專利名稱：枸杞阿拉伯半乳聚糖蛋白、制備工藝、用途及其組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥制藥領域。具體涉及一種從寧夏枸杞子(Lyciumbarbarum L.)中提取、純化得到的重均分子量在30,000-100,000道爾頓之間的阿拉伯半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan proteins.AGPs)，簡稱枸杞AGPs。含量＞80％。具備高等植物AGPs的化學特點1.多糖∶蛋白＝80-95％∶5-20％。2.糖組成特點主要含有阿拉伯糖(Ara)和半乳糖(Gal)，兩者的摩爾百分比之和＞50％。3.糖鏈Ara主要為5-、2，5-和3，5-連接。Gal主要為6-和3，6-連接。4.氨基酸(AA)組成特點羥脯氨酸(Hyp)15-20％，絲氨酸(Ser)10-20％，蘇氨酸(Thr)5-10％，谷氨酸(Glu)5-10％，甘氨酸(Gly)5-10％，天冬氨酸(Asp)5-10％，丙氨酸(Ala)5-10％。5.重均分子量30,000-100,000道爾頓。6.溶解性溶于水。本發(fā)明還涉及枸杞AGPs的制備工藝、制劑及其用途，同時本申請還提供了所述枸杞AGPs與黃芪提取物、當歸提取物或G-CSF的組合物，通過組合能夠使各組分協(xié)同增效。
枸杞子為茄科枸杞屬植物寧夏枸杞的干燥成熟果實。枸杞為落葉灌木，花期5-6月，果期6-11月。
中醫(yī)認為枸杞子性味甘、平。功效為養(yǎng)肝明目、補腎益精，潤肺。用于治療肝腎陰虧、精血不足、腰膝酸軟，頭暈目眩。隨著現(xiàn)代醫(yī)學、藥學和分子生物學的發(fā)展，人們對枸杞子的藥理作用也有了進一步的認識。耿長山等(軍事醫(yī)學科學院院刊.1987(11)476)，(中草藥，1988.19.(7)25)對枸杞多糖(LBP)的藥理作用研究表明枸杞多糖(LBP)能顯著增加正常小鼠的脾重和提高外周血T淋巴細胞百分數(shù)。王柏昆等(中國藥理學與毒理學雜志.1990(4)1)發(fā)現(xiàn)枸杞多糖(LBP)可以對抗環(huán)磷酰胺對小鼠T細胞、CTL細胞和NK細胞的免疫抑制作用。周志文等(中國藥理學與毒理學雜志.1991(5)1)發(fā)現(xiàn)枸杞多糖(LBP)可以促進小鼠骨髓造血干細胞(CFU-S)、粒-單系祖細胞(CFU-GM)和紅系爆增式集落形成細胞(BFU-E)的增殖，因此，探討以枸杞多糖作為有效部位用于生血，提高免疫功能，很有前景。
本發(fā)明提供一種從枸杞子中提取、純化得到的重均分子量在30,000-100,000道爾頓之間的阿拉伯半乳聚糖蛋白(Arabinogalactanproteins.AGPs)，簡稱枸杞AGPs。含量＞80％。
主要工藝流程如下枸杞子洗凈后，加水在100℃提取(加水量為3-4倍，每次提取1.0小時，共提取2次)。提取液60-65℃減壓濃縮至稀稠膏狀，冷卻后進行30-45％醇沉，4℃靜置8-12小時。收集上清液，噴霧干燥，即得枸杞AGPs粗品。將枸杞AGPs粗品用水溶解，濃度為4-6％，用截留分子量為10K的超濾膜超濾(MWCO＝10,000)，保留液上SP Sepharose離子交換柱，洗脫液為pH5-6，30-50mM的緩沖液(取分析純的酸及其鹽，用水分別配制所需濃度的溶液，按不同比例混合即得)，緩沖液可以選自檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液等。收集流出液共3個柱體積，用截留分子量為5K的超濾膜超濾(MWCO＝5,000-8,000)，保留液上DEAE Sepharose離子交換柱，洗脫液為pH5-6，30-50mM的緩沖液(取分析純的酸及其鹽，用水分別配制所需濃度的溶液，按不同比例混合即得)，緩沖液可以選自檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液等。收集流出液共3個柱體積，用截留分子量為5K的超濾膜超濾(MWCO＝5,000-8,000)，保留液經(jīng)70％乙醇沉淀兩次，離心，收集沉淀。沉淀加水反溶，濃度為20-30％，噴霧或冷凍干燥，即得含量在80％以上的枸杞AGPs。
或收集30-45％醇沉后的上清液，回收乙醇后用截留分子量為10K的超濾膜超濾及以后的步驟，同樣得到枸杞AGPs。
本發(fā)明還提供了枸杞AGPs注射劑的制備方法取適量的枸杞AGPs，加入一種或多種藥學上可以接受的助溶劑、分散劑、載體或賦形劑，混合后制成適當注射劑如粉針、水針或凍干粉針。每個注射劑量單位至少含30mg本發(fā)明物。
本發(fā)明提供的枸杞AGPs用于治療中性粒細胞減少癥、貧血、血小板減少癥和作為抗癌輔助藥?？梢允菃为氂盟?，也可與其它多糖或G-CSF等藥物聯(lián)合用藥。
本發(fā)明提供的枸杞AGPs在生血方面的藥理作用為體外實驗的結果表明，單獨使用枸杞AGPs，其濃度在50-400μg/ml時，可有效地刺激用植物血凝素(PHA)活化的人的外周血單核細胞產(chǎn)生白細胞介素6(IL-6)、粒/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。
枸杞AGPs與黃芪多糖、當歸多糖或G-CSF組合后，能夠發(fā)揮協(xié)同增效作用。當枸杞AGPs和黃芪多糖(參考封士蘭等.黃芪多糖生產(chǎn)工藝研究.中成藥.1997.19(12).5-6.中的工藝并加以改良后提取，純化而得，多糖含量在95％以上)合并用藥，枸杞AGPs濃度為100μg/ml，黃芪多糖濃度為100μg/ml時，與單獨使用枸杞AGPs或黃芪多糖，濃度為200μg/ml比較，刺激用PHA活化的人的外周血單核細胞產(chǎn)生IL-6、GM-CSF和G-CSF的能力增強。當枸杞AGPs和G-CSF合并用藥，枸杞AGPs用量為50mg/kg/d，G-CSF用量為100μg/kg/d，與單獨使用枸杞AGPs，用量為50mg/kg/d，或單獨使用G-CSF用量為100μg/kg/d相比較，刺激Balb/c小鼠產(chǎn)生粒/巨噬細胞集落形成細胞(GM-CFC)和紅系爆增式集落形成細胞(BFU-E)的能力明顯增強。
體內實驗的結果表明，對接受放療的Balb/C小鼠單獨使用枸杞AGPs，當用藥量為25-100mg/kg/d，皮下注射給藥，連續(xù)使用7天，與安慰劑組比較，白細胞和血小板的恢復提前了4-7天。進一步的研究表明，給藥組小鼠骨髓造血干細胞和粒、單系祖細胞數(shù)目增加，并誘導脾臟細胞生成IL-3、IL-6、GM-CSF和G-CSF。當枸杞AGPs和黃芪多糖合并用藥，用藥量為枸杞AGPs 50mg/kg/d，黃芪多糖50mg/kg/d，用法同上時，與單獨使用枸杞AGPs或黃芪多糖，用藥量為100mg/kg/d組相比較，白細胞的恢復提前了2-4天。當枸杞AGPs和當歸多糖(參考張林維等.當歸多糖的分離純化及其部分性質的研究.生物學雜志.1998.15(3).12-14.并加以改良后提取，純化而得。多糖含量在95％以上)合并用藥時，用藥量為枸杞AGPs 50mg/kg/d，當歸多糖50mg/kg/d，用法同上時，與單獨使用枸杞AGPs或當歸多糖，用藥量為100mg/kg/d組比較，白細胞、血小板和紅細胞的恢復都提前了。當枸杞AGPs和G-CSF合并用藥，用藥量為枸杞AGPs100mg/kg/d，G-CSF 1-3μg/kg/d，用法同上時，與單獨使用G-CSF，用藥量為1-3μg/kg/d或單獨使用枸杞AGPs，用藥量為100mg/kg/d組比較，白細胞、血小板和紅細胞的恢復都提前了3-4天。對接受化療的Balb/C小鼠單獨使用枸杞AGPs時，當用藥量為25-100mg/kg/d，皮下注射給藥，連續(xù)使用7天時，與安慰劑組比較，白細胞和血小板的恢復提前了4-7天。當枸杞AGPs和黃芪多糖合并用藥，用藥量為枸杞AGPs 50mg/kg/d，黃芪多糖50mg/kg/d，用法同上時，與單獨使用枸杞AGPs或黃芪多糖，用藥量為100mg/kg/d組相比較，白細胞的恢復提前了2-4天。當枸杞AGPs與當歸多糖合并用藥，用藥量為枸杞AGPs 50mg/kg/d，當歸多糖50mg/kg/d，用法同上時，與單獨使用枸杞AGPs或當歸多糖，用藥量為100mg/kg/d組比較，白細胞，血小板和紅細胞的恢復都提前了。當枸杞AGPs和G-CSF合并用藥，用藥量為枸杞AGPs 100mg/kg/d，G-CSF 1-3μg/kg/d，用法同上時，與單獨使用G-CSF，用藥量為1-3μg/kg/d時或單獨使用枸杞AGPs，用藥量為100mg/kg/d組比較，白細胞、血小板和紅細胞的恢復都提前了3-4天。
本發(fā)明提供的枸杞AGPs在增強免疫方面的藥理作用為體內實驗的結果表明，當枸杞AGPs的用量在25-100mg/kg/d，可有效地刺激正常或接受化療的Balb/C小鼠脾細胞產(chǎn)生干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素2(IL-2)和白細胞介素4(IL-4)。枸杞AGPs還可提高S-180荷瘤小鼠脾臟NK細胞活性，刺激S-180荷瘤小鼠脾細胞產(chǎn)生白細胞介素2(IL-2)等細胞因子。
具體實施例方式
實施例1枸杞AGPs的制備枸杞子40kg，加水提取2次，每次加水160kg，提取1.0小時，提取溫度為100℃。合并提取液65℃減壓濃縮至稀稠膏狀，調整體積至20L，靜置過夜，加入95％乙醇至終濃度38％，攪拌均勻，4℃放置10小時，5000×g離心10min，收集上清液，噴霧干燥，得枸杞AGPs粗品598g。將枸杞AGPs粗品598g用水溶解，濃度為4％，用截留分子量為10K的超濾膜超濾，保留液體積為9.2L，上200×300mm SPSepharose離子交換柱，洗脫液為pH5.2，50mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液，收集流出液共30L，用截留分子量為5K的超濾膜超濾，得保留液9.1L，保留液上DEAE Sepharose離子交換柱，洗脫液為pH5.2，50mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液，收集流出液共32L，用截留分子量為5K的超濾膜超濾(MWCO＝5,000-8,000)，得保留液6L。加入95％乙醇至終濃度70％，4℃放置10小時，5000×g離心5min，收集沉淀。沉淀加水反溶至6L，，加入95％乙醇至終濃度70％，4℃放置10小時，5000×g離心5min，收集沉淀。沉淀加水反溶至7L，噴霧干燥，得枸杞AGPs138g。AGPs含量為83％。
檢測結果如下1.糖組成(Mol％)

2.氨基酸組成(％)

3.蛋白質含量和重均分子量蛋白質含量10.9％。
重均分子量87,600道爾頓實施例2枸杞AGPs凍干粉針劑的制備取實施例1所得30g枸杞AGPs，用含0.5％氯化鈉、0.4‰的吐溫-80、pH5.0，50mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解，調整終體積至2000ml。0.22um濾膜除菌過濾，分裝到1000個10ml西林瓶中，凍干即得。
實施例3枸杞AGPs誘導PHA活化的人的外周血單核細胞生成GM-CSF，G-CSF和IL-6實驗共分為6組第1組試藥為實施例1，濃度為50μg/ml。第2組試藥為實施例1，濃度為100μg/ml。第3組試藥為實施例1，濃度為200μg/ml，。第4組試藥為實施例1，濃度為400μg/ml。第5組試藥為用現(xiàn)有實驗室方法提取、純化得到的枸杞多糖(LBP)(王玲等，昆明醫(yī)學院學報.1995.16(2))，濃度為400μg/ml。第6組試藥為豬苓多糖注射劑(連云港東風制藥廠)，濃度為400μg/ml。作為陽性對照。第7組為空白對照。
從健康人全血中分離、洗滌得到人外周血單核細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞數(shù)到1×106/ml，依次加入各管，每管1.0ml。再加入藥液0.5ml(除空白對照外)，PHA液0.5ml(至終濃度4μg/ml)。37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，離心，收集上清。用相應的ELISA試劑盒分別檢測GM-CSF，G-CSF和IL-6的生成量，用加藥組產(chǎn)生的細胞因子量比空白對照組產(chǎn)生的細胞因子量(S/C)為表示活性的單位。
下表顯示不同濃度的枸杞AGPs誘導生成GM-CSF，G-CSF和IL-6的數(shù)量

從以上結果可以看出枸杞AGPs能誘導PHA活化的人的外周血單核細胞生成GM-CSF，G-CSF和IL-6，且生成量與藥物濃度呈正相關。枸杞AGPs的誘導效果明顯優(yōu)于同等劑量的LBP。
實施例4枸杞AGPs與黃芪多糖合用強化PHA活化的人的外周血單核細胞誘導生成GM-CSF，G-CSF和IL-6試藥共分為4組第1組試藥為實施例1，濃度為200μg/ml。第2組試藥為黃芪多糖，濃度為200μg/ml。第3組試藥為實施例1+黃芪多糖，濃度各為100μg/ml。第4組試藥為豬苓多糖注射劑(連云港東風制藥廠)，濃度為400μg/ml。作為陽性對照。未加藥組作為空白對照。
從健康人全血中分離、洗滌得到人外周血單核細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞數(shù)到1×106/ml。加入各管，每管1.0ml。各管再加入藥液0.5ml(空白對照除外)，PHA液0.5ml(至終濃度4μg/ml)。37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，離心，收集上清。用相應的ELISA試劑盒檢測GM-CSF，G-CSF和IL-2的生成量，用加藥組產(chǎn)生的細胞因子量/空白對照組產(chǎn)生的細胞因子量(S/C)表示活性。
下表顯示枸杞AGPs與黃芪多糖合用強化誘導生成G-CSF，GM-CSF和IL-6

從以上結果可以看出當枸杞AGPs與黃芪多糖合用時，刺激用PHA活化的人的外周血單核細胞產(chǎn)生IL-6，GM-CSF和G-CSF的能力增強。
實施例5枸杞AGPs和G-CSF合用刺激Balb/c小鼠產(chǎn)生GM-CFC和BFU-E的能力明顯增強。
試藥分為4組第1組.實施例1，用量50mg/kg/d。第2組.G-CSF(重組人粒細胞集落刺激因子.商品名惠爾血.麒麟鯤鵬(中國)生物藥業(yè)有限公司)用量100μg/kg/d。第3組.實施例1+G-CSF，用量為實施例150mg/kg/d，G-CSF100μg/kg/d。第4組.安慰劑組。
雌性Balb/c小鼠，體重18-22g，隨機分組，每組5只。皮下注射給藥，每日一次，連續(xù)給藥7天。取外周血，分離單核細胞，洗滌后用含有EPO(紅細胞生成素)、IL-3、IL-6和干細胞因子等的培養(yǎng)基調整細胞數(shù)為1×105個/ml，依次加入35mm的培養(yǎng)皿，每皿加入1.0ml。5％CO2培養(yǎng)箱，37℃飽和濕度培養(yǎng)7天，在顯微鏡下計數(shù)含50個細胞的集落(BFU-E)。各皿加入染色劑1ml，5％CO2培養(yǎng)箱，37℃飽和濕度培養(yǎng)3.5小時，在顯微鏡下計數(shù)棕色的細胞集落(GM-CFC)。
下表顯示枸杞AGPs和G-CSF合用刺激Balb/c小鼠產(chǎn)生GM-CFC和BFU-E的能力明顯增強。
從以上結果可以看出當枸杞AGPs和G-CSF合用刺激Balb/c小鼠產(chǎn)生GM-CFC和BFU-E的能力明顯增強。
實施例6枸杞AGPs促進接受放療小鼠外周血象的恢復Balb/c雌性小鼠，體重18-22g，隨機分組，每組15只。試藥分為4組第1組為實施例1，用量為25mg/kg/d。第2組為實施例1，用量為50mg/kg/d。第3組為實施例1，用量為100mg/kg/d。第4組為LBP，用量為100mg/kg/d。第5組為安慰劑組。第6組為正常對照組。
1-5組小鼠在0天接受X射線照射，照射量為500cGy。從照射當日開始皮下注射給藥，每天一次，連續(xù)用藥一周。各組小鼠每3日尾靜脈采血1次，計數(shù)外周血白細胞(WBC)，紅細胞(RBC)和血小板(PLT)，連續(xù)觀察4周。
外周血WBC(×109/L)的變化 外周血RBC(×1012/L)的變化 外周血PLT(×109/L)的變化 從以上結果可以看出第1組RBC的恢復與對照組相似，P＞0.05。WBC的恢復較對照組提前了4天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了3天，P＜0.05。第2組RBC的恢復與對照組相似，P＞0.05。WBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。第3組RBC的恢復與對照組相似，P＞0.05。WBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。第4組RBC的恢復與對照組相似，P＞0.05。WBC的恢復較對照組提前了4天，P＜0.01。PLT的恢復與對照組相似，P＞0.05。
從以上結果可以看出當枸杞AGPs的用量在25-100mg/kg/d時，可以促進接受放療小鼠外周血象的恢復，特別是促進PLT和WBC的恢復，且恢復的情況與用藥量呈正相關。LBP只有促進WBC的恢復的作用，且效果差于同等劑量的枸杞AGPs。
實施例7枸杞AGPs與當歸多糖合用促進放療小鼠外周血象全面恢復Balb/c雌性小鼠，體重18-22g，隨機分組，每組15只。試藥分為4組第1組為實施例1，用量為100mg/kg/d。第2組為當歸多糖，用量為100mg/kg/d。第3組為實施例1+當歸多糖，用量為各50mg/kg/d。第4組為安慰劑組。第5組為正常對照組。
1-4組小鼠在0天接受X射線照射，照射量為500cGy。從照射當日開始皮下注射給藥，每天一次，連續(xù)用藥一周。各組小鼠每3日尾靜脈采血1次，計數(shù)外周血WBC，RBC和PLT。連續(xù)觀察4周。
外周血WBC(×109/L)的變化 外周血RBC(×1012/L)的變化
外周血PLT(×109/L)的變化 結果發(fā)現(xiàn)第1組RBC的恢復與對照組相似，P＞0.05。WBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。第2組RBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。WBC和PLT的恢復與對照組近似，P＞0.05。第3組RBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。WBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。
從以上結果可以看出聯(lián)合使用枸杞AGPs和當歸多糖，具有互補作用，既比單獨用枸杞AGPs的RBC恢復時間提前，又比單獨用當歸多糖的WBC、PLT的恢復時間提前，可使照射后小鼠的外周血象盡快全面恢復。
實施例8枸杞AGPs與黃芪多糖合用進一步促進接受化療小鼠外周血WBC的提前恢復
Balb/c雌性小鼠，體重18-22g，隨機分組，每組15只。試藥分為4組第1組為實施例1，用量為100mg/kg/d。第2組為黃芪多糖，用量為100mg/kg/d。第3組為實施例1+黃芪多糖，用量為各50mg/kg/d。第4組為安慰劑組。第5組為正常對照組。
1-4組小鼠在0天接受絲裂霉素C，尾靜脈給藥，給藥量3.5mg/kg/d。連續(xù)用藥3天?；煯斎臻_始皮下注射給藥，每天一次，連續(xù)用藥14天。各組小鼠每3日尾靜脈采血1次，計數(shù)外周血WBC，RBC和PLT。連續(xù)觀察4周。
外周血WBC(×109/L)的變化 外周血RBC(×1012/L)的變化 外周血PLT(×109/L)的變化
結果發(fā)現(xiàn)第1組RBC的恢復與對照組相似，P＞0.05。WBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。第2組RBC的恢復與對照組相似，P＞0.05。WBC的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了3天，P＜0.05。第3組RBC的恢復與對照組相似，P＞0.05。WBC的恢復較對照組提前了11天，P＜0.01。PLT的恢復較對照組提前了7天，P＜0.01。
從以上結果可以看出聯(lián)合使用枸杞AGPs和黃芪多糖，與二者單獨使用組相比，既具有互補作用，使接受化療后小鼠的WBC，PLT均提前恢復。且對WBC的恢復有增效作用。
實施例9枸杞AGPs與G-CSF合用促進化療小鼠外周血象全面恢復Balb/c雌性小鼠，體重18-22g，隨機分組，每組15只。試藥分為4組第1組為實施例1，用量為100mg/kg/d。第2組為G-CSF，(重組人粒細胞集落刺激因子.商品名惠爾血.麒麟鯤鵬(中國)生物藥業(yè)有限公司)用量為3μg/kg/d。第3組為實施例1+G-CSF，用量為實施例1 100mg/kg/d，G-CSF 3μg/kg/d。第4組為安慰劑組。第5組為正常對照組。
1-4組小鼠在0天接受絲裂霉素C，尾靜脈給藥，給藥量3.5mg/kg/d。連續(xù)用藥3天?；煯斎臻_始皮下注射給藥，每天一次，連續(xù)用藥14天。各組小鼠每3日尾靜脈采血1次，計數(shù)外周血WBC，RBC和PLT。連續(xù)觀察4周。
外周血WBC(×109/L)的變化 外周血RBC(×1012/L)的變化 外周血PLT(×109/L)的變化 從以上結果可以看出當枸杞AGPs和G-CSF合并用藥，與單獨使用G-CSF或枸杞AGPs比較，具有增效作用，白細胞、血小板的恢復都提前了3-4天，紅細胞的恢復也提前了。
實施例10枸杞AGPs誘導正常小鼠和環(huán)磷酰胺化療小鼠脾細胞產(chǎn)生IL-2、IL-4、IL-3、IL-6和IFN-γ
Balb/c雄性小鼠，體重18-22g，隨機分組，每組8只。第1、2組從第1天開始皮下注射實施例1，用量為100mg/kg/d，連續(xù)給藥7天。第3組從第1天開始皮下注射豬苓多糖，用量為100mg/kg/d，連續(xù)給藥7天，作為陽性對照。第4組從第1天開始皮下注射LBP，用量為100mg/kg/d，連續(xù)給藥7天。第5、6組從第1天開始皮下注射等體積生理鹽水，連續(xù)給藥7天。1、3、4、5組第4天腹腔注射環(huán)磷酰胺200mg/kg，注射環(huán)磷酰胺后的第5天，處死所有小鼠，制備脾細胞懸液。用24孔細胞培養(yǎng)板，分別加入脾細胞懸液各1ml(細胞終濃度5×106/ml)，ConA 1ml(終濃度為2.5μg/ml)或OVA 1ml((終濃度為200μg/ml)，5％CO2，37℃培養(yǎng)48小時，離心，取上清液，用ELASA法檢測細胞因子的含量。結果見下表表1

備注*表示第2組與第6組比較。**表示第1組與第5組比較。***表示第1組與第4組比較。
表2

備注*表示第2組與第6組比較。**表示第1組與第5組比較。***表示第1組與第4組比較。
表3

備注*表示第2組與第6組比較。**表示第1組與第5組比較。***表示第1組與第4組比較。
從以上結果可以看出枸杞AGPs可誘導正常小鼠產(chǎn)生IL-4、IL-3、IL-6和IFN-γ。枸杞AGPs還可誘導環(huán)磷酰胺化療小鼠脾細胞產(chǎn)生IL-2、IL-4、IL-3、IL-6和IFN-γ。且生成量明顯高于等劑量的LBP。
實施例11
枸杞AGPs提高S-180荷瘤小鼠脾臟NK細胞活性，刺激S-180荷瘤小鼠脾細胞產(chǎn)生白細胞介素2(IL-2)。
Balb/c雄性小鼠，體重18-22g，隨機分組，每組5只。1.正常對照組。2.S-180對照組。3.枸杞AGPs給藥組。4.LBP給藥組。5.豬苓多糖給藥組(陽性對照)。第一天，除第1組外，各鼠腋下皮內注射1×106/ml S-180細胞0.2ml。次日第3組皮下注射枸杞AGPs、第4組皮下注射LBP、第5組皮下注射豬苓多糖，劑量均為100mg/kg/d，連續(xù)用藥7天。第8天，處死所有小鼠，制備脾細胞懸液。
1.NK細胞的活性測定用96孔細胞培養(yǎng)板，分別加入脾細胞懸液各100μl(細胞終濃度5×105/ml)和3H-TdR標記的靶細胞100μl(細胞終濃度5×105/ml)，只加3H-Tymidine標記的靶細胞200μl(細胞終濃度5×105/ml)孔為空白對照。在5％CO2，37℃孵箱中孵育4小時，用細胞收集器收集，在γ液閃儀讀取cpm值，計算特異性殺傷百分比。
0.白細胞介素2(IL-2)活性的測定用24孔細胞培養(yǎng)板，分別加入脾細胞懸液各1ml(細胞終濃度5×106/ml)，加入ConA 1ml(終濃度為2.5μg/ml)，5％CO2，37℃培養(yǎng)48小時，離心，取上清液，用ELASA法檢測IL-2的含量。
結果見下表

*表示第2組與第3組比較。**表示第3組與第4組比較。
從以上結果可以看出枸杞AGPs提高了S-180荷瘤小鼠脾臟NK細胞活性，刺激S-180荷瘤小鼠脾細胞產(chǎn)生白細胞介素2(IL-2)。且作用明顯高于等劑量的LBP。
根據(jù)以上結果可以將枸杞AGPs單獨用于治療中性粒細胞減少癥、貧血、血小板減少癥和作為抗癌輔助藥?；蚺c黃芪多糖、當歸多糖或G-CSF組合，以起到協(xié)同增效的作用。
權利要求
1.一種從寧夏枸杞子(Lycium barbarum L.)中提取、分離、純化得到的阿拉伯半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan proteins)，簡稱枸杞AGPs。
2.權利要求1所述的枸杞AGPs的重均分子量為30,000-100,000道爾頓。
3.權利要求1和2所述的枸杞AGPs，其特征在于具備高等植物AGPs的化學特點1.多糖蛋白＝80-95％5-20％。2.糖組成特點主要含有阿拉伯糖(Ara)和半乳糖(Gal)，兩者的摩爾百分比之和＞50％。3.糖鏈Ara主要為5-、2，5-和3，5-連接。Gal主要為6-和3，6-連接。4.氨基酸(AA)組成特點羥脯氨酸(Hyp)15-20％，絲氨酸(Ser)10-20％，蘇氨酸(Thr)5-10％，谷氨酸(Glu)5-10％，甘氨酸(Gly)5-10％，天冬氨酸(Asp)5-10％，丙氨酸(Ala)5-10％。5.重均分子量30,000-100,000道爾頓。6.溶解性溶于水。
4.權利要求1至3所述的枸杞AGPs，含量＞80％。
5.權利要求1至4所述的枸杞AGPs的提取、分離、純化方法，其特征在于包括以下步驟枸杞子水提，30-45％乙醇沉淀，收集上清液，用截留分子量為10K的超濾膜超濾，保留液經(jīng)過陽離子交換柱和陰離子交換柱，用pH5-6、30-50mM的緩沖液洗脫，收集流出液，流出液經(jīng)過截留分子量為5K的超濾膜超濾，超濾后所得保留液經(jīng)70％的乙醇沉淀兩次，所得沉淀物即為所述的枸杞AGPs。
6.權利要求5所述的方法，其特征在于在制備過程中所用的離子交換樹脂為SP Sepharose和DEAE Sepharose離子交換樹脂。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的方法，其特征在于在經(jīng)過2次70％醇沉過程制備得到枸杞AGPs沉淀后，加水將沉淀溶解，經(jīng)噴霧或冷凍干燥得到精制的枸杞AGPs。
8.含有根據(jù)權利要求1-7中任一權利要求所述的枸杞AGPs注射劑，是由所述的枸杞AGPs加入一種或多種藥學可以接受的輔料制成，每個注射劑量單位中至少含枸杞AGPs 30mg。
9.根據(jù)權利要求1-7中任一權利要求所述的枸杞AGPs在制備治療中性粒細胞減少癥、貧血、血小板減少癥的藥物和制備抗癌輔助藥物中的用途。
10.根據(jù)權利要求9所述的用途，其特征在于所述的抗癌輔助藥物為放、化療輔助用藥。
11.一種組合物，其中含有根據(jù)權利要求1-4所述的枸杞AGPs，及選自黃芪多糖、當歸多糖中的任意一種，枸杞AGPs與所述植物多糖的重量配比為1∶0.5-2。
12.一種組合物，其中含有根據(jù)權利要求1-4所述的枸杞AGPs及G-CSF，枸杞AGPs與G-CSF的重量配比為1∶0.000010-0.000030。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從寧夏枸杞子(Lycium barbarumL.)中提取、分離、純化得到的重均分子量在30,000－100,000道爾頓之間的阿拉伯半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan proteins.AGPs)，簡稱枸杞AGPs。含量＞80％。取適量的枸杞AGPs，加入一種或多種藥學上可以接受的輔劑，制成注射劑。每個注射劑量單位至少含30mg本發(fā)明物質。用于治療中性粒細胞減少癥、貧血、血小板減少癥和作為抗癌的輔助劑?？梢允菃为氂盟?，也可與其它多糖或G－CSF等聯(lián)合用藥。
文檔編號C07K14/415GK1676530SQ20041002981
公開日2005年10月5日 申請日期2004年3月29日 優(yōu)先權日2004年3月29日
發(fā)明者張玉杰 申請人:張玉杰