生產(chǎn)反式?4?羥脯氨酸的工程菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)反式?4?羥脯氨酸的工程菌及其應(yīng)用，所述工程菌通過(guò)將優(yōu)化的脯氨酸4?羥化酶基因與色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子經(jīng)全基因合成后連接到插入有透明顫菌血紅蛋白基因的表達(dá)載體，再將所述表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌后獲得；所述優(yōu)化的脯氨酸4?羥化酶基因包括：將脯氨酸4?羥化酶基因中低使用率密碼子替換為大腸桿菌中高使用率密碼子，并調(diào)整脯氨酸4?羥化酶基因的CG％使其接近宿主菌的CG％；消除了脯氨酸4?羥化酶基因的酶切位點(diǎn)；調(diào)整脯氨酸4?羥化酶基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)以避免脯氨酸4?羥化酶基因的mRNA的5’端形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的工程菌可大量、高效地生產(chǎn)反式?4?羥脯氨酸。
【專利說(shuō)明】
生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的工程菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及生產(chǎn)反式-4-輕脯氨酸的工程菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 反式-4-輕脯氨酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、動(dòng)物飼料、營(yíng)養(yǎng)和美容業(yè)等方面。
[0003] 反式-4-羥脯氨酸的生產(chǎn)方法主要有生物提取法和微生物合成法。目前國(guó)內(nèi)廠家 多采用生物提取法制備反式-4-羥脯氨酸。目前，常用的生物提取法需經(jīng)過(guò)強(qiáng)酸強(qiáng)堿處理， 純化步驟長(zhǎng)，而且羥脯氨酸提取率在4%-7 %，提取和原料成本高，不僅浪費(fèi)大量原料，而且 廢棄物污染嚴(yán)重，隨著目前環(huán)境壓力的增加和資源原料價(jià)格的上升，傳統(tǒng)的生物提取法容 易被市場(chǎng)淘汰。微生物酶法即利用酶的立體專一性反應(yīng)，以發(fā)酵法生產(chǎn)的底物或者化學(xué)合 成的底物生產(chǎn)具有活性的產(chǎn)物。反應(yīng)多在常溫常壓的細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞外下進(jìn)行，可高選擇 性地制備所需的光學(xué)活性物質(zhì)。微生物轉(zhuǎn)化法與生物提取法或者合成法相比具有諸多優(yōu) 點(diǎn)：（1)反應(yīng)條件溫和、能耗低，而且毒副產(chǎn)物少，環(huán)境污染少。（2)微生物轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是利用 細(xì)胞內(nèi)酶的催化反應(yīng)，因此具有高度的立體選擇性，適合對(duì)立體結(jié)構(gòu)要求高的藥物以及藥 物前體。（3)與單純的酶催化反應(yīng)相比，微生物轉(zhuǎn)化由于是在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的酶催化 反應(yīng)，酶所處的生態(tài)系統(tǒng)可保證酶催化所需要的環(huán)境，重組酶在細(xì)胞內(nèi)能保持較高的酶活。
[4] 微生物轉(zhuǎn)化由于不需對(duì)重組酶進(jìn)行分離純化，直接回收細(xì)胞或者利用活性細(xì)胞做生物 催化，只需要在培養(yǎng)時(shí)加入一部分前體物，甚至直接以培養(yǎng)基的碳源氮源為前體物，就可獲 得高純度的產(chǎn)品。（5)微生物轉(zhuǎn)化可實(shí)現(xiàn)多步催化反應(yīng)。
[0004] 但目前的微生物酶法生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率仍然較低，例如： 1999年，Shibasaki等人將指孢囊菌RH 1脯氨酸4-羥化酶基因置于一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)控下， 導(dǎo)入到大腸桿菌中構(gòu)建重組菌，反式-4-羥脯氨酸在大腸桿菌中代謝圖如圖1所示，在以脯 氨酸為底物的發(fā)酵液中，脯氨酸4-羥化酶將大腸桿菌胞內(nèi)的2-酮戊二酸和脯氨酸分別轉(zhuǎn)化 為反式-4-羥脯氨酸和琥珀酸，在發(fā)酵罐中發(fā)酵100h后，反式-4-羥脯氨酸的積累量可達(dá)到 41g/L。Shibasaki等人為了進(jìn)一步降低反式-4-輕脯氨酸的生產(chǎn)成本，將脯氨酸代謝中的關(guān) 鍵酶基因?qū)氲椒词?4-羥脯氨酸生產(chǎn)菌重組質(zhì)粒中，在以葡萄糖為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中 培養(yǎng)96h后反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到25g/L。
[0005] 因此，研究高產(chǎn)量及高轉(zhuǎn)化率的工程菌對(duì)反式-4-羥脯氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用 具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的工程菌及其應(yīng)用，該工程菌可大量、高效地 生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸。
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的工程菌，所述工程菌通過(guò)將 優(yōu)化的脯氨酸4-羥化酶基因與色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子經(jīng)全基因合成后連接到插入有透明顫菌 血紅蛋白基因的表達(dá)載體，再將所述表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌后獲得；
[0008] 所述優(yōu)化的脯氨酸4-羥化酶基因包括:將脯氨酸4-羥化酶基因中低使用率密碼子 替換為大腸桿菌中高使用率密碼子，并調(diào)整脯氨酸4-羥化酶基因的CG%使其接近宿主菌的 CG%;消除了脯氨酸4-羥化酶基因的酶切位點(diǎn)；調(diào)整脯氨酸4-羥化酶基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)以避 免脯氨酸4-羥化酶基因的mRNA的5 '端形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0009] 以上所述的工程菌，其中，所述表達(dá)載體為pUC19質(zhì)粒。
[0010] 以上所述的工程菌，其中，所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
[0011] 以上所述的工程菌，其中，所述優(yōu)化的脯氨酸4-輕化酶基因的CG%為59.27%。
[0012] 以上所述的工程菌，其中，所述優(yōu)化的脯氨酸4-羥化酶基因消除了EcoR I酶切位 點(diǎn)。
[0013] 以上所述的工程菌，其中，所述透明顫菌血紅蛋白基因插入于所述表達(dá)載體的 EcoRI和Nde頂每切位點(diǎn)之間。
[0014] 以上所述的工程菌，其中，所述優(yōu)化的脯氨酸4-羥化酶基因與色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子 經(jīng)全基因合成后連接到所述表達(dá)載體的BamH I和EcoR頂每切位點(diǎn)之間。
[0015]以上所述的工程菌，其中，所述優(yōu)化的脯氨酸4-羥化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，所述色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述透明顫菌血 紅蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0016] 本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種利用以上任一所述的工程菌生產(chǎn)反式-4-羥脯氨 酸的方法。
[0017] 本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)包括以下方面：
[0018] (1)為了使脯氨酸4-羥化酶在大腸桿菌中得到高表達(dá)，首先通過(guò)同義轉(zhuǎn)換調(diào)整密 碼子偏好性，將脯氨酸4-羥化酶基因的低使用率密碼子替換為在大腸桿菌中使用頻率高的 密碼子，并消除脯氨酸4-羥化酶基因的酶切位點(diǎn)。然后再利用軟件預(yù)測(cè)并調(diào)整脯氨酸4-羥 化酶基因二級(jí)結(jié)構(gòu)，使得脯氨酸4-羥化酶基因的mRNA的5'端避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，可促進(jìn) mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯。最終使脯氨酸4-羥化酶基因序列得到優(yōu)化。
[0019] (2)選擇色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子控制脯氨酸4-羥化酶的表達(dá)，經(jīng)優(yōu)化后的脯氨酸4-羥 化酶基因序列和色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子經(jīng)全基因合成后，連接到PAMP質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pAMP-ptrp2-Hyp，為了提高脯氨酸4-羥化酶的表達(dá)量和反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)率，對(duì)宿主菌和 質(zhì)粒進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇脯氨酸4-羥化酶表達(dá)量最高的重組大腸桿菌作為反式-4-羥脯 氨酸生產(chǎn)菌。
[0020] (3)為了改善重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的溶氧條件，在分子水平上引入透明顫菌 血紅蛋白VHb，構(gòu)建可表達(dá)VHb的重組大腸桿菌。當(dāng)發(fā)酵液溶氧較低時(shí)，VHb基因自身的啟動(dòng) 子控制VHb的表達(dá)，提高大腸桿菌的氧氣利用率，促進(jìn)脯氨酸4-羥化酶的表達(dá)，最終強(qiáng)化反 式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量。
【附圖說(shuō)明】
[0021 ]圖1為大腸桿菌中反式-4-輕脯氨酸代謝過(guò)程圖；
[0022]圖2為本發(fā)明的脯氨酸4-羥化酶mRNA機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，A為密碼子調(diào)整前的序列，B為 進(jìn)行了同義密碼子調(diào)整后的序列；
[0023]圖3為本發(fā)明pAMP-prtp2-Hyp重組質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程圖；
[0024]圖4為本發(fā)明pUC19-ptrp2-Hyp重組質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程圖；
[0025]圖5為本發(fā)明的重組質(zhì)粒pAMP-ptrp2-Hyp經(jīng)雙酶切后的電泳圖；
[0026] 圖6為本發(fā)明pUC19-ptrp2-Hyp-VHb重組質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程圖；
[0027]圖7為本發(fā)明重組質(zhì)粒pAMP-ptrp2-Hyp分別轉(zhuǎn)化不同大腸桿菌后的全細(xì)胞酶活對(duì) 比圖；
[0028] 圖8為本發(fā)明優(yōu)化后的脯氨酸4-羥化酶基因和色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子序列經(jīng)雙酶切后 連接到不同質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化大腸桿菌后再提取重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證電泳圖；泳道1為：lkb DNA Ladder Maker，泳道2、3、4、5分別為：pAMP_ptrp2_Hyp、pK19mobsacB-ptrp2_Hyp、pET28a_ ptrp2-Hyp、pUC19-ptrp2_Hyp 雙酶切電泳圖；
[0029] 圖 9 為本發(fā)明的重組菌 BI^UDESVpUCig-ptrpS-HypJI^UDESVpAMP-ptrpS-Hyp'BI^UDESVpKigmobsacB-ptrpS-Hyp 和 BL21(DE3)/pET2 8a-ptrp 2-Hyp 的全細(xì)胞酶活 對(duì)比圖；
[0030] 圖10為本發(fā)明的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb菌落PCR電泳圖；
[0031] 圖11為本發(fā)明重組質(zhì)粒pUC19-ptrp2-Hyp-VHb經(jīng)EcoRI單酶切后的電泳圖（泳道 2)，pUC19-VHb經(jīng)EcoRI單酶切后的電泳圖（泳道3);
[0032] 圖12為本發(fā)明重組大腸桿菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb細(xì)胞破碎上清液C0 差異光譜分析圖；
[0033]圖13為本發(fā)明重組大腸桿菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb搖瓶發(fā)酵發(fā)酵液 OD600隨時(shí)間的變化情況圖；
[0034] 圖14為本發(fā)明重組大腸桿菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb搖瓶發(fā)酵反式-4- 羥脯氨酸濃度隨時(shí)間的變化情況圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行更加詳細(xì)的說(shuō)明，以便能 夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)。然而，以下描述的【具體實(shí)施方式】和實(shí) 施例僅是說(shuō)明的目的，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0036] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0037] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038]本發(fā)明所有的DNA序列由上海旭冠公司合成（中國(guó)，上海KT4DNA連接酶和限制性 內(nèi)切酶均購(gòu)自Takara公司（中國(guó)，大連）。質(zhì)粒pAMP由pUC19質(zhì)粒構(gòu)建而成。E.coliBL21 (DE3)、E.coli JM1 09、E.coli DH5a和E.coli SCS110購(gòu)自Novagen公司。pK19mobs acB由 Sch&fer 提供（在 Schafer A，Tauch A,Jager ff,et al. Small mobi 1 izable multipurpose cloning vectors derived from the Escherichi a coli plasmids pK18 and pK19：selection of defined deletion s in the chromosome of Corynebacterium glutamicum[J] ·Gene，1994，145( 1):69-73 ·中公開)pET28a、pUC19和pAMP來(lái)自商業(yè)購(gòu)買。
[0039]本發(fā)明的葡萄糖、氯化鈉、硫酸鎂、玉米漿、磷酸氫二鉀、硫酸銨、L-脯氨酸、反式-4_羥脯氨酸、瓊脂粉、氯化鈣、硫酸亞鐵、甘油、糊精、可溶性淀粉、檸檬酸、氫氧化鈉、結(jié)晶乙 酸鈉、正丙醇、氯胺T、高氯酸、對(duì)二甲氨基苯甲酸、異丙醇、氯化銨購(gòu)自上海國(guó)藥。胰蛋白胨、 酵母抽提物、EB、瓊脂糖M、dNTP、小量質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試 劑盒、氨芐青霉素、卡那霉素購(gòu)自BBI公司（上海生工代理）；限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI、 HindIII、NdeI、lkb DNA Ladder Marker均購(gòu)自大連寶生物公司（TaKa Ra);T4 DNA ligase 購(gòu)自Fermentas公司；Taq DNA聚合酶購(gòu)自上海生工。
[0040]本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基配方如下：
[0041 ] (1)LB培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母膏，l%NaCl，pH 7.0,固體培養(yǎng)基補(bǔ)充2% 的瓊脂粉。
[0042] (2)氨芐抗性平板：1%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，l%NaCl，2%瓊脂，pH 7.0， 滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻到60°C左右，加入氨芐青霉素母液(過(guò)濾除菌，50mg/mL)，至培養(yǎng)基氨 芐青霉素終濃度為50yg/mL(稀釋1000倍），混勻后，倒平板。
[0043] (3)卡那霉素抗性平板：1 %胰蛋白胨，0.5 %酵母抽提物，1 %NaCl，2 %瓊脂，pH 7.0，滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻到60°C左右，加入卡那霉素母液(過(guò)濾除菌，50mg/mL)，至培養(yǎng)基 卡那霉素終濃度為50yg/mL(稀釋1000倍），混勻后倒平板。
[0044] (4) TSB培養(yǎng)基：1 % 胰蛋白胨，0 · 5 % 酵母抽提物，1 % NaCl，10 % PEG3350，5 % DMS0， 10mM MgCl2，10mM MgS〇4，10%甘油，pH 6.1。
[0045] (5)初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2 %，硫酸銨1 %，磷酸氫二鉀0.1 %，氯化鈉0.2 %，蛋 白胨0.8 %，硫酸鎂0.05 %，硫酸亞鐵ImM，氯化鈣0.0015 %，L-脯氨酸200mM，pH8.0。
[0046] 本發(fā)明主要試劑的配制：
[0047] (1) 50 X TAE DNA電泳緩沖液
[0048] 稱取242g Tris，冰乙酸57.1mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)100mL后，用去離子水補(bǔ) 充至1L，電泳前用去尚子水稀釋50倍。
[0049] (2) 1 Omg/mL溴化乙錠(EB)溶液
[0050]將EB粉末溶于水配成10mg/mL，用錫箱紙或者黑紙包裹，暗處室溫儲(chǔ)存。
[0051] (3)5XKCM
[0052] 0.15M CaCl2,0.5M KC1，0.25M MgCh，高溫滅菌后分裝保存。
[0053] (4)反式-4-輕脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液
[0054]用分析天平稱取一定量的反式-4-羥脯氨酸，用去離子水溶解后得到1(^凡反式_ 4_羥脯氨酸母液。將其稀釋100倍，得到100mg/L反式-4-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，于4°C冷藏備用。 [0055] (5)緩沖溶液
[0056]準(zhǔn)確稱取50g梓檬酸，26.3g氫氧化鈉，146. lg結(jié)晶乙酸鈉，溶于1L水中。將此溶液 與200mL水和300mL正丙醇混合。
[0057] (6)氯胺T試劑
[0058] 準(zhǔn)確稱取1.41g氯胺T，溶于10mL水中，依次加入10mL正丙醇和80mL緩沖溶液。
[0059] (7)顯色劑
[0060] 準(zhǔn)確稱取5g對(duì)二甲氨基苯甲醛，溶于17.5mL高氯酸中，溶解后緩慢加入32.5mL異 丙醇。
[0061 ] (8)MES嗎啉乙磺酸緩沖液
[0062] 用分析天平準(zhǔn)確稱取4.6855g MES，定容至100mL，嗎啉乙磺酸濃度為240mM，然后 用2M NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5，MES緩沖液在2-8°C可保存數(shù)月。
[0063] (9)500mM 2-酮戊二酸母液
[0064]用分析天平準(zhǔn)確稱取7.305g酮戊二酸，定容至lOOmL，然后分裝保存。
[0065] (10)500mM L-脯氨酸母液
[0066]用分析天平準(zhǔn)確稱取5.75g L-脯氨酸，用水溶解后，定容至100mL，然后分裝保存。
[0067] (ll)lOOmM硫酸亞鐵母液
[0068]用分析天平準(zhǔn)確稱取2.78g七水合硫酸亞鐵，用水溶解后，定容至100mL，分裝保 存。
[0069] (12)200mM 維生素 C 母液
[0070]用分析天平準(zhǔn)確稱取3.522g維生素 C，用水溶解后定容至100mL，分裝保存。
[0071 ]實(shí)施例1脯氨酸4-輕化酶基因初步密碼子優(yōu)化
[0072] 脯氨酸4-羥化酶來(lái)源于指孢囊菌，脯氨酸4-羥化酶基因密碼子使用頻率分析由數(shù) 據(jù)庫(kù)(111^?://\￥?^.1?^1183.01'.」?/(30(1〇11)完成，分析結(jié)果如表1所示，來(lái)源于指孢囊菌的初 始脯氨酸4-羥化酶基因部分密碼子在大腸桿菌中的使用頻率很低，如CAC(His)、CUC(L eU)、 CGG(Arg)、UCG(Ser)、⑶C(Val)，這些密碼子的使用頻率均低于15%，具體分析結(jié)果如表1所 示，雖然單個(gè)低頻密碼子并不會(huì)對(duì)蛋白表達(dá)有明顯影響，但是如果這些低頻密碼子以集群 形式分布在基因上，會(huì)降低蛋白的表達(dá)量，通過(guò)分析脯氨酸4-羥化酶基因，發(fā)現(xiàn)其基因上 低頻密碼子以集群形式成串地分布在脯氨酸4-羥化酶基因上，因此，有必要通過(guò)對(duì)脯氨酸 4-羥化酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。
[0073] 表 1
[0074]
[0075] 利用密碼子優(yōu)化軟件JCAT(Java Codon Adaptation Tool)對(duì)脯氨酸4_輕化酶基 因進(jìn)行優(yōu)化，該軟件根據(jù)Carbone等人提出的密碼子適用指數(shù)(CAI)來(lái)對(duì)基因進(jìn)行評(píng)估，密 碼子適用指數(shù)CAI根據(jù)宿主菌高表達(dá)基因密碼子作為參考進(jìn)行運(yùn)算，CAI越接近1，表明該基 因高頻密碼子越多，其高表達(dá)可能性越高。單個(gè)密碼子相對(duì)適用性用Wi的運(yùn)算方法如公式 (1)所示：
[0076] ffi = fi/f (max)i (1)
[0077] 其中，fi表示基因序列中某一密碼子在宿主菌的使用頻率，f(max)i表示宿主菌翻 譯同一氨基酸的密碼子的最高使用頻率?；蛎艽a子適用指數(shù)CAI的運(yùn)算如公式(2)所示：
[0078]
⑵
[0079] 其中，N為基因'g'的密碼子數(shù)，密碼子數(shù)不包括終止密碼子和起始密碼子。根據(jù)運(yùn) 算結(jié)果，來(lái)源于指孢囊菌的脯氨酸4-羥化酶基因的密碼子的相對(duì)適用性I大多數(shù)小于 0.25，其CAI值經(jīng)計(jì)算只有0.3992，遠(yuǎn)小于最優(yōu)值1，且GC百分比含量為73.626%，遠(yuǎn)高于大 腸桿菌高表達(dá)基因的GC百分比含量50.7995%。
[0080] 利用軟件JCAT進(jìn)行優(yōu)化，消除脯氨酸4-羥化酶基因上的低頻密碼子，并通過(guò)同義 轉(zhuǎn)化，替換掉脯氨酸4-羥化酶基因上的常用限制性酶切位點(diǎn)。脯氨酸4-羥化酶基因經(jīng)優(yōu)化 后，其密碼子相對(duì)適用性1大多數(shù)為1，CAI值高達(dá)0.9941，接近于1，6(：百分比含量降至 59.340%，與大腸桿菌高表達(dá)基因的GC百分比接近。
[0081] 通過(guò)對(duì)脯氨酸4-羥化酶基因進(jìn)行初步的密碼子優(yōu)化，改變了 138個(gè)密碼子，同時(shí)脯 氨酸4-羥化酶基因的GC含量從73.62%降低到59.34%，更接近大腸桿菌基因 GC百分比。同 時(shí)，通過(guò)同義轉(zhuǎn)化消除脯氨酸4-羥化酶基因的EcoR頂每切位點(diǎn)。
[0082 ]實(shí)施例2脯氨酸4-輕化酶基因 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化
[0083]除了優(yōu)化脯氨酸4-羥化酶基因密碼子外，還要考慮到mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用RNA折 疊分析軟件5.3預(yù)測(cè)脯氨酸4-輕化酶基因的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，mRNA折疊自由能，通過(guò)改變同義 密碼子調(diào)整脯氨酸4-羥化酶基因的mRNA的5 '端結(jié)構(gòu)，使得脯氨酸4-羥化酶基因的mRNA的5 ' 端避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖2所示，起始密碼子用箭頭標(biāo)出，優(yōu)化之前的mRNA折疊能AGS-306 . lkcal/mol，且mRNA5 '端形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，不利于核糖體的延伸。與優(yōu)化前的相比，雖然 折疊能Δ G為-287.2kcal/mol，與優(yōu)化之前的mRNA折疊能接近。但是經(jīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化后的脯 氨酸4-羥化酶基因 mRNA保證AUG起始密碼子后及其后的幾個(gè)堿基組成的密碼子翻譯口袋呈 打開狀態(tài)，降低了核糖體結(jié)合到mRNA上的能勢(shì)，使得核糖體能夠順利地沿著起始密碼子向 后翻譯，經(jīng)優(yōu)化后的脯氨酸4-羥化酶基因可促進(jìn)mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
[0084] 來(lái)源于指孢囊菌的脯氨酸4-羥化酶基因，經(jīng)密碼子優(yōu)化、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)整后，優(yōu) 化后的脯氨酸4-羥化酶基因共改變了 137個(gè)密碼子和139個(gè)核苷酸，同時(shí)，GC百分比從 73.62%降低到59.27 %，更接近大腸桿菌高表達(dá)基因的GC百分比含量，優(yōu)化后的脯氨酸4-羥化酶基因如SEQ ID NO: 1所示。
[0085] 實(shí)施例3脯氨酸4-輕化酶基因和色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子的全基因合成
[0086]為了高效表達(dá)脯氨酸4-羥化酶基因并利用脯氨酸4-羥化酶高效轉(zhuǎn)化L-脯氨酸生 產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸，引入組成型啟動(dòng)子-色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子，色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子(序列如 SEQ ID N0:2所示）由色氨酸和色氨酸結(jié)構(gòu)類似物調(diào)控，當(dāng)發(fā)酵液中缺少色氨酸時(shí)，色氨酸 串聯(lián)啟動(dòng)子控制脯氨酸4-羥化酶基因的表達(dá)，同時(shí)，細(xì)胞代謝生成的2-酮戊二酸和發(fā)酵液 中的L-脯氨酸在脯氨酸4-羥化酶的催化下，分別生產(chǎn)琥珀酸和反式-4-羥脯氨酸。
[0087] 優(yōu)化后的脯氨酸4-羥化酶基因和色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子序列由上海旭冠公司合成，為 了便于基因操作，在優(yōu)化后的脯氨酸4-羥化酶基因5'和3'端分別加入Hindlll和BamHI酶切 位點(diǎn)，在色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子基因5 '和3 '端分別加入EcoRI和HindiΠ 酶切位點(diǎn)。
[0088] 實(shí)施例4大腸桿菌高效感受態(tài)的制備
[0089] (1)接種大腸桿菌JM 109、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌SCS 110、大腸桿菌BL21(DE3) 于50mL新鮮LB培養(yǎng)液中34°C，220rpm過(guò)夜培養(yǎng)。
[0090] (2)取過(guò)夜種子液按1 %接種量接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中，34°C，220rpm振蕩培養(yǎng)。
[0091] (3)培養(yǎng)約2小時(shí)直至0D6(x)值達(dá)到0 · 5-0 · 6。
[0092] (4)將培養(yǎng)液分裝于50mL離心管中，置于冰上預(yù)冷lOmin。
[0093] (5)4°C，1000Xg離心5分鐘，棄去上清，回收細(xì)胞。
[0094] (6)重懸于原培養(yǎng)體積的5%的TSB培養(yǎng)基中，緩慢吹打均勻。
[0095] (7)冰上放置lOmin后分裝至1.5mL的離心管中，每管分裝60yL。
[0096] (8)將分裝好的感受態(tài)細(xì)胞放置于_80°C冰箱，感受態(tài)效率可達(dá)到1 X108以上，可 保存一年不影響效率。
[0097]實(shí)施例5宿主菌的優(yōu)化
[0098]將合成好的脯氨酸4-羥化酶基因連接到pAMP質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAMP-Hyp，然 后將合成后的色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子基因 Ptrp2經(jīng)EcoRI和Hindlll雙酶切后，連接到經(jīng)同樣酶 雙酶切后的pAMP-Hyp質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAMP_ptrp2_Hyp，重組質(zhì)粒pAMP_ptrp2_Hyp的 構(gòu)建過(guò)程如圖3,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中，挑取單菌落。將重組大腸桿菌單菌落 擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒pAMP-ptrp2-Hyp經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后，形成1850bp 和1063bp兩條條帶，如圖5所示。重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序，序列完全正確。
[0099]將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒pAMP-ptrp2-Hyp，分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，SCSI 10，JM109，DH5a中，構(gòu)建重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pAMP-ptrp2-Hyp，大腸桿菌 SCSI 10/pAMP-ptrp2_Hyp，大腸桿菌 JM 109/pAMP-ptrp2_Hyp，大腸桿菌 DH5a/pAMP-ptrp2_ Hyp。然后將四株不同的重組大腸桿菌涂布至氨芐抗性平板，挑取單菌落，分別接種至LB培 養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后，測(cè)定四株重組大腸桿菌的全細(xì)胞酶活。結(jié)果如圖7所示，BL21(DE3)/ pAMP-ptrp2-Hyp的全細(xì)胞酶活最高，全細(xì)胞活性高達(dá)0.0525 ± 0.0023U/g，比全細(xì)胞酶活最 低的SCS110/pAMP-ptrp2_Hyp高60%，在四株大腸桿菌中，大腸桿菌BL21(DE3)最適合用于 表達(dá)脯氨酸4-羥化酶，因此，最終選擇BL21 (DE3)作為宿主菌。
[0100] 實(shí)施例6重組質(zhì)粒的優(yōu)化
[0101] 將優(yōu)化后的脯氨酸4-羥化酶基因和色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子序列經(jīng)雙酶切后，分別連接 到pUC19、pK19mobsacB、pET28a質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-ptrp2-Hyp、pK19mobsacB-ptrp2-Hyp、pET28a-ptrp2_Hyp，然后將重組質(zhì)粒 pUC19-ptrp2_Hyp、pK19mobsacB-ptrp2-Hyp、pET28a-ptrp-Hyp分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，構(gòu)建重組菌。其中，重組質(zhì)粒 pUC19-ptrp2_Hyp的構(gòu)建過(guò)程如圖4所述。
[0102] 新構(gòu)建的三株重組大腸桿菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，分別提取重組質(zhì)粒，提取后的重組質(zhì) 粒 pUC19-ptrp2-Hyp、pK19mobsacB-ptrp2-Hyp、pET28a-ptrp2-Hyp經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切 后，分別形成不同大小的兩條帶，其中，pAMP-ptrp2_Hyp雙酶切后形成1850bp和1063bp兩條 條帶，pK19mobsacB-ptrp2_Hyp 雙酶切生成 5 · 6kb 和 1063bp 兩條條帶，pET28a_ptrp2_Hyp 雙 酶切生成5 · 3kb和1063bp兩條條帶，pUC19-ptrp2-Hyp經(jīng)雙酶切后生成2 · 6kb和1063bp兩條 條帶。雙酶切結(jié)果如圖8所示。三株新構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，序列完全正確。
[0103 ]將重組菌 BL21 (DE3) /pUCl 9-ptrp2-Hyp 和 BL21 (DE3) /pAMP-ptrp2-Hyp 涂布至氨芐 抗性平板，重組菌 BL21 (DE3)/pK19mobsacB-ptrp2_Hyp、BL21 (DE3)/pET28a_ptrp2_Hyp 涂布 至卡那霉素抗性平板上，挑取單菌落，分別接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，其中重組大腸桿菌 BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp的全細(xì)胞酶活最高，如圖9所示，重組菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp的全細(xì)胞活性達(dá)到0 · 075±0 · 004U/mg，比最低水平高74 · 4%，因此，最終選擇重 組菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp 2-Hyp作為發(fā)酵生產(chǎn)菌。
[0104] 實(shí)施例7透明顫菌血紅蛋白在重組大腸桿菌中的克隆
[0105] 透明顫菌血紅蛋白基因（其序列如SEQ ID N0:3所示)序列由上海旭冠公司合成， 為了便于基因操作，在血紅蛋白基因在透明顫菌血紅蛋白基因溶氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子前插入 EcoR頂每切位點(diǎn)，同時(shí)，在血紅蛋白基因終止密碼子后插入Nde頂每切位點(diǎn)。將合成后的透明 顫菌血紅蛋白基因連接至PUC19質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-VHb，將重組質(zhì)粒pUC19-VHb經(jīng) EcoRI和Ndel雙酶切后，回收透明顫菌血紅蛋白基因片段，將回收片段連接到經(jīng)同樣酶雙 酶切后的重組質(zhì)粒口1^19^1:印2-取。的質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒。1](]1911:印2-辦。-'\^13，構(gòu)建 過(guò)程如圖6所示。
[0106] 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取單菌落，做菌落PCR，陽(yáng)性菌菌落 PCR可獲得一條大小約1600bp大小的條帶。菌落PCR電泳圖如圖10所示，挑取10個(gè)單菌種做 菌落PCR，電泳結(jié)果顯示10個(gè)單菌落均有一個(gè)大小約1600bp的特異性條帶，且條帶較粗，說(shuō) 明10個(gè)單菌落均為陽(yáng)性菌。
[0107] 挑取經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性菌的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒PUC19-ptrp2-Hyp_VHb經(jīng)EcoRI單酶切后，形成一條大小約4.2kb的條帶，pUC19_VHb經(jīng)EcoR I單酶 切后，形成一條約3kb的條帶，如圖11所示。重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序，序列完全正確。新構(gòu)建的重 組質(zhì)粒pUC19-ptrp2-Hyp-VHb轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，構(gòu)建重組菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb〇
[0108] 測(cè)定大腸桿菌血紅蛋白活性，將重組大腸桿菌BL21 (DE3 )/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb 和不含血紅蛋白基因的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pUC19-ptrp2_Hyp接種至含Amp 50yg/mL 的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后，取30mL發(fā)酵液8000Xg離心5min，回收菌體后，再用5mL0.1mM Tris-HCl(pH 7.5)重懸，超聲破碎后，離心棄去細(xì)胞碎片，回收含可溶蛋白上清。收集上清 后，向上清液中通入⑶，以BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp菌體碎片上清液作為空白對(duì)照，在 分光光度計(jì)上掃描400_500nm處的的吸光度。分析結(jié)果如圖12所示，以不含血紅蛋白基因的 重組大腸桿菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp細(xì)胞破碎液上清為空白對(duì)照，重組大腸桿菌 BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb細(xì)胞破碎上清液與⑶結(jié)合后，在419nm處出現(xiàn)一個(gè)吸收 峰，同時(shí)，在436nm處有一個(gè)明顯的波谷。說(shuō)明重組大腸桿菌BL21 (DE3 )/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb能表達(dá)出具有活性的透明顫菌血紅蛋白。
[0109] 實(shí)施例8重組大腸桿菌搖瓶發(fā)酵
[0110] 重組大腸桿菌搖瓶發(fā)酵的方法如下：
[0111] 從Amp抗性平板上挑取單菌落，接種至Amp終濃度為50yg/mL裝有30mL LB培養(yǎng)基的 250mL三角搖瓶中，37°C，220rpm培養(yǎng)8h后，按照6%的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中（30mL/ 250mL三角瓶），發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10g/L，甘油5g/L，胰蛋白胨8g/L，硫酸銨5g/L，磷酸氫二 鉀lg/L，氯化鈉2g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸亞鐵3mM，氯化鈣0.015g/L，L-脯氨酸400mM，培養(yǎng) 溫度35°C，220rpm培養(yǎng)64h，以不含VHb重組大腸桿菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp作為對(duì) 照，每組三個(gè)平行樣。發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)其發(fā)酵液〇D_，反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量進(jìn)行比較。結(jié)果 如圖13、14所示。
[0112] 由圖可知，VHb能夠延長(zhǎng)菌體的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，同時(shí)還有助于反式-4_羥脯氨酸的積累。發(fā)酵初期0_12h，VHb對(duì)菌體的生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)影響小，不含VHb的重組 大腸桿菌的〇D 6QQ與含有VHb基因的重組菌接近，反式-4-羥脯氨酸的積累量也相近，可能是 在重組大腸桿菌發(fā)酵的對(duì)數(shù)期，菌體快速生長(zhǎng)，發(fā)酵液中的溶氧足以滿足菌體的代謝需求， 或者可能是因?yàn)槌跗谌苎鯘舛容^高，而VHb基因只有當(dāng)發(fā)酵液中溶解氧低于5-20%時(shí)，啟動(dòng) 子才開始控制VHb的表達(dá)。由于發(fā)酵過(guò)程中溶氧隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，VHb基因 在溶氧誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下開始表達(dá)。不含VHb的重組菌在發(fā)酵12h后進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期， 由于菌體生長(zhǎng)速率減小，反式-4-羥脯氨酸的生成速率下降，而含有VHb的重組菌在12-28h 時(shí)仍處于菌體快速生長(zhǎng)階段，同時(shí)，產(chǎn)酸速率較BL21 (DE3 )/pUC19-ptrp2-Hyp高，在28h時(shí)反 式-4-羥脯氨酸的積累量達(dá)到3·02±0·16g/L。BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb重組菌在 發(fā)酵64h后，產(chǎn)酸量高達(dá)6 · 19±0 · 28g/L，是對(duì)照組BL21 (DE 3)/pUC19-ptrp2-Hyp的2 · 57倍， 同時(shí)，菌體〇D6QQ達(dá)到9.26 ± 0.42，較對(duì)照組提高了 56 %。
[0113] 透明顫菌血紅蛋白在高產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的重組大腸桿菌中表達(dá)，既可將氧傳 遞給呼吸鏈，改善氧化磷酸化效率，促進(jìn)重組菌BL21(DE3)/pUC19-ptrp2-Hyp-VHb在微氧條 件下的生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)酸。由于透明顫菌血紅蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞內(nèi)有可能將氧氣 直接傳遞給脯氨酸4-羥化酶，氧氣參與酶催化反應(yīng)，從而強(qiáng)化了反式-4-羥脯氨酸的生產(chǎn)， 提高L-脯氨酸的轉(zhuǎn)化率。
[0114] 最后應(yīng)說(shuō)明的是:顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并 非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做 出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引 申出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌通過(guò)將優(yōu)化的脯氨酸 4-羥化酶基因與色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子經(jīng)全基因合成后連接到插入有透明顫菌血紅蛋白基因 的表達(dá)載體，再將所述表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌后獲得； 所述優(yōu)化的脯氨酸4-羥化酶基因包括:將脯氨酸4-羥化酶基因中低使用率密碼子替換 為大腸桿菌中高使用率密碼子，并調(diào)整脯氨酸4-羥化酶基因的CG%使其接近宿主菌的 CG%;消除了脯氨酸4-羥化酶基因的酶切位點(diǎn)；調(diào)整脯氨酸4-羥化酶基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)以避 免脯氨酸4-羥化酶基因的mRNA的5 '端形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。2. 如權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述表達(dá)載體為pUC19質(zhì)粒。3. 如權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)。4. 如權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述優(yōu)化的脯氨酸4-羥化酶基因的CG%為 59.27%〇5. 如權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述優(yōu)化的脯氨酸4-羥化酶基因消除了 EcoR頂每切位點(diǎn)。6. 如權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述透明顫菌血紅蛋白基因插入于所述表 達(dá)載體的EcoR I和Nde頂每切位點(diǎn)之間。7. 如權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述優(yōu)化的脯氨酸4-羥化酶基因與色氨酸 串聯(lián)啟動(dòng)子經(jīng)全基因合成后連接到所述表達(dá)載體的BamH I和EcoR頂每切位點(diǎn)之間。8. 如權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述優(yōu)化的脯氨酸4-羥化酶基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO: 1所示，所述色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述 透明顫菌血紅蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。9. 一種利用權(quán)利要求1至8中任一所述的工程菌生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的方法。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK106085931SQ201610121104
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年3月4日 公開號(hào)201610121104.7, CN 106085931 A, CN 106085931A, CN 201610121104, CN-A-106085931, CN106085931 A, CN106085931A, CN201610121104, CN201610121104.7
【發(fā)明人】尚寧, 楊書華, 戴東升
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