p;〇2進(jìn)行刺激來模擬UV對皮膚細(xì)胞的損傷。
[0072] 在96孔板內(nèi)加入含有人體成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基懸浮液200U1，細(xì)胞濃度為3000 個。37C5%C〇2培養(yǎng)箱賠育24小時，吸出培養(yǎng)基，分別加入含有姜黃素（國藥集團(tuán)，5g)W 及町WS300-2的培養(yǎng)基200ill，使其終濃度分別為5yM和0.Ol%，0. 05 %。培養(yǎng)基為含有 1〇%胎牛血清佑161。〇)、1〇〇1]/1111青霉素和1〇〇1]/1111鏈霉素的〇10\1培養(yǎng)基。371：5%〇)2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時。去除培養(yǎng)基，加入含有終濃度為0. 0035% &〇2的培養(yǎng)基，37°C5%C〇2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時。將含有&〇2的培養(yǎng)基去除，加入配置好的10%MTT的培養(yǎng)基，37°C5% (?培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時。去除孔中的培養(yǎng)基和MTT，加入二甲亞諷值MS0) 150UL/孔，立即 用酶標(biāo)儀測定ODsw值。結(jié)果表明，&〇2處理后，細(xì)胞存活率下降了 60. 08 %，而在&〇2處理 前，分別預(yù)先用0.Img/mlW及0. 5mg/ml的町W0S300-2進(jìn)行賠育，可使得細(xì)胞存活率分別 增加至 51. 40%和 54. 13%。
[0073] 實(shí)施例4 ;利用流式細(xì)胞儀測定黃精目-半乳聚糖對成纖維細(xì)胞的抗調(diào)亡作用
[0074] 在6孔板內(nèi)加入含有人體成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基懸浮液2ml，細(xì)胞濃度為IX1〇5個。 37°C5% 0)2培養(yǎng)箱賠育24小時，吸出培養(yǎng)基，分別加入含有姜黃素W及HJWS300-2的培養(yǎng) 基2ml，使其終濃度分別為SyM和0.05%。培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清（Gibico)UOOU/ ml青霉素和lOOU/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。37°C5% (?培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時。
[00巧]去除培養(yǎng)基，加入含有終濃度為0. 0035% &〇2的培養(yǎng)基，37°C5%C〇2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2小時。收集各孔上清液于相應(yīng)1. 5ml離必管內(nèi)，離必，500化pmXImin。棄上清液，吸取各 孔內(nèi)剩余培養(yǎng)基于各自離必管內(nèi)，加適量膜酶（300UL)于已吸凈培養(yǎng)基的孔板內(nèi)，消化。 重新吸回離必管內(nèi)的培養(yǎng)基于各孔內(nèi)終止消化并吹打貼壁的細(xì)胞，離必，300化pmX5min。 棄上清，加ImlPBS(已預(yù)冷）于各離必管內(nèi)，輕輕彈勻，離必,300化pmX5min。選用Alexa Fluor488AnnexinV/Dead細(xì)胞調(diào)亡試劑盒（invitrogenV13241)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。加入 100yLlX 膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液于每1. 5ml離必管中，再依次加入2ULAlexaFluor488AnnexinV(組 分A)和1ULlOOUg/mlPI工作液。室溫避光染色15min。每管加入400ULlX膜聯(lián)蛋白 結(jié)合緩沖液，輕輕搖勻，置于冰上。過濾細(xì)胞于流式管內(nèi)，做好標(biāo)記，準(zhǔn)備上流式。
[0076] 結(jié)果表明，?化處理后，正常細(xì)胞比例下降至76. 06%，而&化處理前，預(yù)先用 0. 5mg/ml的町W0S300-2進(jìn)行賠育，可使得正常細(xì)胞比例分別增加至83. 71%。
[0077] 實(shí)施例5;Caspase-3活力檢測
[0078] Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為 關(guān)鍵的執(zhí)行分子，在調(diào)亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。正常情況下，Caspase-3 W酶原 (32邸a)的形式存在于胞漿內(nèi)。在調(diào)亡早期階段，Caspase-3會被激活，活化的化spase-3 發(fā)生裂解，成為由兩個亞基，分子量分別為17KDa和12KDa，最終導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡。
[0079] 在6孔板內(nèi)加入含有人體成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基懸浮液2ml，細(xì)胞濃度為1X1〇5個。 37°C5% 0)2培養(yǎng)箱賠育24小時，吸出培養(yǎng)基，分別加入含有姜黃素W及HJWS300-2的培養(yǎng) 基2ml，使其終濃度分別為SyM和0.05%。培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清（Gibico)UOOU/ ml青霉素和lOOU/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。37°C5% (?培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時。
[0080] 配制12%濃度的SDS-PAGE電泳膠。將生物素化反應(yīng)后的蛋白加入IX加載緩沖 液，IOCTC條件下煮沸30min，冷卻離必后準(zhǔn)備上樣。在化is-甘氨酸電泳緩沖液巧5mM化is， 250mM甘氨酸（P冊.3),0. 1%SDS]中W80V電壓電泳30min之后換成120V電泳約60min。 將膠取下，切去上層膠，置于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液中，浸泡大約30min。量取并剪下大小一致的醋 酸纖維素膜（NC膜）一張W及Bio-Rad厚濾紙兩張，從正極到負(fù)極依次放好濾紙、NC膜、 SDS-PAGE膠、濾紙，并趕走氣泡，蓋好轉(zhuǎn)膜儀，恒流條件下（2mA/cm2)，轉(zhuǎn)膜60min。轉(zhuǎn)膜完 畢后，取下NC膜，麗春紅S染色觀察轉(zhuǎn)膜效果，TBST洗去染液。用TBSTW%脫脂奶粉室溫 封閉比。賠育Caspase-3(Cellsi即aling公司）和目-肌動蛋白（目-actin)抗體4°C過 夜，W目-肌動蛋白抗體做為對照。分別用兔抗和鼠抗的HRPQ:5000)做為第二抗體，賠育 比，結(jié)束后，TBST洗膜H次，每次lOmin。底物賠育5min，X膠片曝光和顯影。
[0081] 結(jié)果表明，&化處理組，激活化spase-3,使之產(chǎn)生裂分。&化處理前，預(yù)先用0.5mg/ ml的HJW0S300-2賠育，與單獨(dú)用&〇2處理組相比較，可抑制化spase-3的激活，使得裂分 Caspase-3的表達(dá)下降。送一結(jié)果也證明了HJW0S300-2具有抑制細(xì)胞調(diào)亡作用。
[0082] W下實(shí)施例說明了本發(fā)明可用于化妝品組合物?？蒞W常規(guī)方式制備送些組合 物。它們適宜于皮膚抗衰老用途。
[0083]實(shí)施例6 ;-種含有黃精目-半乳聚糖活性物抗衰老膏霜的制備
[0085] 制備方法；將水、了二醇攬拌均勻加熱至75C-8(TC，得到水相。將甘油硬脂酸醋 巧樣酸醋、甘油硬脂酸醋、十六十八醇、辛酸/癸酸甘油H醋、礦物油加入油相鍋中，加熱至 75C-8(TC，攬拌均勻，得到油相。將油相緩慢加入水相中，并不停攬拌，均勻后加入黃精 目-半乳聚糖HJW0S300-2活性物、防腐劑和香精，攬拌均勻，即得。
[0086] 實(shí)施例7 ;-種含有黃精目-半乳聚糖HJW0S300-2抗衰老護(hù)膚水的制備
[0088] 制備方法；將黃精目-半乳聚糖HJW0S300-2活性物溶于水和了二醇中，攬拌溶解 均勻后，加入防腐劑和香精，攬拌溶解均勻，即得。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種黃精(6-半乳聚糖HJW0S300-2在抗衰老或防曬作用的化妝品中的應(yīng)用，其中所 述聚糖的結(jié)構(gòu)式如下：分子量范圍在8-15KDa，其平均分子量Mw為lOKDa。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述聚糖的比旋光度為[a]25D+42°，其中 測定條件為25°C，濃度為0. 5mg/ml的水溶液。3. -種黃精(6-半乳聚糖HJW0S300-2在抑制成纖維細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用，其中所述聚糖 的結(jié)構(gòu)式如下：分子量范圍在8-15KDa，其平均分子量Mw為lOKDa。4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述聚糖的比旋光度為[a]25D+42°，其中 測定條件為25°C，濃度為0. 5mg/ml的水溶液。5. -種具有抗衰老或防曬作用的化妝品，其特征在于，所述化妝品包含黃精(6-半乳 聚糖HJW0S300-2以及化妝品領(lǐng)域可接受的賦形劑，其中所述聚糖的結(jié)構(gòu)式如下：分子量范圍在8-15KDa，其平均分子量Mw為lOKDa。6. 如權(quán)利要求5所述的化妝品，其特征在于，所述化妝品選自：潔面乳、化妝水、乳液、 膏霜、啫喔、面膜。7. 如權(quán)利要求5述的化妝品，其特征在于，所述黃精(6-半乳聚糖的使用量為 0. 0001% -10% (w/w) 〇8. 如權(quán)利要求5述的化妝品，其特征在于，所述黃精(6-半乳聚糖的使用量為0.05% (w/w)〇9. 一種黃精P_半乳聚糖HJW0S300-2在制備具有抗衰老或防曬作用的化妝品中的應(yīng) 用，其中所述聚糖的結(jié)構(gòu)式如下：分子量范圍在8-15KDa，其平均分子量Mw為lOKDa。
【專利摘要】本發(fā)明公開了黃精β-半乳聚糖HJW0？S300-2在抗衰老或防曬作用的化妝品中的應(yīng)用，其中所述聚糖的結(jié)構(gòu)式如下：，分子量范圍在8-15KDa，其平均分子量Mw為10KDa。本發(fā)明還涉及上述黃精β-半乳聚糖在抑制成纖維細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用以及包含這種黃精β-半乳聚糖的化妝品。
【IPC分類】A61Q17/04, A61K8/73, A61P17/18, A61Q19/08, C08B37/00, A61K31/715
【公開號】CN105218692
【申請?zhí)枴緾N201410246832
【發(fā)明人】王瀅, 張慶, 丁侃, 趙亞, 魏少敏, 吳越, 陳默, 戴競
【申請人】上海家化聯(lián)合股份有限公司, 中國科學(xué)院上海藥物研究所
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2014年6月5日