>[0070] S5a、獲取臍帶血造血干細胞；
[0071] 采集50-100mL的臍帶血，與PBS緩沖液以1 :1混合稀釋得到臍帶血稀釋液；然后， 在15mL無菌塑料離心管內(nèi)加入4mL密度為1. 077g/mL的Ficoll分離液（Ficoll分離液是 一種根據(jù)細胞密度差異，借助離心產(chǎn)生的重力加速度，進行細胞的分離純化的常用試劑，購 自于Sigma公司），用吸管輕輕地將臍帶血稀釋液滴加到Ficoll液面上，以2500轉(zhuǎn)/分鐘 的轉(zhuǎn)速密度梯度離心25分鐘，其中，F(xiàn)icoll分離液與臍帶血稀釋液的比例為1: (1-2);離心 結(jié)束后，用吸管吸取中間白膜層，獲得臍帶血單個核細胞。
[0072] S6a、采用免疫磁珠細胞分選法分選出造血干細胞⑶34+細胞；
[0073] 將步驟S5a中獲得的臍帶血單個核細胞以臺盼藍染色計數(shù)活細胞后調(diào)整細胞密 度為2 X 10s個/ml的細胞懸液，加入CD34抗體，每100 μ LCD34抗體加入lml細胞懸液，用 移液器上下吹打充分混勻，室溫孵育15分鐘。按每毫升細胞懸液加入50 μ L磁珠的比例，加 入磁珠充分吹打混勻，室溫孵育10分鐘。將細胞轉(zhuǎn)入聚苯乙烯試管（12 X 75rnm)，加 PBS洗 滌液（含2% FBS、0. 01% EDTA)至2. 5ml，在試管內(nèi)用移液器上下輕輕吹打2-3次，混勻細 胞。再將試管插入磁極中，靜置五分鐘。將磁極連試管一起拿起，以連續(xù)緩慢的動作傾倒磁 極至倒置狀態(tài)，倒出上清部分。磁性標(biāo)記的細胞由于磁極磁場的吸引，仍然留在試管內(nèi)。保 持磁極及試管倒置2-3秒，然后使試管口恢復(fù)向上的位置。從磁極中取出試管，加入2. 5ml 洗滌液，用移液器輕輕吹打細胞懸液2-3次，混勻細胞，再將試管放回磁極中，靜置五分鐘。 重復(fù)洗滌4次后，試管中保留的為造血干細胞⑶34+細胞，備用。
[0074] S7a、接種造血干細胞⑶34+細胞進行擴增培養(yǎng)
[0075] 吸去步驟S4a中的成骨誘導(dǎo)液，取步驟S6a中獲得的造血干細胞⑶34+細胞，用微 量移液器均勻地將造血干細胞⑶34+細胞以2 X 10 4個/孔或2 X 10 5個/孔接種于步驟S4a 中含有成骨細胞的生物衍生骨支架，于37°C、5% C02、1% 02和飽和濕度條件下放置3h，保 證生物衍生骨的濕潤，可加少量MDM培養(yǎng)基以使生物衍生骨充分濕潤；待生物衍生骨充分 濕潤后，加入己添加1 μΜ氫化可的松的完全培養(yǎng)基，無需添加外源細胞因子，于37°C、5% C02、1 % 02和飽和濕度條件下培養(yǎng)，每周半量換液2次。培養(yǎng)第2和第5周以PBS洗滌生物 衍生骨2次，收集非粘附細胞。有部分造血細胞與誘導(dǎo)的成骨細胞粘附，需將生物衍生骨浸 入CDS液（CDS液是非酶性的消化液可以孵育更長的時間而不影響細胞表面的抗原決定簇） 浸泡，37°C孵育20min后250g離心10min收集細胞，與非粘附細胞混合，即收獲擴增后的造 血干細胞。
[0076] 為進一步驗證本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法的顯著效果， 通過以下實驗及實驗數(shù)據(jù)進行具體說明。
[0077] 檢測對象
[0078] 檢測組1 一本發(fā)明實施例1所獲得的細胞；
[0079] 對照組1 一與本發(fā)明的不同之處在于，該組為采用二維培養(yǎng)體系培養(yǎng)造血干細胞 所獲得的細胞。
[0080] 檢測一、臺盼藍法進行細胞計數(shù)
[0081] 取檢測組1及對照組1的細胞，分別執(zhí)行以下操作：
[0082] 用75 %酒精清洗計數(shù)板和蓋玻片，用吸水紙擦干；在每次細胞補液前取10ul細 胞懸液和l〇ul的0. 4%苔盼藍充分混合，再加80ul的PBS緩沖液稀釋細胞懸液；吸取少 量細胞懸液，加入在計數(shù)板上的蓋玻片內(nèi)，一定注意不要溢出至計數(shù)板上的小槽內(nèi)，也不 要過少或帶氣泡，在倒置顯微鏡下觀察血球計數(shù)板上計數(shù)4個大方格內(nèi)的細胞總數(shù)，并根 據(jù)以下公式計算出細胞密度：細胞懸液密度計算公式一細胞密度=(4個大格細胞總數(shù) /4) X 104X 10 (稀釋倍數(shù)）個/ml ;并利用流式細胞儀對培養(yǎng)后的細胞做CD34和CD38表型 分析，結(jié)果見下表1。
[0086] 檢測結(jié)果：由表1中的數(shù)據(jù)可知，對造血干細胞培養(yǎng)兩周后，檢測組中的所獲得的 ⑶34+細胞濃度增加了 3. 3-4. 8倍，以⑶34 7⑶38細胞為主，占82% -92%，且均遠大于對 照組所獲得的細胞，由此說明，本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法提高 了造血干細胞的增殖率。
[0087] 綜上所述，本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，通過采用含有 成骨細胞的生物衍生骨作為三維培養(yǎng)支架，并使得造血干細胞與成骨細胞共培養(yǎng)的方式于 低氧環(huán)境下進行造血干細胞的擴增培養(yǎng)，不僅能夠模擬適宜造血干細胞生長的體內(nèi)骨髓微 環(huán)境的三維多孔結(jié)構(gòu)，增加造血干細胞的生長空間及與培養(yǎng)基等的接觸面積，而且成骨細 胞能夠分泌促進造血干細胞生長增殖的細胞因子以及促進造血干細胞保持其干細胞特性 的因子，從而省去添加外源細胞因子的步驟，實現(xiàn)了節(jié)約成本，且提高造血干細胞活性及增 值率，以及保持造血干細胞的干細胞特性的目的。
[0088] 以上結(jié)合對本發(fā)明的實施例進行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實施 方式，上述的【具體實施方式】僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本 發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護的范圍情況下，還可做出很多形式， 這些均屬于本發(fā)明的保護之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：獲取造 血干細胞，并接種于含有成骨細胞的生物衍生骨上對所述造血干細胞進行體外擴增培養(yǎng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，其特征在于，所述 成骨細胞是通過誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化而獲得的。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，其特征在于，誘導(dǎo) 骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化為成骨細胞的過程包括以下步驟： 獲取骨髓間充質(zhì)干細胞接種于生物衍生骨，靜置4-6小時后，加入完全培養(yǎng)基進行擴 增培養(yǎng)，獲得擴增后的骨髓間充質(zhì)干細胞；用所述成骨誘導(dǎo)液對擴增后的骨髓間充質(zhì)干細 胞進行誘導(dǎo)培養(yǎng)7-10天，每2-4天換液一次，即獲得含有成骨細胞的生物衍生骨。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，其特征在于，獲取 造血干細胞的過程包括以下步驟：采集臍帶血，與PBS緩沖液以1 : (1-2)的體積比混合稀 釋得到臍帶血稀釋液，于Ficoll分離液離心，取中層單個核細胞，即臍帶血單個核細胞，再 采用免疫磁珠細胞分選法從所述臍帶血單個核細胞中分選出造血干細胞CD34+細胞。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，其特征在于，對所 述造血干細胞進行體外培養(yǎng)的步驟為：將所述造血干細胞CD34+細胞接種至所述含有成骨 細胞的生物衍生骨上于培養(yǎng)基中、氧氣體積百分比為1%的環(huán)境下進行培養(yǎng)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，其特征在于，所述 培養(yǎng)基中添加有1_5μΜ的氫化可的松。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，其特征在于，所 述生物衍生骨的制備過程包括以下步驟：取骨塊于Η202溶液中浸泡36~80小時，每隔一段 時間換液一次；再浸泡于雙蒸水中20~60分鐘后，依次于乙醇和丙酮中分別浸泡12~36 小時后，再于雙蒸水中浸泡20~60分鐘后，干燥冷凍，并滅菌。8. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，其特征在于，所 述生物衍生骨在接種細胞之前還包括對所述生物衍生骨預(yù)處理的步驟：將所述生物衍生骨 浸泡于PBS溶液中1-3天，去除骨渣，然后浸泡于無血清培養(yǎng)基中2-4天，再加入FBS浸潤 1-5小時，獲得浸潤后的生物衍生骨。9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，其特征在于，所述 完全培養(yǎng)基中添加有80-120U/ml的青霉素、80-120mg/ml的鏈霉素、0. 15-0. 50mg/ml的谷 氨酞胺以及l(fā)_5mg/ml的HEPES緩沖液。10. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，其特征在于，所 述成骨誘導(dǎo)液包括10 7-1〇 9mol/L的地塞米松、25-75μg/ml的維生素C和5-15mmol/L的 β-甘油磷酸鈉。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，包括以下步驟：獲取造血干細胞，并接種于含有成骨細胞的生物衍生骨上對所述造血干細胞進行體外擴增培養(yǎng)。通過采用含有成骨細胞的生物衍生骨作為三維培養(yǎng)支架，使得造血干細胞與成骨細胞于生物衍生骨中共培養(yǎng)，增加了造血干細胞與培養(yǎng)基及成骨細胞近分泌的接觸面積，有利于促進造血干細胞的生長增殖；同時，成骨細胞還能夠分泌有利于造血干細胞保持其干細胞特性的因子，使得擴增后的造血干細胞依然能夠具有多向分化的潛能，解決了現(xiàn)有技術(shù)中，采用二維培養(yǎng)體系培養(yǎng)造血干細胞存在的細胞活性差，增值率低，且造血干細胞易喪失其干細胞特性等問題。
【IPC分類】C12N5/0789
【公開號】CN105316294
【申請?zhí)枴緾N201510690354
【發(fā)明人】曾憲卓, 魯菲
【申請人】深圳華毓造血干細胞研究有限公司
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年10月22日