模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞工程技術領域，特別涉及一種模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的 方法。
【背景技術】
[0002] 目前造血干細胞通常有三個來源：骨髓、外周血及臍帶血，造血干細胞具有較強 的自我增殖能力，且臍帶血具有富含更早期的造血干細胞、采集方便，造血干細胞免疫原性 弱、對異源性抗原產(chǎn)生的抗體少、移植過程中不需要嚴格配型、成熟性T細胞較少、采集和 保存容易、無腫瘤細胞污染、對供者無損傷及副作用、⑶34+⑶38-與⑶34+⑶33-的比例較 高等優(yōu)點，因而臍帶血造血干細胞具有極大的臨床應用價值。但是，單份臍血的造血干細胞 含量低，在臨床中很難用于正常體重成人患者的移植。因此，造血干細胞在移植前需要進行 體外擴增。
[0003] 目前，造血干細胞的體外擴增培養(yǎng)通常采用二維培養(yǎng)體系，并添加促進造血干細 胞生長的細胞因子，但二維培養(yǎng)體系存在細胞活性差，增殖率低，且細胞因子較昂貴，容易 使造血干細胞失去其干細胞特性，無法進行多向誘導分化等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術問題是，針對現(xiàn)有技術中采用二維誘導培養(yǎng)體系誘導造血 干細胞存在細胞活性差，增殖率低，且造血干細胞易喪失其干細胞特性等缺陷，提供一種能 夠提高造血干細胞活性及增值率且能夠保持干細胞特性的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細 胞的方法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：提供一種模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血 干細胞的方法，包括以下步驟：
[0006] 獲取造血干細胞，并接種于含有成骨細胞的生物衍生骨上對所述造血干細胞進行 體外擴增培養(yǎng)。
[0007] 在本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法中，所述成骨細胞是通過 誘導骨髓間充質干細胞轉化而獲得的。
[0008] 在本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法中，誘導骨髓間充質干細 胞轉化為成骨細胞的過程包括以下步驟：
[0009] 獲取骨髓間充質干細胞接種于生物衍生骨，靜置4-6小時后，加入完全培養(yǎng)基進 行擴增培養(yǎng)，獲得擴增后的骨髓間充質干細胞；用所述成骨誘導液對擴增后的骨髓間充質 干細胞進行誘導培養(yǎng)7-10天，每2-4天換液一次，即獲得含有成骨細胞的生物衍生骨。 [0010] 在本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法中，獲取造血干細胞的過 程包括以下步驟：采集臍帶血，與PBS緩沖液以1 : (1-2)的體積比混合稀釋得到臍帶血稀 釋液，于Ficoll分離液離心，取中層單個核細胞，即臍帶血單個核細胞，再采用免疫磁珠細 胞分選法從所述臍帶血單個核細胞中分選出造血干細胞CD34+細胞。 toon] 在本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法中，對所述造血干細胞進 行體外培養(yǎng)的步驟為：將所述造血干細胞CD34+細胞接種至所述含有成骨細胞的生物衍生 骨上于培養(yǎng)基中、氧氣體積百分比為1%的環(huán)境下進行培養(yǎng)。
[0012] 在本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法中，所述培養(yǎng)基中添加有 1-5 μ Μ的氫化可的松。
[0013] 在本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法中，所述生物衍生骨的制 備過程包括以下步驟：取骨塊于Η202溶液中浸泡36~80小時，每24~36小時換液一次； 再浸泡于雙蒸水中20~60分鐘后，依次于乙醇和丙酮中分別浸泡12~36小時后，再于雙 蒸水中浸泡20~60分鐘后，干燥冷凍，并滅菌。
[0014] 在本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法中，所述生物衍生骨在接 種細胞之前還包括對所述生物衍生骨預處理的步驟：將所述生物衍生骨浸泡于PBS溶液中 1-3天，去除骨渣，然后浸泡于無血清培養(yǎng)基中2-4天，再加入FBS浸潤1-5小時，獲得浸潤 后的生物衍生骨。
[0015] 在本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法中，所述完全培養(yǎng)基中 添加有80-120U/ml的青霉素、80-120mg/ml的鏈霉素、0. 15-0. 50mg/ml的谷氨酞胺以及 l-5mg/ml 的 HEPES 緩沖液。
[0016] 在本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法中，所述成骨誘導液包括 10 7-10 9mol/L的地塞米松、25-75 μ g/ml的維生素 C和5-15mmol/L的β -甘油磷酸鈉。
[0017] 實施本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，可以達到以下有益效 果：通過采用經(jīng)處理后的含有成骨細胞的生物衍生骨作為三維培養(yǎng)支架，以模擬骨髓三維 微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞，并且，利用成骨細胞分泌的黏附因子使成骨細胞與造血干細胞相 黏附，并共同黏附于生物衍生骨上，增加了造血干細胞與培養(yǎng)基及成骨細胞近分泌的接觸 面積，有利于促進造血干細胞的生長增殖；同時，成骨細胞還能夠分泌有利于造血干細胞保 持其干細胞特性的因子，使得擴增后的造血干細胞依然能夠具有多向分化的潛能，解決了 現(xiàn)有技術中，采用二維培養(yǎng)體系培養(yǎng)造血干細胞存在的細胞活性差，增值率低，且造血干細 胞易喪失其干細胞特性等問題。
【具體實施方式】
[0018] 為解決現(xiàn)有技術中采用二維體系培養(yǎng)造血干細胞存在細胞活性差，增殖率低，易 喪失干細胞特性等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點在于提供一種含有成骨細胞的生物衍生骨的三維 培養(yǎng)體系以模擬骨髓微環(huán)境，通過三維培養(yǎng)體系為造血干細胞提供充足的生長空間及接觸 培養(yǎng)基的面積，而成骨細胞又能夠分泌促進造血干細胞生長增殖的細胞因子以及維持造血 干細胞特性的促進因子，從而可提高造血干細胞的細胞活性及增值率并能夠維持造血干細 胞的干細胞特性。
[0019] 具體地，本發(fā)明提供的模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)造血干細胞的方法，包括以下步驟：獲 取造血干細胞，并接種于含有成骨細胞的生物衍生骨上對造血干細胞進行體外擴增培養(yǎng)； 本發(fā)明中所采用的成骨細胞是通過誘導骨髓間充質干細胞轉化而來的，當然也可直接從骨 組織中獲取。
[0020] 具體包括以下步驟：
[0021] SI、獲取骨髓間充質干細胞；
[0022] S2、制備生物衍生骨；
[0023] S3、預處理步驟S2中獲得的生物衍生骨，獲得浸潤后的生物衍生骨；
[0024] S4、將骨髓間充質干細胞接種于浸潤后的生物衍生骨內(nèi)進行擴增培養(yǎng)后，再用成 骨誘導液進行誘導反應7-10天，獲得含有成骨細胞的生物衍生骨。
[0025] S5、獲取臍帶血單個核細胞并采用免疫磁珠細胞分選法分選出造血干細胞⑶34+細胞；
[0026] S6、將步驟S5中分選出來的造血干細胞⑶34+細胞接種于步驟S4獲得的含有成 骨細胞的生物衍生骨上進行擴增培養(yǎng)。
[0027] 進一步地，步驟S1 :獲取骨髓間充質干細胞的具體過程為：
[0028] 采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分離液中離心，取中層單核細胞，加入PBS緩沖 液，離心洗滌，棄上清液，即收獲原代骨髓間充質干細胞。
[0029] 可以理解的是，上述骨髓間充質干細胞的獲取方式僅為本發(fā)明提供的其中一種， 本領域技術人員采用其他方式獲取的骨髓間充質干細胞同樣適用于本發(fā)明；另外，也可利 用現(xiàn)有技術中骨髓間充質干細胞的分離純化方法對步驟S1獲取的骨髓間充質干細胞作進 一步純化。
[0030] 步驟S2 :生物衍生骨的制備具體包括以下步驟：
[0031] 取lcmXO. 5cmX0. 5cm骨塊于!1202溶液浸泡36~80小時，每隔一段時間換液一 次，對骨塊進行殺菌脫蛋白；再浸泡于雙蒸水中20~60分鐘后，依次于乙醇和丙酮中分別 浸泡12~36小時，去除骨組織中殘留的蛋白，再于雙蒸水中浸泡20~60分鐘后，干燥冷 凍，并滅菌，即獲得生物衍生骨，密封保存。
[0032] 經(jīng)過上述物理、化學處理后獲得的生物衍生骨，去掉了骨塊中的細胞成分及抗原 性，基本保持了原來生物體內(nèi)的孔隙網(wǎng)架結構，有利于細胞粘附、生長并為細胞外基質分泌 提供充分的空間及表面積，同時還具有良好的骨傳導性和骨誘導性，有利于促進骨髓間充 質干細胞轉化成成骨細胞。
[0033] 步驟S3 :預處理生物衍生骨，以增強生物衍生骨表面的細胞親和性，有利于細胞 貼附，并使培養(yǎng)基中的細胞因子和營養(yǎng)因子部分融入到生物衍生骨內(nèi)，有利于骨髓間充質 干細胞的生長，具體過程為：
[0034] 將S2中獲得的生物衍生骨浸泡于PBS溶液中1-3天，去除骨渣，然后浸泡于無血 清培養(yǎng)基2-4天，再加入FBS (胎牛血清）浸潤1-5小時，獲得浸潤后的生物衍生骨，以使生 物衍生骨中融有無血清培養(yǎng)基及FBS，更有利于骨髓間充質干細胞的貼壁生長。
[0035] 步驟S4 :將步驟S1獲取的骨髓間充質干細胞接種于步驟S3中浸潤后的生物衍生 骨上并進行多次擴增培養(yǎng)后，加入成骨誘導液進行誘導培養(yǎng)，具體過程為：
[0036] S41、將骨髓間充質干細胞與步驟S3中獲得的浸潤后的生物衍生骨混合，靜置4-6 小時后，待骨髓間充質干細胞與生物衍生骨充分貼附后加入完全培養(yǎng)基于體積百分比為 0. 5%~6% 02條件下進行第一次擴增培養(yǎng)，2-4天后，將生物衍生骨轉移至新的孔板中，以 剔除死細胞，添加完全培養(yǎng)基繼續(xù)進行第二次擴增培養(yǎng)；當然也可根據(jù)實際情況進行三次 以上擴增培養(yǎng)，以獲取足夠量的骨髓間充質干細胞。
[0037] 其中，