環(huán)境微生物拜耳結(jié)合酵母的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種環(huán)境微生物-拜耳結(jié)合酵母。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物是自然界分布最廣泛、數(shù)量最大的一類生物。它們個(gè)體微小、繁殖速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)。一些微生物經(jīng)消化道入侵人體，比如說(shuō)沙門氏菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌等，它們可造成胃腸道疾病，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成肝、腦、腎臟器損害，甚至死亡。而霉菌的危害在于它所產(chǎn)生的毒素，比如黃曲霉毒素、伏馬菌素等，它們的毒性很強(qiáng)，具有很強(qiáng)的致癌性。另外，微生物及熱原若通過(guò)粘膜或血管直接侵入人體，將對(duì)人體健康造成更嚴(yán)重、更直接的危害。因此，在食品及藥品制造過(guò)程中，防范微生物污染至關(guān)重要。潔凈技術(shù)雖然能極大地降低食品藥品受到微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，但并不是要求絕對(duì)的無(wú)菌環(huán)境，也不能杜絕外來(lái)微生物侵入被加工物料和產(chǎn)品。實(shí)際上，食品和口服藥品均允許一定數(shù)量的非致病微生物殘留。即便是無(wú)菌藥品，在包裝完成后，通常還要接受滅菌處理。只有最終無(wú)需滅菌的無(wú)菌制品，才要求局部環(huán)境滿足“絕對(duì)無(wú)菌”的要求。對(duì)潔凈區(qū)或潔凈室環(huán)境微生物進(jìn)行監(jiān)測(cè)不但是保證產(chǎn)品質(zhì)量的要求，也是適應(yīng)國(guó)家有關(guān)強(qiáng)制性法規(guī)的要求。潔凈區(qū)實(shí)際上是一個(gè)特殊的生態(tài)環(huán)境，由于人員、設(shè)備、物料和大環(huán)境相對(duì)固定，所以微生物種群分布相對(duì)穩(wěn)定，但也會(huì)隨季節(jié)、房間消毒措施有規(guī)律地變化。
[0003]強(qiáng)力枇杷露原系《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二冊(cè)》收載的品種，具有養(yǎng)陰斂肺、鎮(zhèn)咳祛痰的功效，為臨床上治療久勞咳嗽、支氣管炎的常用藥，它可以抑制延腦咳嗽中樞，降低咳嗽反射弧的其他環(huán)節(jié)對(duì)刺激的敏感性。強(qiáng)力枇杷露市場(chǎng)應(yīng)用量比較大，生產(chǎn)企業(yè)也比較多，據(jù)查，全國(guó)有125個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)。強(qiáng)力枇杷露處方由枇杷葉、罌粟殼、百部、白前、桑白皮、桔梗、薄荷腦七味藥組成，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中提取工藝為:處方中除薄荷腦外的其余六味藥材加水煎煮兩次，每次兩小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濃縮，將藥用蔗糖制成單糖漿，苯甲酸鈉加水溶解，將單糖漿、苯甲酸鈉溶液、枸櫞酸、乙醇溶解的香精適量及薄荷腦加入濃縮液中，攪拌均勻，靜置，濾過(guò)，混勻，即得。
[0004]強(qiáng)力枇杷露無(wú)菌和微生物限度檢查是質(zhì)量控制的重要組成部分，藥品一旦受到微生物的污染，將可能對(duì)患者造成感染，甚至威脅到生命安全。而且藥品中微生物的污染具有高度的隨機(jī)性，所以在現(xiàn)代GMP生產(chǎn)條件下，防止污染是企業(yè)質(zhì)量管理的重點(diǎn)工作。如果能夠定位污染菌，將對(duì)藥品的生產(chǎn)和質(zhì)量控制都有積極的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供了一種環(huán)境微生物拜耳結(jié)合酵母。
[0006]—種環(huán)境微生物拜耳結(jié)合酵母，發(fā)現(xiàn)于生產(chǎn)強(qiáng)力枇杷露過(guò)程中，命名為Zygosaccharomyces bailii /勒保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào):CCTCC N0:M2015641，保藏日期為2015年10月26日，地址:湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)，郵編430072。
[0007]本發(fā)明的有益效果:在食品和藥品制造行業(yè)，AaiWi是一個(gè)常見的污染菌，而為yc^accAara^ce^ bailii /?是一株特殊的拜耳結(jié)合酵母，目前尚未報(bào)道。目前，若采用傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的微生物監(jiān)測(cè)方法，要經(jīng)歷7~14天的時(shí)間，才能通過(guò)菌落數(shù)量評(píng)價(jià)環(huán)境質(zhì)量。這樣的監(jiān)測(cè)方式不但繁瑣、復(fù)雜，而且對(duì)正常生產(chǎn)會(huì)產(chǎn)生影響，檢驗(yàn)結(jié)果也顯著滯后，且不能精確提供微生物種類信息。發(fā)現(xiàn)了新的污染菌株，將幫助制藥企業(yè)占據(jù)對(duì)該菌污染攻防斗爭(zhēng)的主動(dòng)地位，顯著提高微生物污染監(jiān)測(cè)和控制能力。
【附圖說(shuō)明】
[0008]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0009]圖1是本發(fā)明的工作流程圖；
圖 2 是 Zygosaccharomyces bailii /?的電鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。
[0011]在生產(chǎn)強(qiáng)力枇杷露過(guò)程中(杭州)，我們觀察發(fā)現(xiàn)有樣品含有酵母菌微生物，對(duì)藥品的安全性帶來(lái)重大隱患(比如造成鼓包)。為了杜絕污染，我們已經(jīng)找到了穩(wěn)定污染的菌，并基于基因組測(cè)序技術(shù)解析了該菌的基因組信息。
[0012]如圖1所示，本發(fā)明的流程如下:
(1)微生物收集
用虎紅和高鹽真菌培養(yǎng)基收集微生物。
[0013](2)微生物基因組提取
將收集的微生物重懸于0.5mL無(wú)菌PBS中，加入50 μ L溶菌酶(lyzosyme, 10 mg/mL), 6 μ L 變?nèi)芫?mutanolysin, 25000 U/mL; Sigma- Aldrich), 3 yL 溶葡球菌酶(lysostaphin, 4000 U/mL; Sigma- Aldrich),和 41 μ L TE50 溶液(10 mMTris.HCL 和50 mM EDTA, pH 8.0)，37。C 消化一小時(shí)。利用 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)提取DNA0
[0014](3) 18S rDNA擴(kuò)增，擴(kuò)增得到不同來(lái)源的微生物群落16S/18S rRNA序列真菌擴(kuò)增引物X區(qū)域。正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG，反向引物序列:
ACGGTATCTRATCRTCTTCG。
[0015](4)全基因組測(cè)序。通過(guò)Sanger測(cè)序后。測(cè)序過(guò)程主要包括DNA片段化；DNA片段純化；末端修復(fù)；端加A堿基；接頭連接；PCR擴(kuò)增。利用Hiseq2500進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)量達(dá)5G。
[0016](5)對(duì)于測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括去污染序列、低質(zhì)量序列后，使用SoapDenove進(jìn)行序列組裝。最后命名該污染菌為為bailii //ft電鏡圖如圖2所示。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種環(huán)境微生物拜耳結(jié)合酵母，其特征在于，發(fā)現(xiàn)于生產(chǎn)強(qiáng)力枇杷露過(guò)程中，命名為Zygosaccharomyces bailii /勒保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào):CCTCC NO:M2015641，保藏日期為2015年10月26日。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種環(huán)境微生物拜耳結(jié)合酵母，發(fā)現(xiàn)于生產(chǎn)強(qiáng)力枇杷露過(guò)程中，命名為<i>Zygosaccharomyces</i><i>？bailii？HQ</i><i>，</i>保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào):？CCTCC？NO:？M2015641，保藏日期為2015年10月26日，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)，郵編430072。發(fā)現(xiàn)了新的污染菌株，將幫助制藥企業(yè)占據(jù)對(duì)該菌污染攻防斗爭(zhēng)的主動(dòng)地位，顯著提高微生物污染監(jiān)測(cè)和控制能力。CCTCC NO: M201564120151026
【IPC分類】C12R1/645, C12N1/16
【公開號(hào)】CN105238706
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510714924
【發(fā)明人】陳煒, 高嶺, 張偉
【申請(qǐng)人】杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年10月29日