巴泰病毒實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及病毒檢測(cè)領(lǐng)域，具體設(shè)及己泰病毒實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR檢測(cè)方法及 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 己泰病毒度ataivirus,BATV)是布尼亞病毒科度nuyavirus)布尼亞病毒屬 的rthobunyavirus)布尼亞姆韋拉度unyamwera)血清組的成員，主要分布于亞洲和歐洲， W庫(kù)蚊和按蚊為主要傳播媒介，具有廣泛的動(dòng)物宿主，感染后可引起人類發(fā)熱和病毒性腦 炎癥狀。己泰病毒于1955年首先分離自馬來(lái)西亞的庫(kù)蚊，隨后陸續(xù)在歐亞的多個(gè)國(guó)家和地 區(qū)的多種昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物中也分離到該病毒，并在人、馬、牛等家畜血清中檢測(cè)到該病毒抗 體。我國(guó)于1998年首次從云南省的菲律賓按蚊種分離到一株己泰病毒，且該病毒在當(dāng)?shù)匕l(fā) 熱病人中的抗體陽(yáng)性率為4. 17%。
[0003] 目前，對(duì)BATV的檢測(cè)主要采用病毒分離和病毒核酸的普通PCR檢測(cè)。病毒分離耗 時(shí)且對(duì)標(biāo)本質(zhì)量要求高，普通PCR快捷特異，但易造成污染且檢測(cè)敏感性低。
[0004] 本發(fā)明所建立的針對(duì)BATV的檢測(cè)方法是基于RNA為模板的一步法化qman Real-timePCR，是一種利用反應(yīng)體系中實(shí)時(shí)巧光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化，最終通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未 知模板進(jìn)行定量分析的方法。可直接用于多種被檢標(biāo)本提取RNA后的直接檢測(cè)，不僅縮短 了檢測(cè)時(shí)間、實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的定量、具有更高的靈敏度和特異性，且自動(dòng)化程度高、低污染， 更避免了病毒分離培養(yǎng)中因細(xì)胞傳代老化敏感性下降和因病毒的無(wú)CPE增殖現(xiàn)象所產(chǎn)生 的實(shí)驗(yàn)誤差。為今后進(jìn)一步開(kāi)展BATV的分布監(jiān)測(cè)、臨床診斷及其相關(guān)研究提供了快速便捷 的技術(shù)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]根據(jù)本發(fā)明的己泰病毒實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR檢測(cè)用引物對(duì)，包括：
[0006] 己泰病毒上游引物：BATV-F-NS:5' -TCTCGCAAAAAGAAGTGAATGG-3' ；
[0007]下游引物：BATV-R-NS:5'-TGGCAAGGAATCCACTGAGTCT-3，。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的己泰病毒實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR檢測(cè)用探針，其序列如SEQIDNo. 3 所示：
[0009] haMan探針：BATV-Probe-NS:FAM 5,-CCAGTTCCAGACGATGGTCTTACCCTCC-3,（沈Q IDNo. 3)TAMRA，其5'端標(biāo)記FAM巧光報(bào)告基團(tuán)、3'端標(biāo)記TAMRA巧光澤滅基團(tuán)。
[0010] 本發(fā)明所提供的引物和化qMan探針，是根據(jù)己泰病毒S片段最為保守的保守區(qū)域 設(shè)計(jì)的，既可用于檢測(cè)己泰病毒，也可用于定量檢測(cè)樣本中己泰病毒的核酸拷貝數(shù)。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的己泰病毒實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR檢測(cè)方法包括使用W下引物、探針 對(duì)待檢測(cè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟，
[0012] 己泰病毒上游引物：BATV-F-NS:5' -TCTCGCAAAAAGAAGTGAATGG-3' ；
[0013] 下游引物：BATV-R-NS:5' -TGGCAAGGAATCCACTGAGTCT-3，，
[0014]haMan探針：BATV-Probe-NS:FAM5,-CCAGTTCCAGACGATGGTCTTACCCTCC-3,（沈Q IDNo. 3)TAMRA，其5'端標(biāo)記FAM巧光報(bào)告基團(tuán)、3'端標(biāo)記TAMRA巧光澤滅基團(tuán)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的己泰病毒實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括：
[0016] 己泰病毒上游引物：BATV-F-NS:5' -TCTCGCAAAAAGAAGTGAATGG-3' ；
[0017] 下游引物：BATV-R-NS:5' -TGGCAAGGAATCCACTGAGTCT-3，， 陽(yáng)0化]haMan探針：BATV-Probe-NS:FAM5,-CCAGTTCCAGACGATGGTCTTACCCTCC-3,（沈Q IDNo. 3)TAMRA，其5'端標(biāo)記FAM巧光報(bào)告基團(tuán)、3'端標(biāo)記TAMRA巧光澤滅基團(tuán)。
[0019] 己泰病毒25uL實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)體系，包括：2XReaction Mixl2. 5yL、EnzymeMixlyUlOyM上下游引物與 5yM探針各lyURNA模板lyL、 Nuclease-freewater7.SuL。
[0020] 己泰病毒實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)體系的最佳擴(kuò)增條件為：先45°ClOmin; 然后95°ClOmin;最后95°C15s和60°C60s40個(gè)循環(huán)。所述己泰病毒實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR 檢測(cè)反應(yīng)體系適用于所有巧光定量PCR反應(yīng)儀。
[0021] 本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0022] 1、首次建立了己泰病毒實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)方法可W直接用于 任何標(biāo)本提取核酸后的己泰病毒定量檢測(cè)。 陽(yáng)023] 2、本發(fā)明與其他己泰病毒檢測(cè)方法相比，靈敏度更高，操作更加簡(jiǎn)便且可有效防 止污染，檢測(cè)結(jié)果更加直觀準(zhǔn)確，使檢測(cè)效率得到很大提高。
[0024] 3、本檢測(cè)方法不僅能夠快速評(píng)價(jià)標(biāo)本中己泰病毒的感染狀況，同時(shí)也為該病毒在 與疾病關(guān)系方面的進(jìn)一步研究提供了有效工具。
[0025] 綜上所述，本發(fā)明的目的就是利用化qMan Real-time PCR技術(shù)建立了專口針對(duì)己 泰病毒的特異、快捷，更加敏感、有效的分子檢測(cè)方法。通過(guò)序列比對(duì)挑選出己泰病毒基因 組中S片段上高度保守的序列，在此序列上設(shè)計(jì)一對(duì)引物及一條化qMan探針，建立實(shí)時(shí)巧 光定量RT-PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行體系的特異性與穩(wěn)定性驗(yàn)證。本發(fā)明方法為今后進(jìn)一步開(kāi)展 BATV的分布監(jiān)測(cè)、臨床診斷及其相關(guān)研究提供了快速便捷的技術(shù)手段，從而更好地了解該 病毒。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為對(duì)己泰病毒的特異性檢測(cè)的擴(kuò)增曲線；
[0027]圖2為己泰病毒實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR檢測(cè)靈敏度的病毒基因拷貝數(shù)定量分析標(biāo) 準(zhǔn)曲線；
[0028] 圖3顯示己泰病毒實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR檢測(cè)靈敏度定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】 陽(yáng)〇29] 實(shí)施例1 W30] 本發(fā)明所建立的針對(duì)己泰的檢測(cè)方法是基于RNA為模板的一步法化qman Real-timePCR，是一種利用反應(yīng)體系中實(shí)時(shí)巧光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化，最終通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未 知模板進(jìn)行定量分析的方法。可直接用于多種被檢標(biāo)本提取RNA后的直接檢測(cè)。本發(fā)明還 設(shè)及上述檢測(cè)方法建立所包含的所有內(nèi)容。
[0031] 該方法具體步驟為：
[0032] (1)引物與探針的設(shè)計(jì) 陽(yáng)03引化qMan PCR引物、探針序列信息見(jiàn)表1。
[0034] 表1 BATV檢測(cè)體系特異引物與探針序列信息
[0035]
[0036] 似巧光素的選擇
[0037] 巧光發(fā)射基團(tuán)選用較為常用的FAM基團(tuán)，巧光澤滅基團(tuán)選用TAMRA基團(tuán)。 陽(yáng)〇3引（3)引物與探針的合成
[0039]引物由北京梓熙生物科技有限公司合成，探針由上海生工生物工程有限公司合成 并標(biāo)記，探針5'端標(biāo)記FAM巧光報(bào)告基團(tuán)、3'端標(biāo)記TAMRA巧光澤滅基團(tuán)。
[0040] (4)樣品