一株生產(chǎn)l-羥脯氨酸的細(xì)菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一株生產(chǎn)L-羥脯氨酸的細(xì)菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] L-羥脯氨酸為亞氨基酸，不屬于20種常見氨基酸，它是脯氨酸羥基化后的產(chǎn)物， 膠原蛋白的主要組成成分，主要應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、動物飼料、營養(yǎng)和美容業(yè)等方面。近年來 對L-羥脯氨酸的研究和開發(fā)已經(jīng)引起廣泛關(guān)注：L_羥脯氨酸具有抗氧化、抗輻射的作用， 在美容業(yè)方面可作為化妝品添加劑；L-羥脯氨酸具有減肥作用，未來可成為比較理想的減 肥藥物；L-羥脯氨酸具有多種生理功能與獨特的生物活性，既可作為各種軟組織疾病的藥 物，如結(jié)締組織受損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，又可加快傷口愈合，以及治療各種皮膚疾??；L-羥 脯氨酸作為氨基酸注射液的重要組分，對急慢性肝病所導(dǎo)致的低蛋白血癥有一定的療效； L-羥脯氨酸參與脂肪的乳化及紅細(xì)胞血紅素和球蛋白的形成，具有調(diào)節(jié)脂肪乳化等作用； L-羥脯氨酸是多種藥物，如第三代抗生素、抗腫瘤、抗高血壓及新型胃藥等的合成原料。目 前L-羥脯氨酸世界用量為500噸/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趨勢。
[0003]目前，合成L-羥脯氨酸的方法有化學(xué)合成法、生物提取法以及微生物酶法。我國 L-羥脯氨酸的生產(chǎn)主要采用化學(xué)水解提取工藝，以動物膠原蛋白為原料，通過強酸水解、亞 硝酸氧化和離子交換等過程制備，"三廢"排放量大、污染嚴(yán)重，能耗高、純度低及生產(chǎn)成本 高，很容易被市場淘汰。而且化學(xué)合成方法合成步驟較多，原料來源受限制、成本高、污染環(huán) 境，難以實現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)。2011年，德國科學(xué)家ChristianKlein對含有伴因子的大腸桿菌工 程菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-羥脯氨酸的條件進(jìn)行了優(yōu)化，測得脯氨酸轉(zhuǎn)化為L-羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化 率為61 %，其發(fā)酵周期長、底物投入量和轉(zhuǎn)化效率都較低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)L-羥脯氨酸， 而且對于大腸桿菌工程菌的酶表達(dá)，多采用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)做誘導(dǎo)劑，其誘導(dǎo) 效果雖好，但價格昂貴，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。同時，在以L-脯氨酸為底物直接發(fā)酵生產(chǎn)L-羥 脯氨酸過程中，由于宿主菌本身會消耗底物L(fēng)-脯氨酸，造成L-脯氨酸利用率變低?？梢?， 開發(fā)更為節(jié)能、污染少、轉(zhuǎn)化率高的發(fā)酵轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-羥脯氨酸勢在必行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何生產(chǎn)L-羥脯氨酸。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一株可以生產(chǎn)L-羥脯氨酸的細(xì)菌。
[0006]本發(fā)明所提供的細(xì)菌是大腸桿菌HYP035(Escherichiacoli.HYP035)CCTCCNO:M 2015401。該菌株已于2015年6月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC，地 址為：中國武漢武漢大學(xué)），保藏編號為CCTCCNO:M2015401。
[0007]所述大腸桿菌HYP035 (Escherichia coli.HYP035) CCTCC NO :M 2015401在生產(chǎn) L_羥脯氨酸中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0008]上述應(yīng)用中，用所述大腸桿菌HYP035 (Escherichia coli. HYP035) CCTCC N0 : Μ2015401生產(chǎn)L-羥脯氨酸的方法可包括發(fā)酵培養(yǎng)所述大腸桿菌HYP035 (Escherichia coli.HYP035)CCTCCNO:M2015401，得到L-羥脯氨酸的步驟。
[0009] 上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)使用的發(fā)酵培養(yǎng)基的溶質(zhì)及其濃度可為：葡萄 糖 3g/100mL、甘油 0. 5g/100mL、蛋白胨 0. 8g/100mL、硫酸銨 0. 5g/100mL、磷酸氫二鉀 0.lg/100mL、氯化鈉 0. 2g/100mL、硫酸鎂 0. 02g/100mL、硫酸亞鐵 0.lg/100mL、氯化鈣 0· 0015g/100mL、碳酸鈣 1. 5g/100mL、脯氨酸 4. 3g/100mL;溶質(zhì)可為水；ρΗ7· 0-7. 2。
[0010] 上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的接種量可為10% ±3% (體積百分比）。
[0011] 上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件可為36°C±2°C培養(yǎng)45±5h，溶氧濃度可 為 40% -50%。
[0012] 上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)還可包括制備一級種子液和/或二級種子液。
[0013] 所述制備一級種子液的步驟如下：（1)將大腸桿菌（Escherichiacoli. )HYP035 單克隆接種于LB斜面培養(yǎng)基，36. 5°C(實際應(yīng)用中36°C±2°C均可）培養(yǎng)12h(實際應(yīng)用中 12h±2h均可）；（2)將步驟⑴制備的大腸桿菌HYP035斜面，用5mL無菌水重懸，然后以 2% (體積百分比）（實際應(yīng)用中2% ±1%均可）的接種量接種到裝有一級種子搖瓶培養(yǎng) 基的種子搖瓶（150mL種子搖瓶裝液量為30mL)中，36.5°C(實際應(yīng)用中36°C±2°C均可） 培養(yǎng)12h(實際應(yīng)用中12h±2h均可），得到一級種子液。
[0014] 所述一級種子搖瓶培養(yǎng)基溶質(zhì)及其濃度可為：胰蛋白胨lg/100mL、酵母抽提 物0. 5g/100mL、氯化鈉lg/100mL;溶質(zhì)可為水；pH7. 0-7. 2,121°C高壓滅菌15min冷卻至 60°C，加入氨芐青霉素，使氨芐青霉素在體系中的濃度為100μg/mL。
[0015] 所述制備二級種子液的步驟如下：（1)將上述方法制備的一級種子液60mL以 〇. 5% (體積百分比）（實際應(yīng)用中0. 5% ±0. 2%均可）的移種量接入裝有二級種子培養(yǎng)基 的發(fā)酵罐（30L發(fā)酵罐裝液量為12L)中，36°C(實際應(yīng)用中36°C±2°C均可）培養(yǎng)8h(實 際應(yīng)用中811±211均可），溶氧濃度可為50%(實際應(yīng)用中50%-70%均可），得到00 61。約 為25 (實際應(yīng)用中25±2均可）的二級種子液。
[0016] 所述二級種子培養(yǎng)基溶質(zhì)及其濃度可為：蛋白胨1.5g/100mL、酵母抽提物 2. 5g/100mL、磷酸二氫鉀 0· 24g/100mL、磷酸氫二鉀 1. 6g/100mL、甘油 0· 5g/100mL;溶質(zhì)可 為水；ρΗ7· 0-7. 2,121°C高壓滅菌 15min。
[0017] 結(jié)果表明，利用本發(fā)明提供的大腸桿菌（Escherichiacoli. )HYP035可以生產(chǎn) L_羥脯氨酸，其發(fā)酵液中L-羥脯氨酸產(chǎn)量為45g/L，脯氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到85%，具有較高的 生產(chǎn)價值。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：以強啟動子tac為脯氨酸羥化酶基因的 啟動子，相比其他啟動子基因可明顯提高脯氨酸羥化酶基因的表達(dá)量，tac為組成型啟動 子，在發(fā)酵生產(chǎn)L-羥脯氨酸的過程中不需進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，降低誘導(dǎo)劑的使用，減少環(huán)境污 染；通過引入proC基因提尚宿主菌合成腫氣酸代謝途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量，提尚菌體在 代謝過程中合成脯氨酸的量，可減少底物脯氨酸的投放量；putA基因的敲除也能有效地降 低菌體本身代謝對L-脯氨酸的消耗，提高L-羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品 收率和質(zhì)量，并且降低成本，是適合工業(yè)化發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-羥脯氨酸的方法。
[0019] 保藏說明
[0020] 菌種名稱：大腸桿菌
[0021]拉丁名：（Escherichiacoli.)
[0022] 菌株編號：HYP035
[0023] 保藏機構(gòu)：中國典型培養(yǎng)物保藏中心
[0024] 保藏機構(gòu)簡稱：CCTCC
[0025] 地址：中國武漢武漢大學(xué)
[0026] 保藏日期：2015年6月25日
[0027] 保藏中心登記入冊編號：CCTCCNO:M2015401
【附圖說明】
[0028] 圖1為出發(fā)載體PBR322的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0029] 圖2為重組質(zhì)粒pBR322-tac-Hyp-proC的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0030] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但不限定本發(fā)明。下述實施例中的試驗方 法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為常規(guī) 生化試劑商店購買得到，大腸桿菌BL21 (DE3)plysS購自于NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0031] 下述實施例中的出發(fā)載體pBR322、限制性內(nèi)切酶AatII、限制性內(nèi)切酶HindIII、 ExTaqDNA酶、lOXExTaqBuffer和dNTP均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。
[0032] 下述實施例中的質(zhì)粒pKD13為上海權(quán)陽生物科技有限公司公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號 為TV00500 ;質(zhì)粒pKD46為上海權(quán)陽生物科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為TV00858 ;質(zhì)粒 PCP20為上海權(quán)陽生物科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為TV00859。
[0033] 氯胺T溶液的制備方法：1. 41g氯胺T(上海阿拉丁生化科技股份有限公司公司產(chǎn) 品，產(chǎn)品目錄號為104060)溶于10mL水中，然后依次加入10mL正丙醇和80mL緩沖液，混勻， 得到氯胺T溶液。緩沖液的制備方法：50g檸檬酸、26. 3gNaOH和146.lg結(jié)晶乙酸鈉溶于去 離子水，定容至1L，然后與200mL水和300mL正丙醇混合，得到緩沖液。
[0034] 顯色劑的制備方法：用35mL高氯酸充分溶解10g對二甲氨基苯甲醛，然后緩慢加 入65mL異丙醇，混合均勾。
[0035] 下述實施例中涉及的培養(yǎng)基如下：
[0036] LB斜面培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為：胰蛋白胨lg/100mL、酵母抽提物0. 5g/100mL、 氯化鈉lg/l〇〇mL，瓊脂粉2. 0g/100mL;溶質(zhì)為水；pH7. 0-7. 2,121°C高壓滅菌20min冷卻至 60°C，加入氨芐青霉素，使氨芐青霉素在體系中的濃度為100μg/mL。
[0037] -級種子搖瓶培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為：胰蛋白胨lg/100mL、酵母抽提物 0· 5g/100mL、氯化鈉lg/100mL;溶質(zhì)為水；ρΗ7· 0-7. 2,121°C高壓滅菌 20min冷卻至 60°C， 加入氨芐青霉素，使氨芐青霉素在體系中的濃度為100μg/mL。
[0038] 二級種子培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為：蛋白胨1. 5g/100mL、酵母抽提物2. 5g/100mL、 磷酸二氫鉀〇. 24g/100mL、磷酸氫二鉀1. 6g/100mL、甘油0. 5g/100mL;溶質(zhì)為水； ρΗ7· 0-7. 2,121°C高壓滅菌 20min。
[0039] 發(fā)酵培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為：葡萄糖3g/100mL、甘油0. 5g/100mL、蛋白胨 0. 8g/100mL、硫酸銨 0. 5g/100mL、磷酸氫二鉀 0.lg/100mL、氯化鈉 0. 2g/100mL、硫酸鎂 0· 02g/100mL、硫酸亞鐵(λlg/100mL、氯化鈣 0· 0015g/100mL、碳酸鈣L5g/100mL、脯氨酸 4. 3g/100mL;溶質(zhì)為水；ρΗ7· 0-7. 2,121°C高壓滅菌 15min。
[0040] 下述實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)試驗，結(jié)果取平均值。
[0041] 實施例1、重組質(zhì)粒pBR322-tac-Hyp-proC的構(gòu)建
[0042] 1、人工合成序列表序列1所示的雙鏈DNA分子。該雙鏈DNA分子中，序列表序列1 的自5'末端第1至8位為限制性內(nèi)切酶AatII的酶切識別位點，第9至62位核苷酸為tac 啟動子，第63至878位核苷酸為脯氨酸羥化酶的編碼基因，第895至1701位核苷酸為二氫 吡咯-5-羧酸還原酶的編碼基因，第1705至1723位核苷酸為T7終止子，第1724到1731 位為限制性內(nèi)切酶HindIII的酶切識別位點。
[0043] 2、將步驟1人工合成的雙鏈DNA分子用限制性內(nèi)切酶AatII和Hind III進(jìn)行雙酶 切，回收酶切產(chǎn)物，得到片段。
[0044] 3、用限制性內(nèi)切酶AatII和HindIII酶切出發(fā)載體PBR322,回收約4360bp的載體 骨架。
[0045] 4、將步驟2得到的片段和步驟3得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pBR322-tac-Hyp-proC〇
[0046] 重組質(zhì)粒pBR322-tac-Hyp_proC表達(dá)序列表的序列2所示的脯氨酸羥化酶和序列 表的序列3所示的二氫吡咯-5-