一種用膠體金層析技術(shù)進行多重核酸檢測的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明設及醫(yī)學生物技術(shù)，特別設及一種用膠體金層析技術(shù)進行多重核酸檢測的 方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸檢測技術(shù)是檢測病原體核酸（DNA和RNA)的一系列技術(shù)的總稱。比起常規(guī)的 血清學檢測，核酸檢測是直接檢測病原體的脫氧核糖核酸或核糖核酸，具有特異性強、靈敏 度高等特點，可W大幅提高病原體檢出率、縮短檢測窗口期，是對免疫學檢測方法的重要補 充。
[0003] 現(xiàn)在的核酸檢測技術(shù)有很多，大多是基于PCR技術(shù)發(fā)展起來的，如最常見 的是巧光定量PCR(RealtimefluorescencequantitativePCR，RTFQPCR)技 術(shù)。也有一些恒溫的擴增技術(shù)應用到核酸檢測領域，如，依賴核酸序列的擴增技術(shù) (NucleicAcidSequence-basedAmplification,NASBA)，滾環(huán)擴增技術(shù)（Rolling CircleAmplification,RCA)，環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP),轉(zhuǎn)錄介導的擴增技術(shù)（TranscriptionMediatedAmplifi -cation,TMA)等。無論是巧光定量PCR還是等溫擴增技術(shù)，在定性檢測核酸時都要借助高 端、昂貴的儀器設備，而且很難實現(xiàn)病原體的多重檢測。因此，一種操作簡單、快速、價格低 廉，可實現(xiàn)多重核酸檢測的方法仍是值得探索和研究的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種多重核酸檢測的膠體金標檢測試 劑盒，包括： (1) 、膠體金試紙條：所用試紙條被固定于PVC底板上，從左往右依次是樣品墊、玻璃纖 維素膜、NC膜、吸水紙；NC膜上有T線(檢測線）和C線(質(zhì)控線)，所述檢測線處包被一段核 酸序列，該序列能特異性雜交結(jié)合相應的特異探針B系列，檢測線有一條或一條W上；所述 C線處包被另一段核酸序列，該序列能特異性雜交結(jié)合特異探針A系列；通用探針5'端琉 基化修飾，也可進行其他化學基團修飾，如-N&，然后標記膠體金顆粒，且能與特異探針A系 列互補配對雜交，將標記膠體金后的通用探針固定于試紙條的玻璃纖維素膜上； (2) 、分別盛有特異探針A系列、特異探針B系列的探針管：特異探針A系列包括=個部 分，其一端可與通用探針雜交，中間能與待測核酸雜交，另一端可W與包被在NC膜上C線處 的核酸雜交，對應于一種待測核酸的特異探針A系列可W有多種，如AUA2……，分別和待 測核酸的不同區(qū)域互補配對雜交，裝在不同的探針管里；特異探針B系列包括兩部分，其一 端可與待測核酸雜交，另一端可W與包被在NC膜上相應T線處的核酸雜交，對應于一種待 測核酸的特異探針B系列可W有多種，如B1、B2……，分別和待測核酸的不同區(qū)域互補配對 雜交，分別裝在不同的探針管里。
[0005]所述通用探針序列為：5' -SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGG CGTCCGTCTTTGAGGC-3'(SeqNo. 1)，其中甜為琉基，5'端為琉基修飾，也可進行其他的化學 基團修飾，如-畑2 (氨基）等。
[0006] 所述的核酸多重檢測的膠體金標檢測試劑盒可用于病原體核酸的多重檢測，所述 的病原體是寄生蟲、真菌、細菌、病毒、支原體W及衣原體。
[0007] 本發(fā)明提供一種核酸多重檢測的膠體金標快速檢測方法，將膠體金免疫層析技術(shù) 的操作簡單、快速、價格低廉等特點應用到核酸的多重檢測中來。包括如下步驟： (1)、設計探針：通用探針、針對每一種待測核酸的特異探針A系列和特異探針B系列， 其中，通用探針的5'端琉基化修飾后標記膠體金顆粒，且可W和特異探針A系列互補配對 雜交；特異探針A系列包括=個部分，其一端可與通用探針雜交，中間可W與待測核酸雜 交，另一端可W與包被在NC膜上C線處的核酸雜交，對應于一種待測核酸的特異探針A系 列可W有多種，如AUA2……，分別和待測核酸的不同區(qū)域互補配對雜交；特異探針B系列 包括兩部分，其一端可與待測核酸雜交，另一端可W與包被在NC膜上相應T線處的核酸雜 交，對應于一種待測核酸的特異探針B系列可W有多種，如B1、B2……，分別和待測核酸的 不同區(qū)域互補配對雜交。
[0008] (2)、制備膠體金試紙條：所述試紙條被固定于PVC底板上，從左往右依次是樣品 墊、玻璃纖維素膜、NC膜、吸水紙；NC膜上有T線(檢測線）和C線(質(zhì)控線）；所述檢測線處 包被一段核酸序列，該序列能特異性雜交結(jié)合針對一種待測核酸的特異探針B系列，檢測 線有一條或一條W上；所述C線處包被另一段核酸序列，該序列能特異性雜交結(jié)合特異探 針A系列；將標記膠體金后的通用探針置于試紙條的膠體金墊上，將特異探針A系列、特異 探針B系列和待測核酸特異擴增產(chǎn)物雜交后滴在樣品墊上層析，檢測線顯色表示有待測核 酸存在，質(zhì)控線顯色表示檢測有效。
[0009] 所述通用探針可用于檢測每個待檢核酸分子，在設計時必須注重GC%的比例，盡 量避免與金顆粒的非特異結(jié)合；通用探針還必須注意和其他探針結(jié)合部分的Tm值，盡量提 高在較低溫度條件下雜交的有效性，經(jīng)過實驗效果的比較，所公布的通用探針序列為最優(yōu) 設計序列。所述通用探針序列為： 5 ^-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3 ^(Seq No. 1)，其中甜為琉基，5'端為琉基修飾，也可進行其他的化學基團修飾，如-N& (氨基)等。
[0010] 結(jié)合工作原理，對本發(fā)明上述方法的工作過程介紹如下： 1、設計S種探針：通用探針、特異探針A(可W有多條，如AUA2......)、特異探針B (可W有多條，如B1、B2......)。其中，通用探針5'端琉基化修飾后標記膠體金顆粒，且可 W和特異探針A系列互補配對雜交；特異探針A系列包括=個部分，其一端可與通用探針雜 交，中間可W與待測核酸雜交，另一端可W與包被在NC膜上C線處的核酸雜交；特異探針B 系列包括兩部分，其一端可與待測核酸雜交，另一端可W與包被在NC膜上T線處的核酸雜 交。
[0011] 2、NC膜上"T線"（檢測線）處包被一段序列，該序列可W與特異探針B系列雜交， 捕獲特異探針B，形成T線；"C線"（質(zhì)控線）處包被另一序列，該序列可W與特異探針A雜 交，用來捕捉特異探針A和游離的金標通用探針雜交復合物，形成C線。
[0012] 3、通用探針標記膠體金顆粒后，可W和特異探針A系列雜交，形成金顆粒通用探 針一特異探針A復合物。
[0013] 4、當有待測核酸片段時，待測核酸可W和特異探針B系列雜交結(jié)合，形成待測核 酸一特異探針B復合物。
[0014] 5、將4中形成的待測核酸--特異探針B復合物與3中形成的金顆粒通用探 針一特異探針A復合物進行雜交結(jié)合，形成金顆粒通用探針一特異探針A-待測核 酸一特異探針B復合物。
[0015] 6、步驟5中得到的膠體金復合物在試紙條上通過毛細現(xiàn)象沿纖維膜向前流動，當 到達T線處，特異探針B系列上的序列與T線處包被的序列雜交結(jié)合，從而將5中得到的復 合物滯留在T線上，形成肉眼可見的有色條帶，此為陽性巧日圖1)。或者， 7、當待測核酸片段不存在時，就不會發(fā)生4~5步，就不能形成金顆粒通用探針一特 異探針A-特異擴增產(chǎn)物--特異探針B復合物，膠體金顆粒就不能在T線處聚集，就不會 形成肉眼可見的條帶，此為陰性巧日圖2)。
[0016] 8、無論有無待測核酸片段，金顆粒通用探針--特異探針A復合物都會有富余，貝U 多余的改復合物會越過T線繼續(xù)沿著纖維膜向前流動，當?shù)竭_C線時，與C線處包被的序列 結(jié)合，從而滯留在C線處，形成肉眼可見的有色條帶，此為實驗結(jié)果有效。
[0017] 本發(fā)明將膠體金免疫層析技術(shù)成功的應用到核酸片段的檢測中來，實現(xiàn)核酸的快 速、簡單、多重檢測。本發(fā)明采用的是核酸直接標金技術(shù)制備標檢測探針，兩者之間的連接 是通過共價鍵結(jié)合的，效果要比膠體金通過靜電吸附標記于半抗原抗體好。本發(fā)明在設計 時所用的金標探針序列為一段通用序列，該段通用序列5'端被琉基化(也可W是其他的化 學基團修飾，如-NHz(氨基）等）修飾后標記上膠體金顆粒，作為通用的有色探針，可W用于 所有病原體核酸的檢測。有了標金的通用探針后，在同一試紙條上就可W實現(xiàn)多重病原體 核酸的檢測。在多重檢測病原體核酸時，所有病原體核酸都共用運一種有色探針，只要設計 針對不同病原體核酸的特異探針即可完成同一張試紙條多種核酸的檢測，避免了膠體金顆 粒探針一病原體一標記的麻煩，可W大幅降低檢測成本。
[0018] 本發(fā)明所應用的所有檢測探針除通用探針標記膠體金顆粒外，其余探針都是普通 設計，對所要檢測的核酸片段也沒有特別的要求，不需要待檢核酸片段有任何標記和修飾。 運就為病原體核酸片段的擴增提供了很大方便，極大的降低了病原體核酸擴增引物的設計 要求(擴增引物不用任何修飾)。本發(fā)明可W檢測所有方法擴增出的核酸片段，應用性極廣。
[0019] 本發(fā)明在檢測一種病原體核酸時，設計兩套特異探針，即特異探針A和特異探針 B。兩套探針的使用，使得其中任何一套探針和病原體核酸擴增片段雜交失敗，都不能夠形 成被試紙條檢出的復合物，也就出現(xiàn)不了陽性檢測結(jié)果，保證了檢測的特異性。
[0020] 本發(fā)明在設計時引入的特異探針A和特異探針B有橋分子成分的作用，兩種探針 成功的將金標探針和待檢核酸片段串聯(lián)結(jié)合到一塊，實現(xiàn)核酸片段的特異檢測。橋分子 的引入可W根據(jù)待檢核酸片段的不同區(qū)域，多設計一些特異探針A巧日特異探針AUA2、 A3……），實現(xiàn)一條待檢核酸片段結(jié)合多條金標探針，大大提高檢測靈敏度。BrittanyA. Rohrman等人用膠體金免疫層析技術(shù)檢測HIV病毒核酸擴增產(chǎn)物時，并沒有針對HIV核酸 擴增片段的多位點設計多條特異探針，而只是將一種探針標記膠體金顆粒后作為特異探針 去雜交結(jié)合HIV核酸擴增產(chǎn)物，HIV核酸擴增片段的另一端被包被在NC膜上的另一特異探 針直接捕獲，從而將復合物捕獲在T線處形成肉眼可見的條帶。運是膠體金檢測核酸的一 次成功例子。但是運種特異單探針捕獲法的靈敏度并不高，必須借助金顯色增強液（gold enhancement solution)來增強顯色，提高靈敏度。本發(fā)明在設計時，特異探針A和特異探 針B都可W根據(jù)待檢核酸片段不同區(qū)域設計多條，可W實現(xiàn)一條檢測核酸分子上有多個膠 體金顆粒富集，大大提高靈敏度。本發(fā)明也正是應用了運種橋分子設計，也可W實現(xiàn)病原體 核酸片段的多重檢測。根據(jù)不同的病原體核酸片段，我們只需要將特異探針A的中間部分 序列和特異探針B重新設計即可，不需要修改質(zhì)控線和金標探針的設計，運樣更簡便、成本 也降低了很多。
[0021] 本發(fā)明作為一種核酸試紙條檢測技術(shù)，成功的融合了膠體金快速的特點。通過試 紙條檢測核酸，只需IOmin左右即可進行結(jié)果判讀。在操作上也十分簡單，只需將核酸特異 擴增物和檢測探