轉(zhuǎn)入預(yù)分化培養(yǎng)基中，28。暗培養(yǎng)7天，之后光照 培養(yǎng)7天。
[0148] 12)挑取從同一愈傷來的顏色鮮黃的抗性愈傷，移入裝有分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿或 塑料廣口瓶中，放入恒溫培養(yǎng)室中，等待分化成苗（15-30天），待苗長(zhǎng)至Icm左右，放入生根 培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基）中壯苗。
[0149] 13)將苗根部和莖葉分化得較完好的挑出，加入適量蒸饋水或無菌水，煉苗3天至 一周左右，然后洗去瓊脂，移栽到溫室的±鉢中生長(zhǎng)，獲得水稻大斑基因L0C_0sl2gl6720 的CRISPR祀向編輯的群體。 陽150]實(shí)施例3 陽15U上述水稻大斑基因L0C_0sl2gl6720的CRISPR祀向編輯的群體為待測(cè)植株，未經(jīng) 編輯的水稻植株為對(duì)照植株。對(duì)待測(cè)植株進(jìn)行檢測(cè)和篩選的步驟如下： 陽1W] 1、水稻基因組DNA的提取 陽153] (1)將水稻葉片剪碎后置于2. OmL離屯、管中，同時(shí)放入一粒鋼珠，用組織娠磨儀磨 碎； 陽154] 0)加入800 y L CTAB提取緩沖液燈ris-HCl，100mM，pH8. 0 ;EDTA，20mM，pH8. 0 ; NaCl，500ml ;CTAB，2 % )，65°C水浴40min，期間搖動(dòng)3-4次；
[0155] (3)加入等體積的氯仿-異戊醇混合液（其中氯仿與異戊醇的體積比為24 :1)，上 下顛倒混勻，lOOOOr/min離屯、IOmin; 陽156] (4)轉(zhuǎn)移上清至新的1. 5mL離屯、管中，加入等體積-20°C預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒 混勻，置-20°C下沉淀 30min，lOOOOr/min離屯、IOmin; 陽157] (5)棄上清液，70%乙醇洗涂1次，10000巧m離屯、IOmin ;
[0158] (6)棄上清液，無水乙醇洗涂1次，自然風(fēng)干，溶于適量（100~200yL)TE緩沖溶 液中，-20°C保存。 陽159] 2、針對(duì)L0C_0sl2gl6720基因的祀位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR引物對(duì)（L0C_0sl2gl6720基因的 核巧酸序列如SEQNO. 8所示，第764~785位為編輯祀位點(diǎn)），進(jìn)行PCR擴(kuò)增：
[0160]PCR引物對(duì)： 陽16U 上游引物T2F:5' -CGGTGGTGATCTCCAAGCC-3'；（SEQIDN0:11) 陽16引下游引物T2R:5' -GGGAAGAAGTCGCCGATGGT-3'；（沈QIDN0:12) 陽163] 由上海生工生物工程有限公司合成。
[0164]PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下： 陽1化]ThqiO. 2yL;2XGCbuffer，5yL;2. 5mixdNTP1.6yL;10yM的上游引物T2F， 0. 2yL;10yM的下游引物T2R，0. 2yL;10XEvaGreen(巧光染料），1yL;50ng/yL的 DM,IyL;無菌水I. 3yL;礦物油 10-20yL。 陽166]PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共 40個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。
[0167] 3、對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率烙解曲線（HRM)分析，鑒別水稻植株是否被成功 編輯：
[0168] PCR結(jié)束后，打開HRM分析的軟件，運(yùn)行HRM檢測(cè)的系統(tǒng)，待機(jī)器的溫度升到45°C 后，將樣品PCR板放入Li曲tScanner儀器中，每秒上升0.rC，直至溫度升到98°C，停止反 應(yīng)。在升溫的過程中，機(jī)器記錄反應(yīng)中樣品的巧光釋放量，形成高分辨率烙解曲線圖。每一 個(gè)樣品對(duì)應(yīng)一條HRM烙解曲線，W對(duì)照植株（野生型）所對(duì)應(yīng)的高分辨率烙解曲線為基準(zhǔn) 線（記為水平的直線），比較待測(cè)植株所對(duì)應(yīng)的高分辨率烙解曲線與對(duì)照植株所對(duì)應(yīng)的高 分辨率烙解曲線的最大巧光差異AF，若IAF|<0. 05,視為待測(cè)植株與對(duì)照植株的結(jié)果相 同，判定該待測(cè)植株未成功進(jìn)行編輯；若IAFl>0.05,視為待測(cè)植株與對(duì)照植株的結(jié)果 不同，判定該待測(cè)植株編輯成功。
[0169] 4、篩選結(jié)果的驗(yàn)證：
[0170] 根據(jù)HRM分析的結(jié)果，對(duì)待測(cè)植株樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)：在本實(shí)施例檢測(cè) 的植株樣本中，HRM分析的結(jié)果與測(cè)序驗(yàn)證的結(jié)果完全一致，沒有假陽性的情況出現(xiàn)，可見 HRM分析的準(zhǔn)確率非常高。 陽171] 經(jīng)由測(cè)序驗(yàn)證的突變的待測(cè)植株樣本的高分辨率烙解曲線，如圖3a所示。圖3a 中，水平的直線為基準(zhǔn)線，是對(duì)照植株（野生型）所對(duì)應(yīng)的高分辨率烙解曲線，其它曲線均 為各個(gè)突變的待測(cè)植株樣品的高分辨率烙解曲線，一條曲線對(duì)應(yīng)一個(gè)樣品，可W看出圖3a 中的曲線的峰值（與對(duì)照的最大差異，IAF|)均大于或等于0.05,說明運(yùn)些樣品都與對(duì)照 植株有差異，所W運(yùn)些樣品為CRISPR成功編輯的樣品；而圖3b所示為野生型的待測(cè)植株樣 本的高分辨率烙解曲線，在圖3b中的曲線與對(duì)照植株不能區(qū)分（IAFI小于0. 05)，說明運(yùn) 些樣品是未成功編輯的樣品。換言之，W上CRISIS成功編輯的突變的待測(cè)植株樣本均能與 未經(jīng)編輯的對(duì)照植株明顯區(qū)分開來，而野生型的待測(cè)植株不能與未經(jīng)編輯的對(duì)照植株明顯 區(qū)分開來。 陽17引因此，采用實(shí)施例3的方法可W將水稻大斑基因L0C_0sl2gl6720的CRISPR祀向 編輯的群體中的CRISPR祀向編輯產(chǎn)生的突變待測(cè)植株與未成功編輯的野生型待測(cè)植株明 確區(qū)分開來。 陽173] 由此可見，本發(fā)明的目的已經(jīng)完整并有效的予W實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的方法W及原理已 在實(shí)施例中予W展示和說明，在不背離所述原理的情況下，實(shí)施方式可作任意修改。所W， 本發(fā)明包括了基于權(quán)利要求精神及權(quán)利要求范圍的所有變形實(shí)施方式。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于篩選水稻靶向基因編輯植株的方法，其特征在于，包括： (1) 以未經(jīng)編輯的水稻植株為對(duì)照植株，以經(jīng)靶向基因編輯獲得的水稻植株為待測(cè)植 株，分別提取待測(cè)植株的基因組DNA和對(duì)照植株的基因組DNA ; (2) 根據(jù)與所述靶向基因編輯的靶位點(diǎn)相鄰的基因組序列來設(shè)計(jì)特異性引物，以所提 取的基因組DNA為DNA模板，加入所述特異性引物和熒光染料，PCR擴(kuò)增所提取的基因組 DNA中包含編輯位點(diǎn)的DNA片段，所述DNA片段長(zhǎng)度為200~500bp ; (3) PCR擴(kuò)增完畢后直接進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，以對(duì)照植株所對(duì)應(yīng)的高分辨率熔 解曲線為基準(zhǔn)線，比較待測(cè)植株所對(duì)應(yīng)的高分辨率熔解曲線與對(duì)照植株所對(duì)應(yīng)的高分辨率 熔解曲線的最大熒光差異AF，若I AF|〈0. 05,視為待測(cè)植株與對(duì)照植株的結(jié)果相同，判定 該待測(cè)植株未成功進(jìn)行編輯；若I AF|多0.05,視為待測(cè)植株與對(duì)照植株的結(jié)果不同，判 定該待測(cè)植株編輯成功。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向基因編輯是CRISPR/Cas編輯。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的靶向基因編輯是對(duì)水稻LOC_ 0803855240基因的〇?15?1?靶向編輯，所述水稻11)(：_0803855240基因的序列如5￡0 10勵(lì)：1 所示，其中第453~471位為編輯位點(diǎn)；此時(shí)，所述特異性引物的序列如下： 上游引物 BlF :5' -GCACCGCGTCGGCCTCATGT-3' ； 下游引物 B1R:5' -CCTGCTTAAACTCCTGGGCTTCCAC-3' ； 或者， 上游引物 B2F :5' -TCACCGAGCACGACGTGACCTT-3' ； 下游引物 B2R :5' -CACGCTGAGGGAGACCTCGAACA-3'。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：rTaq， 0? 2 y L ;2XGC buffer，5 y L ;2. 5mix dNTP，I. 6 y L ;10 yM 的上游引物，0? 2 y L ;10 yM 的 下游引物，〇? 2yL ;10XEva Green，l yL ;50ng/yL 的 DNA，1 yL ;無菌水 I. 3yL ;礦物油 10_20 y- L05. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，55-65°C退火 30s，72°C延伸 30s，共 40 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min。6. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的靶向基因編輯是對(duì)水稻大斑基因 L0C_0sl2gl6720的CRISPR靶向編輯，所述水稻大斑基因L0C_0sl2gl6720的序列如SEQ ID NO: 8所示，其中第764~785位為編輯位點(diǎn)；此時(shí)，所述特異性引物的序列如下： 上游引物 T2F: 5 ' -CGGTGGTGATCTCCAAGCC-3 ' ； 下游引物 T2R: 5 ' -GGGAAGAAGTCGCCGATGGT-3 '。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：rTaq， 0? 2 y L ;2XGC buffer，5 y L ;2. 5mix dNTP，I. 6 y L ;10 yM 的上游引物，0? 2 y L ;10 yM 的 下游引物，〇? 2yL ;10XEva Green，l yL ;50ng/yL 的 DNA，1 yL ;無菌水 I. 3yL ;礦物油 10_20 y- L08. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 30s，共 40 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min。9. 如權(quán)利要求1~8任一所述的方法，其特征在于，所述DNA模板為直接提取的單株待 測(cè)植株DNA，或者，所述DNA模板是摩爾比為1:1的待測(cè)植株的基因組DNA和對(duì)照植株的基 因組DNA的混合。10.如權(quán)利要求1~8任一所述的方法，其特征在于，所述DNA片段為200~400bp。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于篩選水稻靶向基因編輯植株的方法，包括：提取待測(cè)水稻植株和對(duì)照水稻植株的基因組DNA，加入特異性引物和熒光染料，PCR擴(kuò)增所提取的基因組DNA中包含編輯位點(diǎn)的DNA片段，然后進(jìn)行HRM分析，以對(duì)照植株所對(duì)應(yīng)的高分辨率熔解曲線為基準(zhǔn)線，比較待測(cè)植株與對(duì)照植株對(duì)應(yīng)的高分辨率熔解曲線的最大熒光差異△F，若|△F|<0.05，判定該待測(cè)植株未成功進(jìn)行編輯；若|△F|≥0.05，判定該待測(cè)植株編輯成功。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便快速、有效、結(jié)果準(zhǔn)確、高通量、使用成本低。利用本發(fā)明的方法輔助育種，能大大提高植株篩選效率。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105154566
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510662736
【發(fā)明人】李珊, 舒慶堯
【申請(qǐng)人】無錫哈勃生物種業(yè)技術(shù)研究院有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年10月14日