lt;0. 05,視為待測植株與對照植株的結(jié)果相 同，判定該待測植株未成功進(jìn)行編輯；若IAFl>0.05,視為待測植株與對照植株的結(jié)果 不同，判定該待測植株編輯成功。
[0097] 4、篩選結(jié)果的驗證：
[0098] 根據(jù)HRM分析的結(jié)果，對待測植株樣本進(jìn)行測序驗證，驗證發(fā)現(xiàn)：在本實施例檢測 的植株樣本中，HRM分析的結(jié)果與測序驗證的結(jié)果完全一致，沒有假陽性的情況出現(xiàn)，可見 HRM分析的準(zhǔn)確率非常高；編輯成功的待測植株樣本中，有不同比例的單株出現(xiàn)不同狀態(tài) 的突變，包括：嵌合體、雜合型、雙等位基因突變、純合型。
[0099] 經(jīng)由測序驗證為雙等位突變的待測植株樣本、嵌合體的待測植株樣本、純合突變 的待測植株樣本、雜合突變的待測植株樣本的高分辨率烙解曲線，分別如圖Ia-Id所示。圖 Ia-Id中，水平的直線為基準(zhǔn)線，是對照植株（野生型）所對應(yīng)的高分辨率烙解曲線，其它曲 線均為各個樣品的高分辨率烙解曲線，一條曲線對應(yīng)一個樣品，可W看出Ia-Id中的曲線 的峰值（與對照的最大差異，IAFl)均大于或等于0.05,說明運些樣品都與對照植株有差 異，所W運些樣品為CRISPR成功編輯的樣品；而圖Ie所示為野生型待測植株樣本的高分辨 率烙解曲線，在圖Ie中的曲線與對照植株不能區(qū)分（IAFl小于0.05)，說明運些樣品是未 成功編輯的樣品。換言之，W上CRISIS成功編輯的各種類型突變的待測植株樣本均能與未 經(jīng)編輯的對照植株明顯區(qū)分開來，而CRISPR編輯未成功的野生型待測植株樣本不能與未 經(jīng)編輯的對照植株明顯區(qū)分開來。
[0100] 因此，采用實施例1的方法可W將水稻L0C_0s03巧5240基因的CRISPR祀向編輯 的群體中的CRISPR祀向編輯產(chǎn)生的各種突變類型的待測植株與未成功編輯的野生型待測 植株明確區(qū)分開來。CRISPR祀向編輯產(chǎn)生的突變類型有雙等位突變、嵌合體、純合突變和雜 合突變。結(jié)果表明CRISPR祀向編輯產(chǎn)生的各種類型均可W區(qū)分開，而未成功編輯的植株則 與野生型一致。 陽101] 實施例2 陽102] 采用與實施例1基本相同的方法，對待測植株進(jìn)行檢測和篩選，其區(qū)別僅在于PCR 擴(kuò)增步驟有所不同，具體如下： 陽10引本實施例中所采用的PCR引物對如下： 陽104]上游引物B2F:5' -TCACCGAGCACGACGTGACCTT-3' ；（SEQ IDN0:6) 陽105]下游引物B2R:5' -CACGCTGAGGGAGACCTCGAACA-3' ；（SEQ IDN0:7) 陽106] 由上海生工生物工程有限公司合成。 陽107] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系女曰下Jhq, 0. 2 Ji L ;2 XGC buffer, 5 Ji L ;2. 5mix dNTPl.6yL ;10yM的上游弓I物B2F，0. 2yL ;10yM的下游弓I物B2R，0. 2yL ;10XEva Green (巧光染料），I y L ;50ng/ y L的DM, I y L;無菌水I. 3 y L;礦物油10-20 y L。
[0108] PCR反應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共 40個循環(huán)；72°C延伸7min。
[0109] 同樣，根據(jù)HRM分析的結(jié)果，對待測植株樣本進(jìn)行測序驗證，驗證同樣發(fā)現(xiàn)：HRM分 析的結(jié)果與測序驗證的結(jié)果完全一致，沒有假陽性的情況出現(xiàn)。
[0110] 經(jīng)由測序驗證為雙等位突變的待測植株樣本、嵌合體的待測植株樣本、純合突變 的待測植株樣本、雜合突變的待測植株樣本、W及野生型待測植株樣本的高分辨率烙解曲 線，分別如圖2a-2e所示。 陽111] 圖2a-2d中，水平的直線為基準(zhǔn)線，是對照植株（野生型）所對應(yīng)的高分辨率烙 解曲線，其它曲線均為各個樣品的高分辨率烙解曲線，一條曲線對應(yīng)一個樣品，可W看出：2a-2d中的曲線的峰值（與對照的最大差異，IAFl)均大于或等于0.05,說明運些樣品都 與對照植株有差異，所W運些樣品為CRISPR成功編輯的樣品；而圖2e所示為野生型待測植 株樣本的高分辨率烙解曲線，在圖2e中的曲線與對照植株不能區(qū)分（IA FI小于0.05)，說 明運些樣品是未成功編輯的樣品。換言之，W上CRISIS成功編輯的各種類型突變的待測植 株樣本均能與未經(jīng)編輯的對照植株明顯區(qū)分開來，而CRISPR編輯未成功的野生型待測植 株不能與未經(jīng)編輯的對照植株明顯區(qū)分開來。 陽11引 因此，采用實施例2的方法可W將水稻L0C_0s03巧5240基因的CRISPR祀向編輯 的群體中的CRISPR祀向編輯產(chǎn)生的各種突變類型的待測植株與未成功編輯的野生型待測 植株明確區(qū)分開來。CRISPR祀向編輯產(chǎn)生的突變類型有雙等位突變、嵌合體、純合突變和雜 合突變。結(jié)果表明CRISPR祀向編輯產(chǎn)生的各種類型均可W區(qū)分開，而未成功編輯的植株則 與野生型一致。
[0113] 水稻大斑基因L0C_0sl2gl6720的CRISPR祀向編輯群體的獲得：
[0114] 采用現(xiàn)有技術(shù)可W獲得水稻大斑基因L0C_0sl2gl6720的CRISPR祀向編輯群體， 良P:根據(jù)水稻大斑基因L0C_0sl2gl6720的DNA序列信息設(shè)計CRISPR引物，構(gòu)建CRISPR 載體，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌侵染水稻的愈傷組織，愈傷組織分化長成植株，即得到一批 CRISPR的祀向編輯群體。
[0115] 本發(fā)明實施例中水稻大斑基因L0C_0sl2gl6720的CRISPR祀向編輯群體（水稻大 斑基因L0C_0sl2gl6720的核巧酸序列如SEQIDN0:8所示，第764~785位為編輯祀位 點）可W通過現(xiàn)有技術(shù)的各種方法獲得，W下給出一個具體實例進(jìn)行說明：
[0116] 1、根據(jù)L0C_0sl2gl6720基因的DNA序列設(shè)計兩條單鏈OligO序列DNA化ttp:// e-crisp-test.化fz.de/E-CRISP/desi即crispr.html)，其核巧酸序列如下所示：
[0117] OligOF2:5' -GGCACCGCACCTGCTCTCCGGCCAGT-3'(沈QIDN0:9) 陽1化]OligOR2:5,-AAACACTGGCCGGAGAGCAGGTGCGG-3'（沈QIDN0:10)
[0119] 按照W下步驟退火形成雙鏈DM。 陽 120]反應(yīng)體系：DNAOligOF2(IOOyM)，10yl;DNAOligOR2(IOOyM)，10yl;10XBuffer,20yI;無菌水，60yI。 陽121] 反應(yīng)程序：95°C變性2分鐘，每8秒降低0.rC直到降到4°C。 陽122] 2、切開環(huán)狀的載體
[0123] 反應(yīng)體系：pPksgRNA質(zhì)粒載體（購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司）， 30Ji1 (200ng/Ji1，大約6Jig) !IOXbuffer, 5Ji1;BsaI酶，2Ji1 ;無菌水：13Ji1。 陽124] 37°C過夜解育8小時。 陽125] 回收切開的質(zhì)粒載體，濃度調(diào)至50ng/y1。 陽126] 3、連接 陽127]反應(yīng)體系：切開的pPksgRNA質(zhì)粒載體，1Ji1 (約50ng/Ji1);退火后的Oligo DNA，1y1 ;T4 連接酶，1y1 ; 10XT4 酶Buffer, 1y1 ;無菌水，6y1。 陽12引 4°C解育2小時，然后放至16°C過夜。
[0129] 4、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
[0130] 將上述連接產(chǎn)物10y1加入感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰上放置20分鐘；42°C熱激90秒 后立即放入冰中放置10分鐘；加入Iml的SOC液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)1小時；500化pm離 屯、2min;棄去上清；懸浮菌體，涂在固體LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜直到菌落長出。 陽131] 5、挑選陽性克隆
[0132] 挑取上述長出的菌落，放入LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12小時，用質(zhì)粒提取試劑盒 (AxyPr巧TM Plasmid Miniprep Kit 25〇-Prep，購自Axygen公司）提取質(zhì)粒。 陽133] 6、對上述提取的質(zhì)粒進(jìn)行測序驗證。
[0134] 7、將測序驗證成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。 陽13引取1yg左右的質(zhì)粒DNA加入到200y1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后，冰浴30min; 在37 °C水浴5min或42 °C水浴Imin，液氮中5min，可重復(fù)1-2次；接著冰浴2min，加入 800y1Y邸液體培養(yǎng)基，28 °C、17虹pm搖培3小時后，涂在含50yg/ml卡那霉素的YEB平 板上；28°C培養(yǎng)到形成單菌落。
[0136] 8、由農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)入水稻植株
[0137] 1)水稻種子消毒后，將種子轉(zhuǎn)移到成熟胚（NBD/N6D)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28°C暗培養(yǎng) 7-10天；用綴子挑取自然分裂的胚性愈傷組織置入繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)1-2次，每次2 周，暗培養(yǎng)；1-2次繼代培養(yǎng)后，挑取愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)4-7天后用于遺傳轉(zhuǎn)化。
[0138] 2)挑取上述驗證成功的農(nóng)桿菌單克隆于4mlYEP(含SOmg^Kan和30mg^化〇 培養(yǎng)液中，28 °C，250巧m振蕩過夜培養(yǎng)。
[0139] 3)從含有農(nóng)桿菌的YEP培養(yǎng)液中吸取l-2ml，轉(zhuǎn)入25-50mlAB巧if30+Kan50+As 100ymol/1)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28°C，250巧m，4小時左右0D600 = 0. 4-0.6。
[0140] 4)取培養(yǎng)好的菌液于離屯、管中，AOOOrmp,離屯、8min，棄上清。用含100jimol/1As 的等體積AAM感菌液制成懸浮液，使菌液0D600的終濃度為0. 4-0.6。 陽141] 5)取出繼代培養(yǎng)4-7天的愈傷組織，放入農(nóng)桿菌懸浮液侵染30分鐘，期間不停搖 晃，也可在搖床上10化pm，振蕩培養(yǎng)30min。
[0142] 6)將愈傷組織置于墊有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)基上，每皿加入Iml AAM培養(yǎng)液濕 潤濾紙，28°C暗培養(yǎng)3天。
[0143] 7)將愈傷組織取出，用0.IM甘露醇清洗5-6次，其間需不停的振蕩。再用含 SOOmg^頭抱拉定（或頭抱嚷目虧鋼）的無菌水清洗5-6遍。最后置于無菌濾紙上漸干30min。
[0144] 8)將驚干的愈傷轉(zhuǎn)入含500mg/l簇節(jié)青霉素和25-30mg/l潮霉素的選擇培養(yǎng)基上 進(jìn)行第一輪選擇，28°C，暗培養(yǎng)14天。 陽145] 9)將長有抗性愈傷的初始愈傷轉(zhuǎn)到含500mg/l簇節(jié)青霉素和50mg/l潮霉素的培 養(yǎng)基上進(jìn)行第二輪選擇，28°C，暗培養(yǎng)，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出。
[0146] 10)最后在SOOmg^頭抱拉定（或頭抱嚷朽鋼）和70mg^潮霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行 第=輪篩選。 陽147] 11)將新長出的抗性愈傷組織