細胞(hSkM)的肌內植入
此實施例顯示胰島素信號傳遞途徑、線粒體生物合成和功能的潛在基因表達概況分析，并表明如本文實施方案中所聲稱的實施效果。
[0069]將糖尿病KK小鼠分為三組:用基本培養(yǎng)基(M199)注射的KK對照組；用人成纖維細胞移植的KK成纖維細胞組；用hSkM移植的KK成肌細胞組。C57BL小鼠接受hSkM移植作為正常對照。將細胞移植入后肢的肌肉中。將所有動物用環(huán)孢菌素治療僅6周。進行葡萄糖耐受檢測。在細胞移植后12周，將小鼠在空腹狀態(tài)下處死。將植入的肌肉移除并進行基因表達概況分析研究。
[0070]動物和飲食——KK小鼠購自Jax Lab，Maine, USA。它是II型糖尿病的遺傳肥胖動物模型，并且表征具有高血糖、高胰島素血癥和葡萄糖不耐受12。在14-16周齡，它們比C57BL小鼠重約34%1CI。將小鼠分別安置在25°C下空調房間中的塑料籠中，具有12小時光照和12小時黑暗循環(huán)(光:上午9:00至下午9:00)，并且自由獲取食物(5K52 PMI NutritionInternational LLC, USA)和水(自來水)。將14-16周齡的小鼠篩選高血糖并用于實驗。使用符合下列標準的KK小鼠:(I)空腹血糖>6.5 mmol/L并且⑵在GTT期間在30分鐘或60分鐘時血糖> 20 mmol/L和在2小時時血糖>11 mmol/L10。
[0071]葡萄糖耐受檢測(GTT)—研究中使用的所有小鼠進行GTT。過夜空腹(約16小時)后，將小鼠用lg/kg體重的稀釋在蒸餾水中的葡萄糖(100mg/ml)腹膜內ij.p.)注射。在葡萄糖注射后0(葡萄糖注射前)、30、60和120分鐘收集來自尾靜脈的血液樣品。通過Accu-Chek Advantage 血糖儀(Roche, Germany)測定血糖濃度。
[0072]hSkM和人成纖維細胞的培養(yǎng)——在37°C下在5% CO2培養(yǎng)箱中，將人骨骼成肌細胞在225mm2的組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)和增殖，并用添加有10%胎牛血清、10 ng/ml FGF的M199(10% M199)維持直到匯合。如先前所述，評價hSkM培養(yǎng)物的純度和均勻性用于結蛋白和⑶56表達1CI’ 13。人成纖維細胞獲得自Toan Thang Phan副教授的實驗室，Departmentof Surgery, NUSj Singapore。
[0073]細胞標記和移植——在細胞移植前，將細胞用4，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma, USA)標記過夜 1CI。
[0074]將符合糖尿病標準的KK小鼠隨機分配到3組中:KK對照組(η=8):僅接受1.5mlM199，KK成纖維細胞組(n=8):接受含3xl07個人成纖維細胞的1.5ml M199，和KK成肌細胞組(n=8):接受含3xl07個hSkMs的1.5ml M199。將C57BL小鼠用作正常對照以確定hSKM移植相關的任何副作用并接受含3xl07個hSkMs的1.5ml M199。在麻醉下，將共計20次注射注射入小鼠的大腿的前內側的兩側肌肉、腿后側的肌肉和臀區(qū)的肌肉。注射后，小鼠回到其籠中進行恢復。所有動物在治療前三天接受環(huán)孢菌素治療(10 mg/kg/天)直至治療后6周。血液取樣后，動物在12周`處死。
[0075]免疫組織化學研究——將來自在細胞移植后12周外植的小鼠骨骼肌的DAPI+冷凍切片進行肌養(yǎng)蛋白表達的免疫染色，以確定hSkM細胞核整合入小鼠骨骼肌纖維1(1。簡而言之，將組織切片在100%的甲醇中在-20°C下固定20分鐘，然后與0.1%的Triton-100在4°C下孵育10分鐘。封閉后,在樣品上施加含以1:50稀釋的兔抗肌養(yǎng)蛋白(Sc-15376,Santa Cruz, USA)抗體的一抗溶液，并在室溫下孵育I小時。在此之后，施加以1:200稀釋的綴合有異硫氰酸熒光素(FITC) (F-4890，Sigma, USA)的山羊抗兔IgG I小時。徹底清洗后，將樣品用碘化丙唳復染并在奧林巴斯BX41 (Olympus, Japan)突光顯微鏡下觀察,并使用帶有Olympic Micro Image (Olympus, Japan)的數(shù)碼相機記錄圖像。
[0076]肌肉組織的分離和總RNA的制備一處死后，將大腿前內側的小鼠骨骼肌立即分離、收集并儲存在液氮中。根據(jù)制造商的說明用Trizol試劑(Invitrogen,USA)從冷凍肌肉樣品中提取總RNA。通過Nanodrop測定RNA的濃度和純度。用DNA酶I (Fermentas，USA)從總RNA中去除DNA污染。使用Maxima?第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas,USA) Ulyg總RNA中合成cDNA。對于一個陣列板使用I PL Cl μδ) cDNA。按照RT2 Profiler? PCRArray用戶手冊按照說明進行實時PCR循環(huán)。基因表達水平改變>2倍將被認為是在組之間顯著升高，而基因表達水平改變< 0.5倍將被認為是組之間顯著降低。通過定量PCR(QPCR)利用cDNA將進一步確認和量化基因表達水平。為了確認基因表達水平，使用Maxima? SYBRGreen qPCR Master Mix (2X) (Fermentas, USA)。使用 Primer Premier 5 軟件(PremierBiosoft, USA)設計引物。序列能夠根據(jù)要求獲得。40個循環(huán)的QPCR熱循環(huán)方案如下編程:初始變性10分鐘的I個循環(huán)，然后在95°C變性15秒，退火30秒并在72°C延伸30秒。
[0077]用于小鼠胰島素途徑和線粒體生物合成和功能的骨骼肌中基因表達概況的PCR分析試劑盒購自SABiosciences，USA。小鼠胰島素信號傳遞途徑RT2 Profiler? PCRArray (Cat PAMM-030, QIAGEN-SAbiosciences, USA)顯示涉及胰島素應答基因作用的 84個基因的表達概況。胰島素介導與葡萄糖攝取、糖原、脂質和蛋白合成、轉錄激活、細胞生長和分化相關的廣譜的生物應答。
[0078]小鼠線粒體RT2 Profiler? PCR Array (PAMM-087, QIAGEN-SAbiosciences,USA)顯示參與細胞能量站細胞器的生物合成和功能的84個基因的表達概況。通過此陣列監(jiān)測的基因包括不僅電子傳遞鏈和氧化磷酸化所需的代謝產(chǎn)物，還有維持對ATP合成重要的線粒體膜的極化和電位所需的離子的線粒體分子轉運的調節(jié)蛋白和介導蛋白。代謝和能量產(chǎn)生不是線粒體的唯一功能。由細胞內損傷信號傳遞活化的內在凋亡途徑基因也包括在此陣列中。
[0079]統(tǒng)計學分析:一使用SPSS 20進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)表示為平均值土標準誤差含義。將4-點葡萄糖測定的曲線下面積用于通過ANOVA比較三組間的差異。將p〈0.05的概率值認為是組間顯著性差異。
[0080]結果:細胞移植后12周hSkM在宿主肌肉中廣泛存活。葡萄糖耐受檢驗顯示在KK成肌細胞組的小鼠中的血糖相比KK對照和成纖維細胞組顯著下降。胰島素信號傳遞途徑的轉錄模式顯示相比于KK對照組(23個基因)、KK成纖維細胞組(8個基因)和C57BL組(8個基因)在KK成肌細胞組中的改變。線粒體生物合成和功能的轉錄模式也顯示相比于KK對照組(27個基因)、KK成纖 維細胞組(9個基因)和C57BL組(6個基因)在KK成肌細胞組中的改變。
[0081]令人驚訝地并且第一次發(fā)現(xiàn)，hSKM移植導致參與胰島素信號傳遞途徑和線粒體生物合成和功能的多個基因的基因轉錄物的變化。這伴有在糖尿病KK小鼠中葡萄糖耐受的改善和降低的高血糖。
[0082]體重一在治療后12周四個動物組的平均體重為:KK對照組=32.3± 1.3克，KK成纖維細胞=33.1±1.7克，和KK成肌細胞組=30.4±1.2克，和C57BL組=22.9±0.5克。KK小鼠的體重比C57BL小鼠的體重顯著更重(對于所有，ρ〈0.05)。雖然在KK成肌細胞組中有體重下降的趨勢，但在任何兩個KK組間沒有發(fā)現(xiàn)任何顯著性差異。
[0083]葡萄糖穩(wěn)態(tài)和細胞整合分析一在治療后12周小鼠的葡萄糖穩(wěn)態(tài)結果:ΚΚ成肌細胞組的HbAlc相比KK對照和KK成纖維細胞顯著降低。但是，它仍然顯著高于C57BL組(其用作正常對照)的。GTT顯示KK成肌細胞組在GTT期間具有顯著降低的血漿葡萄糖濃度，并且與C57BL組的類似。(相比KK對照和成纖維細胞ρ〈0.05，并且相比任何KK組:ρ〈0.05)。
[0084]hSkM細胞核整合入宿主肌肉纖維:hSkM細胞核的DAPI標記顯示100%標記效率。確定在小鼠骨骼肌中的肌養(yǎng)蛋白表達的免疫染色的DAPI陽性的hSkM的存活。同樣的組織用碘化丙啶復染以顯示所有細胞核。這兩個條件的圖像的疊加顯示hSkM細胞核整合入小鼠骨骼肌中。[0085]HbAlc和葡萄糖耐受檢驗的改善一糖基化血紅蛋白測定表明KK成肌細胞組的小鼠在hSkM移植后取得了顯著更好的葡萄糖控制。在治療后12周，KK成肌細胞組的HbAlc顯著低于KK對照和成纖維細胞組的HbAlc (對于兩者，p〈0.05)。C57BL組的HbAlc顯著低于任何KK組(對于所有，p<0.05)。
[0086]在KK成肌細胞組中觀察到血糖濃度顯著下降。在移植后12周，KK對照和成纖維細胞組動物具有嚴重的高血糖和葡萄糖不耐受。通過對比，KK成肌細胞組小鼠顯示相比于KK對照和成纖維細胞組的血糖顯著下降(對于兩者，p〈0.05)，并且達到與C57BL組幾乎相似的水平(P>0.05)。
[0087]hSkMs在宿主小鼠骨骼肌中的存活和整合一hSkMs的標記效率對于DAPI是100%。在細胞移植后12周在小鼠骨骼肌中發(fā)現(xiàn)如DAPI+細胞核所示hSkM的廣泛存活。
[0088]對于肌養(yǎng)蛋白表達的DAPI+組織的免疫染色顯示，hSkM細胞核與宿主細胞核在相同的肌纖維中共定位，暗示hSkM整合入宿主骨骼肌纖維中以形成雜交肌纖維，這是因為肌養(yǎng)蛋白連線出了骨骼肌纖維邊界。
[0089]在大腿前內側肌肉中胰島素信號傳遞途徑的基因表達的陣列分析 KK成肌細胞組相比于KK對照組
KK成肌細胞組中的小鼠與KK對照組相比，有22個基因轉錄物升高和I個降低，其為篩選的84個基因的27.4% (圖1)。22個升高的基因的大部分屬于蛋白代謝(13)、細胞生長與分化(9)、MAPK途徑(6)、和胰島素受體相關蛋白(6)、轉錄因子和調節(jié)蛋白(4)、碳水化合物代謝(4)功能組。轉錄物降低的唯一基因是過氧化物酶體增殖子激活受體Y (PPARy)的靶基因。這是新的和有趣的發(fā)現(xiàn)。
[0090]KK成肌細胞組相比于KK成纖維細胞組` KK成肌細胞組中的小鼠與KK成纖維細胞組相比，有8個(84的9.5%)基因轉錄物升高(圖1)。這8個基因屬于蛋白代謝(3)、細胞生長與分化(2)、胰島素受體相關蛋白(I)、轉錄因子和調節(jié)蛋白⑶和PPAR Y的靶基因(3)功能組。
[0091 ] KK成肌細胞組相比于C57BL組
與C57BL組相比，KK成肌細胞組中的小鼠有8個基因轉錄物改變(圖1)。在這些中，7個基因轉錄物升高，I個降低。7個升高的基因的大部分屬于蛋白代謝(4) ,MAPK途徑(2)、碳水化合物代謝(3)和P1-3激酶途徑(2)功能組。轉錄降低的唯一基因是Glut-1。PPARy基因轉錄物中沒有變化。
[0092]在大腿前內側肌肉中線粒體生物合成和功能的基因表達的陣列分析 KK成肌細胞組相比于KK對照組
與KK對照組相比，KK成肌細胞組有27個(84的32.1%)基因轉錄物升高(圖2)。27個基因的大部分屬于小分子轉運(7)、線粒體轉運(7)、內膜易位(5)、對線粒體的靶向蛋白(4)、線粒體蛋白輸入(4)、線粒體分裂和融合(4)、線粒體定位(3個升高)、和外膜易位
(2)、和膜的極化與電位(2)功能組。
[0093]KK成肌細胞組相比于KK成纖維細胞組
與KK成纖維細胞組相比，KK成肌細胞組僅有9個(84的10.7%)基因轉錄物升高(圖2)。9個基因的大部分屬于小分子轉運(2)、線粒體轉運(4)、內膜易位(I)、對線粒體的靶向蛋白(I)、線粒體蛋白輸入(2)、線粒體分裂和融合(I)、外膜易位(I)，和膜的極化與電位(2)功能組。屬于線粒體定位功能組的基因在KK成肌細胞和KK成纖維細胞組之間沒有顯示任何顯著性差異。
[0094]KK成肌細胞組相比于C57BL組
與C57BL組相比，KK成肌細胞組有更少的線粒體基因轉錄物改變(圖2)。5個基因轉錄物升高并且I個基因轉錄物降低。5個基因屬于小分子轉運(I)、線粒體轉運(2)、內膜易位(I)、對線粒體的靶向蛋白(4)、線粒體蛋白輸入(4)、線粒體分裂和融合(I)、線粒體定位(I個升高)、和外膜易位(2)、和膜的極化與電位(2)功能組。轉錄降低的唯一基因是Slc25a25，其是小分子轉運基因。
[0095]屬于對線粒體的靶向蛋白、線粒體蛋白輸入和外膜易位等功能組的基因在KK成肌細胞和C57BL組之間沒有顯示任何顯著性差異。
[0096]實施例令人驚訝地顯示hSkM移植后，胰島素信號傳遞途徑和線粒體生物合成和功能的基因概況在KK小鼠的骨骼肌中發(fā)生改變，如同基因轉錄物證明的改變。hSkM移植后與KK對照小鼠相比，KK小鼠骨骼肌中胰島素信號傳遞途徑和線粒體生物合成和功能分別有23個(27.4%)和27個(32.1%)基因轉錄物改變。但是，與KK成纖維細胞組相比基因數(shù)目降低到 8 (9.5%)和9 (10.7%)，并且與C57BL組相比降低到8 (9.5%)和6 (7.1%)。這些表明hSkM移植入KK小鼠骨骼肌中改變了參與胰島素信號傳遞途徑和線粒體生物合成和功能的基因的表達水平。不希望被任何理論或此實施方案中的“要點”所限制，認為這些改變直接地或間接地有助于降低的高血糖和改善的葡萄糖耐受。
[0097]這些結果顯示，hSkM移植實現(xiàn)了更好的葡萄糖穩(wěn)態(tài)和改善的葡萄糖耐受，其伴有在使用短期免疫抑制治療在細胞移植后12周時hSkMs在KK小鼠骨骼肌中廣泛的存活。hSkM細胞核整合入宿主骨骼肌纖維。供體成肌細胞和宿主骨骼肌纖維之間的融合形成雜交肌纖維。不希望被任何理論或本實施方案的“要點”所約束，認為這可以幫助供體hSkM在環(huán)孢菌素治療停藥后逃避宿主的免疫排斥，因為成熟的骨骼肌纖維不表達主要組織相容性復合物I類抗原14。供體細胞核還可以在雜交肌纖維中共表達外源基因連同宿主基因。實施例的結果進一步證明正常hSkM的植入可以升高參與胰島素信號傳遞途徑的22個基因和參與線粒體生物合成和功能的27個基因的表達水平。
[0098]發(fā)現(xiàn)與KK對照組相比，在KK成肌細胞組中胰島素信號傳遞途徑的23個基因發(fā)生改變:22個升高和I個降低。除了胰島素信號傳遞功能組的二次效應物靶基因之外，所有其它功能組均有基因顯著地改變。尤其是，這些基因的一半(23個基因的56.55%)參與蛋白代謝。它們的大部分是多功能的并且參與其它功能組。例如，Cebpa、Frs2、Hrasl、Jun、Leptin> Raf和Shcl不僅參與細胞生長和分化,而且還參與蛋白代謝。
[0099]與KK成纖維細胞組相比，在KK成肌細胞組中8個基因轉錄物升高:Acaca、Aebpl、CfcU Gpd-1、Jun、PPAR Y、Ptpnl和UCPl。與C57BL組相比，在KK成肌細胞組中7個基因轉錄物升高并且 I 個降低:Braf、Frapl、Gpd_l、Igf2、Leptin、Ppplca 和 UCPl 升高，而 Glut-1降低。我們發(fā)現(xiàn)與不僅KK對照小鼠還有接受人成纖維細胞移植的KK小鼠相比，只有接受hSkM移植的KK小鼠具有顯著改善的高血糖、葡萄糖耐受和胰島素抵抗。但是，KK成肌細胞組沒有發(fā)展出與C57BL組同樣的葡萄糖穩(wěn)態(tài)。因此，令人驚訝地看到尤其是在細胞移植治療的背景下，Acaca、AebpUCfd, Gpd-1、Jun、PPAR y、Ptpnl 和 UCPl 比其它剩余的 15 個有助于葡萄糖穩(wěn)態(tài)的基因更重要。所有剩余的15個基因轉錄物水平在KK成肌細胞和KK成纖維細胞組之間是類似的。
[0100]與KK成纖維細胞組相比，在KK成肌細胞組中線粒體生物合成和功能的27個基因升高。在KK成肌細胞組中，所有功能組具有顯著改變的基因。所述基因的一半(27個的51.9%)參與小分子轉運(7)和線粒體轉運(7)。除了小分子轉運、內膜和外膜易位的基因，大部分其它基因還是多功能的并且參與其它功能組。例如，Aip、Cptlb和Grpell不僅參與線粒體轉運，而且還參與線粒體蛋白輸入和對線粒體的靶向蛋白。
[0101]當與KK成纖維細胞組相比時，KK成肌細胞組顯示在9個基因中基因轉錄物升高:Bcl211、Coxl0、Cptlb、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timml7b、Tomm40 和 UCPl0 當與 C57BL組相比時，KK成肌細胞組顯示在5個基因中基因轉錄物升高:Bcl211、0pal、Sfn、Slc25a22和UCP1，并且在I個基因中基因轉錄物降低:Slc25a25。發(fā)現(xiàn)與KK對照和KK成纖維細胞小鼠相比，只有接受hSkM移植的KK小鼠具有顯著改善的高血糖、葡萄糖耐受和胰島素抵抗。盡管如此，他們沒有發(fā)展出與C57BL小鼠同樣的葡萄糖穩(wěn)態(tài)。因此，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)Bcl211、CoxlO、Cptlb、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timml7b、Tomm40 比剩余的 19 個有助于葡萄糖穩(wěn)態(tài)的基因更重要，這是因為剩余的19個基因轉錄物水平在KK成肌細胞和KK成纖維細胞組之間是類似的。
[0102]該結果顯示SkM移植補充了缺失的參與葡萄糖轉運和代謝的基因。參與胰島素信號傳遞途徑和線粒體生物合成和功能的多基因的表達水平顯著升高。這些改變直接地或間接地有助于增強骨骼肌中葡萄糖轉運和代謝。從而，這導致KK小鼠的降低的高血糖和高胰島素血癥和改善的糖尿病表型。
[0103]因此，令人驚訝地顯示正常hSkM異種移植入KK小鼠的肢骨骼肌中上調參與胰島素信號傳遞途徑和線粒體生物合成和功能的多個基因的表達。在KK小鼠中這伴有改善的葡萄糖耐受和降低的高血糖。在此背景下發(fā)現(xiàn)的具體基因對于監(jiān)測疾病(具體為糖尿病)發(fā)生、進展和通過細胞助增的可能的和實際的治療是有用的工具。這些基因的一個或多個的檢測在用疾病緩解劑諸如細胞助增諸如本文所述的那些治療之前、期間和之后是尤其有幫助的。這些基因及其產(chǎn)物還可用`于選擇優(yōu)秀細胞克隆來用于正在出現(xiàn)的細胞治療劑領域中。技術人員將容易理解使用本文描述的一個或多個具體的基因以選擇繁殖用于疾病治療和預防的細胞的方法。
[0104]權利要求是示例性的而非限制性的?；诒疚牡墓_內容，技術人員可以確定其它相關的實施方案，并且篇幅考慮排除了在閱讀本公開后容易理解的此類實施方案的進一步的詳盡列舉。下列參考文獻通過引用以其整體具體并入。具體并入的是所公開的用于獲得和生長細胞以及測定生物化學(包括蛋白和DNA/RNA)和細胞標志物的方法和材料。最具體地是，用于參考文獻11和14中所述的肌細胞活組織檢查、培養(yǎng)、鑒定和用途的每一個臨床步驟、程序和材料用途通過引用具體并入。
【權利要求】
1.組合物，其用于治療宿主中的II型糖尿病，包含:供應量的培養(yǎng)的來自供體的遺傳正常的成肌細胞，其以治療有效劑量向宿主的至少一種肌肉施用；和治療有效劑量的向所述宿主施用的免疫抑制劑，由此通過成肌細胞細胞核轉移向患者供應完整的人基因組，導致所述患者的基因轉錄物改變、肌肉介導的葡萄糖穩(wěn)態(tài)改善和癥狀減輕。
2.權利要求1的組合物，其中所述培養(yǎng)的成肌細胞獲自選自遺傳正常組的供體，包括但不限于所述宿主的父親或男性同胞。
3.權利要求1的組合物，其中對于II型糖尿病，所述培養(yǎng)的成肌細胞的所述選擇的治療有效劑量是約500億個細胞，并且其中所述劑量以每毫升患者血清約I億個細胞施用。
4.權利要求1的組合物，其中所述免疫抑制劑包含環(huán)孢菌素，所述環(huán)孢菌素在成肌細胞植入前5天開始以每天5到7mg/Kg體重口服施用，并且其中每周監(jiān)測環(huán)孢菌素全血谷水平，并且所述環(huán)孢菌素劑量根據(jù)需要重新調整以保持約250 ng/mL的血液水平，直至斷藥開始時第三周的開始，在操作后第三周的結束時完全斷藥。
5.權利要求1的組合物，其中通過檢測提供疾病癥狀減輕的多個基因的直接轉錄物的數(shù)量或質量的變化進行所述患者的II型糖尿病狀態(tài)的改善的測定。
6.權利要求1的組合物，用于預防宿主中II型糖尿病癥狀的發(fā)生，由此通過成肌細胞細胞核的轉移向所述患者供應完整的人基因組，導致基因轉錄物改變、正常葡萄糖穩(wěn)態(tài)的保持和糖尿病癥狀的缺失。
7.發(fā)現(xiàn)用于糖尿病治療的藥物化合物或細胞治療候選物的方法，包括將試驗化合物暴露于細胞的體外、先體外后體內或體內的組，測定選自Bcl211、CoxlO、Cptlb、Slc25a22、 Slc25a25、Stard3、Timml7b和Tomm40的基因的一個或多個的基因活性，并使用陽性基因活性結果以確定用于糖尿病治療的試驗化合物的值。
8.權利要求7的方法，其中所述方法包括檢測基因轉錄物。`
9.發(fā)現(xiàn)用于糖尿病治療的藥物化合物或細胞治療候選物的方法，包括將試驗化合物暴露于細胞的體外、先體外后體內或體內的組，測定選自Acaca、AebpU Cfd、Gpd-1> Jun> PPAR y , Ptpnl和UCPl的基因的一個或多個的基因活性，并使用陽性基因活性結果以確定用于糖尿病治療的試驗化合物的值。
10.權利要求9的方法，其中所述方法包括檢測基因轉錄物。
【文檔編號】A61K48/00GK103550784SQ201310455357
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權日:2013年8月16日
【發(fā)明者】彼得·K·羅 申請人:彼得·K·羅