專利名稱：一種乳制品中l(wèi)-羥脯氨酸含量的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種乳制品中L-羥脯氨酸含量的檢測方法。
背景技術：
L-輕脯氨酸,英文名稱hydroxyproline,簡稱HYP,又名反式_4_輕基-L-脯氨酸， 分子式為C5H9NO3,分子量131. 13。L-羥脯氨酸是一種亞氨基酸，通常在脯氨酸的第4位上帶有羥基，但有時也在第3 位上。L-羥脯氨酸是膠原蛋白所特有的氨基酸，約占膠原蛋白中氨基酸總量的10%，而在其他蛋白質(zhì)中含量甚微，這使得它幾乎成為膠原蛋白所特有的成分，因而可通過測定L-羥脯氨酸含量來計算膠原蛋白的含量，從而確定膠原蛋白的總體水平。動物膠原水解蛋白是一種廉價蛋白原料，是將牛皮及其制品下腳料等成分粗加工后制成的水解蛋白質(zhì)，皮革水解蛋白粉就是利用皮革下腳料甚至動物毛發(fā)等物質(zhì)，經(jīng)水解而生成的一種粉狀物，因其氨基酸或者說蛋白含量較高，故人們稱之為皮革水解蛋白粉。某些非法廠家在乳粉中摻入廉價的水解動物蛋白來冒充或替代乳蛋白質(zhì)，提高乳中蛋白的質(zhì)量分數(shù)，降低成本。摻加動物膠原水解蛋白不但會影響乳的口感和風味，改變牛乳的溶解度，因其氨基酸的組成不合理，且不易消化，所以營養(yǎng)價值低下，導致人體吸收利用率降低， 會嚴重影響消費者的健康狀況。嚴格來講皮革水解蛋白粉對人體健康并無傷害，不過其前提條件是所用皮革必須是未經(jīng)糅制、染色等人工加工處理過的；然而這樣的皮革水解蛋白粉是不存在的，因為經(jīng)過糅制、染色等人工加工處理過的皮革比直接制作成蛋白粉利潤要高得多，因而皮革水解蛋白粉多用皮革廠制作服裝、皮鞋后的下腳料來生產(chǎn)，自然這種蛋白粉中混進了大量皮革糅制、染色過程中添加進來的重鉻酸鉀和重鉻酸鈉等有毒物質(zhì)，如果長期食用含有皮革水解蛋白粉的食物，鉻重金屬離子便會被人體吸收、積累、中毒，使人體關節(jié)疏松腫大，甚至造成兒童死亡。L-羥脯氨酸為人體非必需氨基酸，是機體膠原蛋白(動物水解蛋白)的主要成分之一，含量相對穩(wěn)定，為膠原蛋白中的特有組分，其含量占10%以上；而乳蛋白中不含有此成分，如若樣品中含有L (-)-羥脯氨酸，可判定添加了動物水解蛋白。目前國內(nèi)對L-羥脯氨酸的檢測方法主要有比色法、電泳法、氨基酸自動分析儀法、高效液相色譜法等。L-羥脯氨酸的傳統(tǒng)測定方法是氯胺T比色法，其基本原理是試樣經(jīng)酸水解，釋放出L-羥脯氨酸。經(jīng)氯胺T氧化，生成含有吡咯環(huán)的。先把含有HYP多肽的蛋白質(zhì)、組織、血清、腹水或尿液等水解成游離的HYP，游離的HYP被氧化后再與對二甲氨基苯甲醛(PDAB)在一定溫度下發(fā)生反應，生成紅色的吡咯氧化物，用高氯酸破壞過量的氯胺T。L-羥脯氨酸氧化物與對二甲氨基苯甲醛反應生成紅色化合物，在波長558nm處進行通過分光光度計比色測定。氯胺T法的特異性差，靈敏度低，影響因素較多，目前研究及應用的已不多。柱前衍生高效液相色譜法，主要是先將蛋白水解成L-羥脯氨酸，樣品處理最終要求將各肽鍵斷開，釋放出游離的L-羥脯氨酸。然后用氨基酸衍生試劑，進行柱前衍生，C18色譜柱分離，通過配紫外檢測器或熒光檢測器的高效液相色譜儀測定。常見的L-羥脯氨酸衍生劑有鄰苯二甲醒、I-氟-2，4-硝基苯、磺酰氯二甲胺偶氮苯、異硫氰酸苯酯等，這些衍生試劑有些還是劇毒的化合物。L-羥脯氨酸衍生步驟比較繁瑣，衍生條件限制較多，而且影響檢測的準確性，從而限制了其發(fā)展前景。另外，也有在200nm波長下直接檢測出氨基酸的報道，但檢測靈敏度較低，雜質(zhì)峰干擾較大。柱后衍生法氨基酸分析儀法，是傳統(tǒng)的氨基酸分析方法。前處理與液相法一樣，先將蛋白水解成L-羥脯氨酸，樣品處理最終要求將各肽鍵斷開，釋放出游離的L-羥脯氨酸。 然后，利用各種氨基酸的酸堿性、極性和分子量大小不同等性質(zhì)，使用陽離子交換樹脂在色譜柱上進行分離。當樣液加入色譜柱頂端后，采用不同的PH值和離子濃度的緩沖溶液即可將它們依次洗脫下來，將L-羥脯氨酸和其他氨基酸及雜質(zhì)分離開，洗脫下來的L-羥脯氨酸與茚三酮反應后生成黃色產(chǎn)物，在波長440nm有最大吸收，且保留時間不與其他氨基酸重迭。氨基酸自動分析儀法更加快速、準確、自動化程度和靈敏度高，但此法需專門儀器一氨基酸分析儀，該儀器只能用于分析氨基酸，限制了該儀器廣泛配置，從而限制了柱后衍生法氨基酸分析儀法在分析乳制品中L-羥脯氨酸中的廣泛應用。因而，探尋一種檢測快速、準確、適用于復雜體系乳制品中L-羥脯氨酸含量的檢測方法，對解決乳制品中非法添加皮革水解蛋白問題，規(guī)范乳制品科學規(guī)范生產(chǎn)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種乳制品中 L-羥脯氨酸含量的檢測方法，能夠顯著提高檢測的準確度、靈敏度，操作簡便快速地測定乳制品中L-羥脯氨酸含量。本發(fā)明的技術問題是通過如下技術方案實現(xiàn)的一種乳制品中L-羥脯氨酸含量的檢測方法，包括如下步驟(I)樣品預處理乳制品加酸水解，制得測試液；(2)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析L-羥脯氨酸含量液相條件采用親水作用色譜柱HILIC，柱溫30°C，流速0. 8mL/min，進樣量20yL，梯度洗脫流動相為流動相A與流動相B的混合溶液，所述流動相A為IOmM醋酸銨水溶液，PH = 5. 6 ;所述流動相B為乙腈，在O-IOmin內(nèi)，流動相A的比例為15%，流動相B的比例為85%;在10_12min內(nèi)， 流動相A的比例由15 %升至45 %，流動相B的比例由85 %降至55 %;在12_18min內(nèi)，流動相A的比例保持在45 %，流動相B的比例保持在55 % ;在18-20min內(nèi)，流動相A的比例由 45%降至15%，流動相B的比例由55%升至85% ;以上百分比均為體積百分比；質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源，掃描方式為正離子掃描，檢測方式為多反應檢測(MRM)，電噴霧電壓5500V，離子源溫度600°C，氣簾氣壓力20Psi，霧化氣壓力50Psi，輔助氣壓力30Psi。本發(fā)明中，所述的乳制品是指本領域常用的乳制品，具體可以分為三種(1)液態(tài)乳制品，如純牛奶和調(diào)制乳；(2)半固體狀乳制品，如酸奶和奶酪；(3)固體狀乳制品，如奶
本發(fā)明中，所述的通過親水色譜(HILIC)分析柱進行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定的基本原理是樣品被水解成多種氨基酸，通過采用親水色譜(HILIC)分析柱分離L-羥脯氨酸和相對分子量一樣的氨基酸，串聯(lián)質(zhì)譜儀分析，用定性離子對準確定性，定量離子對準確定量。本發(fā)明中，采用的色譜柱為親水色譜(HILIC)分析柱，是一種用來改善在反相色譜中保留較差的強極性物質(zhì)保留行為的色譜技術。它通過采用強極性固定性，并且結合高比例有機相/低比例水相組成的流動相來實現(xiàn)這一目的。而這樣的流動相組成尤其有利于提高電噴霧離子化質(zhì)譜的靈敏度。優(yōu)選的，步驟⑴中，當乳制品為液態(tài)乳制品時，其樣品預處理為稱取2. Og液態(tài)乳制品，加10. 6mol/L鹽酸溶液6_9mL，真空封管，于110°C下水解 12 16h，揮發(fā)干溶劑，加水溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，加水定容，轉入離心管，8000轉/ min離心5-10min,過O. 22 μ m微孔濾膜,制得測試液。步驟(I)中，當乳制品為半固體狀乳制品時，其樣品預處理為稱取I. 5g半固體狀乳制品，加入I. OmL蒸餾水混勻，加10. 6mol/L鹽酸溶液 6-9mL，真空封管，于110°C下水解12 16h，揮發(fā)干溶劑，加水溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，加水定容，轉入離心管中，8000轉/min離心5_10min,過O. 22 μ m微孔濾膜,制得測試液。步驟(I)中，當乳制品為固體狀乳制品時，其樣品預處理為稱取O. 5g固體狀乳制品，加入2. OmL蒸餾水復原，加10. 6mol/L鹽酸溶液6_9mL， 真空封管，于110°C下水解12 16h，揮發(fā)干溶劑，加水溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，加水定容，轉入離心管中，8000轉/min離心5_10min,過O. 22 μ m微孔濾膜,制得測試液。進一步優(yōu)選的，步驟⑴中，水解時間為12h。在檢測過程中，如果上機溶液中L-羥脯氨酸含量高于標準曲線最高濃度時，在前述離心5-10min后,可以進一步用體積百分比20%的10mmol/L乙酸銨水溶液與體積百分比80 %的乙腈混合溶液稀釋，使上機溶液中L-羥脯氨酸含量落于標準曲線范圍內(nèi)，再過 O. 22 μ m微孔濾膜，制得測試液。步驟(2)中，通過定性離子132. I > 86. O碰撞能量22V、定性離子132. I > 68. 2 碰撞能量18V進行定性分析，定量離子132. I > 86. O進行定量計算。相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的特點如下I、本發(fā)明將乳制品按照本領域常規(guī)方法進行水解來提取L-羥脯氨酸，再通過親水色譜(HILIC)分析柱進行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定含量。解決了現(xiàn)有測定乳制品中 L-羥脯氨酸含量方法的特異性差，受雜質(zhì)影響大，靈敏度低，定性不夠準確，分析時間長，衍生重復性差，定量不夠準確等缺陷，提供了一種可以提供豐富的結構信息，顯著提高檢測的準確度、靈敏度，操作簡便快速地測定乳制品中L-羥脯氨酸含量的方法。2、本發(fā)明只需要對樣品進行酸水解，調(diào)pH值，定容離心，即可測定。整個前處理過程操作簡單快速。不需要柱前或柱后衍生時間，解決了衍生受溫度、時間影響大，衍生效果不穩(wěn)定，重復性差的問題。本發(fā)明中，L-輕脯氨酸在50ng/mL 2000ng/mL之間,濃度與定量離子132. I > 86. O的峰面積成線性關系，相關系數(shù)r = I (如圖4所示)。在純牛奶中分別添加I. 5mg/kg 30mg/kg L-輕脯氨酸,用本發(fā)明的實驗方法進行測定，回收率為82. 5 96. 3%, RSD為I. 87 5. 84% ;在酸奶中分別添加I. 5mg/kg 30mg/kgL_輕脯氨酸，用本發(fā)明的實驗方法進行測定，回收率為85. 4 97. 9%，RSD為I. 05 6. 07% ;在奶粉中分別添加I. 5mg/kg 30mg/kgL-輕脯氨酸,用本發(fā)明的實驗方法進行測定，回收率為80. I 94. 0%, RSD為I. 78 7. 19% ;實驗結果表明本發(fā)明可以獲得精密度顯著優(yōu)于常規(guī)方法的檢測結果。3、本發(fā)明采用了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀進行分析測定。充分利用了液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的定性定量能力。如圖1、2、3所示，通過定性離子132. I > 86. O、 132. I > 68. 2進行定性分析，定量離子132. I > 86. O進行定量計算，提供豐富的結構信息， 解決了比色法特異性差，無法定性分析，高效液相色譜法和氨基酸分析儀法只能靠保留時間定性分析受雜質(zhì)影響大而導致定性不準的問題。為測定乳制品中L-羥脯氨酸含量提供了一個高準確度的保障。4、本發(fā)明采用了分辨率高的串聯(lián)質(zhì)譜檢測器進行分析測定。從圖5中得出，以信噪比為3 I時相應的濃度或注入儀器的量確定，檢出限為10ng/mL，定量限為33ng/mL。 在樣品中添加最低檢出限相當濃度的一系列濃度的標樣，來驗證方法的靈敏度，本發(fā)明方法的實際最低檢測限為O. 5mg/kg，定量限為I. 5mg/kg。本發(fā)明為乳制品中L-羥脯氨酸含量提供了一種高靈敏度的檢測手段。


圖I為L-羥脯氨酸標準溶液典型圖譜；圖2為不含L-羥脯氨酸的純牛奶樣品的典型圖譜；圖3為純牛奶中加入L-羥脯氨酸標樣的典型圖譜；圖4為L-羥脯氨酸氨基酸在20 μ g/L 2000 μ g/L范圍內(nèi)標樣濃度與峰面積成線性關系圖；圖5為濃度為10ng/mL的L-羥脯氨酸標準溶液(定量離子132. I > 86. O)的圖
-i'Tfe P曰。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述。實施例I在純牛奶樣品(L-羥脯氨酸未檢出)中加入膠原蛋白粉，制得本實施例的液態(tài)乳制品模擬陽性樣品。I、樣品前處理。稱取2. Og樣品，加10. 6mol/L鹽酸溶液6mL，真空封管，于110°C下水解12h。揮干溶劑，加水溶解，NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，加水定容至25mL。轉入50mL離心管中，8000轉/ min離心5min,過O. 22 μ m微孔濾膜,待檢測。2、親水色譜(HILIC)分析柱進行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定本發(fā)明中，所述的通過親水色譜(HILIC)分析柱進行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定的基本原理是樣品被水解成多種氨基酸，通過采用親水色譜(HILIC)分析柱分離L-羥脯氨酸和相對分子量一樣的氨基酸，串聯(lián)質(zhì)譜儀分析，用定性離子對準確定性，定量離子對
準確定量。
I)色譜條件
色譜柱HILIC, 150x2. 1mm, 5 μ m或相當柱；
流動相(v/v) A醋酸銨(IOmM, pH 5. 6) ；B乙腈；
梯度洗脫0-10min 85-85 % B, 10_12min 85-55 % B, 12_18min 55-55 % B,18-20min 85-85% B ；
柱溫30°C ;
流速0. 8mL/min ；
進樣量20 μ L。
2)質(zhì)譜條件
離子源電噴霧離子源；
掃描方式正離子掃描；
檢測方式多反應檢測(MRM)；
電噴霧電壓(V) 5500 ；
尚子源溫度(C) 600 ；
氣簾氣壓力(Psi) 20 ；
霧化氣壓力(Psi) 50 ；
輔助氣壓力(Psi) 30 ；
定性離子對、定量離子對、碰撞氣能力見表I :
表I :定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量表
中文名稱英文名稱定量離子定性離子碰撞能量/V132.1>86.022L-羥脯氨酸L-Hydroxyproline132.1>86.0132.1>68.218通過上述分析方法對同一種陽性樣品進行5次分析，每次分析都能夠獲得準確的圖譜和定量信息，對照標準曲線，結果如下表2 :表2 :同一種液態(tài)乳(純牛奶)中L-輕脯氨酸含量的測定表
權利要求
1.一種乳制品中L-羥脯氨酸含量的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟(1)樣品預處理乳制品加酸水解，制得測試液；(2)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析L-羥脯氨酸含量液相條件采用親水作用色譜柱HILIC，柱溫30°C，流速0. 8mL/min，進樣量20yL，梯度洗脫流動相為流動相A與流動相B的混合溶液，所述流動相A為IOmM醋酸銨水溶液，pH = 5. 6 ;所述流動相B為乙腈，在O-IOmin內(nèi)，流動相A的比例為15%，流動相B的比例為85%;在10_12min內(nèi)，流動相A的比例由15 %升至45 %，流動相B的比例由85 %降至55 % ;在12_18min內(nèi)，流動相A 的比例保持在45%，流動相B的比例保持在55%; 18-20min內(nèi)，流動相A的比例 45% 降至15%，流動相B的比例由55%升至85% ;以上百分比均為體積百分比；質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源，掃描方式為正離子掃描，檢測方式為多反應檢測，電噴霧電壓 5500V，離子源溫度600°C，氣簾氣壓力20Psi，霧化氣壓力50Psi，輔助氣壓力30Psi。
2.如權利要求I所述的一種乳制品中L-羥脯氨酸含量的檢測方法，其特征在于步驟(I)中，當乳制品為液態(tài)乳制品時，其樣品預處理為稱取2. Og液態(tài)乳制品,加10. 6mol/L鹽酸溶液6_9mL,真空封管,于110°C下水解12 16h，揮發(fā)干溶劑，加水溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，加水定容，轉入離心管，8000轉/min 離心5-10min，過O. 22 μ m微孔濾膜，制得測試液。
3.如權利要求I所述的一種乳制品中L-羥脯氨酸含量的檢測方法，其特征在于步驟(I)中，當乳制品為半固體狀乳制品時，其樣品預處理為稱取I. 5g半固體狀乳制品,加入I. OmL蒸懼水混勻,加10. 6mol/L鹽酸溶液6_9mL,真空封管，于110°C下水解12 16h，揮發(fā)干溶劑，加水溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，加水定容，轉入離心管中，8000轉/min離心5_10min,過O. 22 μ m微孔濾膜,制得測試液。
4.如權利要求I所述的一種乳制品中L-羥脯氨酸含量的檢測方法，其特征在于步驟(I)中，當乳制品為固體狀乳制品時，其樣品預處理為稱取O. 5g固體狀乳制品，加入2. OmL蒸餾水復原，加10. 6mol/L鹽酸溶液6_9mL，真空封管，于110°C下水解12 16h，揮發(fā)干溶劑，加水溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，加水定容，轉入離心管中，8000轉/min離心5_10min,過O. 22 μ m微孔濾膜,制得測試液。
5.如權利要求1-4中任一項所述的一種乳制品中L-羥脯氨酸含量的檢測方法，其特征在于步驟(2)中，通過定性離子132. I > 86. O碰撞能量22V、定性離子132. I > 68. 2碰撞能量18V進行定性分析，定量離子132. I > 86. O進行定量計算。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳制品中L-羥脯氨酸含量的檢測方法，包括如下步驟(1)樣品預處理乳制品加酸水解，制得測試液；(2)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析L-羥脯氨酸含量，采用親水作用色譜柱HILIC，流動相為流動相A與流動相B的混合溶液，流動相A為10mM醋酸銨水溶液，pH＝5.6；流動相B為乙腈，質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源，掃描方式為正離子掃描，檢測方式為多反應檢測，電噴霧電壓5500V，離子源溫度600℃，氣簾氣壓力20Psi，霧化氣壓力50Psi，輔助氣壓力30Psi。本發(fā)明能夠顯著提高檢測的準確度、靈敏度，操作簡便快速地測定乳制品中L-羥脯氨酸含量。
文檔編號G01N30/88GK102590420SQ20121003355
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月15日 優(yōu)先權日2012年2月15日
發(fā)明者何亞斌, 孟瑾, 章寅, 鄭小平, 韓奕奕, 韓慧雯 申請人:上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司