針混合后滴到檢測試紙上即可，對實驗人員技術(shù)要求低，更無需特殊的儀 器設(shè)備，易于核酸檢測向基層及偏遠農(nóng)村醫(yī)療機構(gòu)的推廣。
【附圖說明】
[0022] 圖1為用膠體金層析技術(shù)(通用探針、特異探針A、B)檢測待測核酸陽性結(jié)果的原 理示意圖 圖2為用膠體金層析技術(shù)(通用探針、特異探針A、B)檢測待測核酸陰性結(jié)果的原理示 意圖 圖3為核酸檢測試紙條的組裝結(jié)構(gòu)圖 圖4為用膠體金層析技術(shù)檢測樣品效果圖，其中，A為含有CP和MP的檢測結(jié)果，B為含 有CP的檢測結(jié)果，C為含有MP的檢測結(jié)果，D為陰性的檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0023] 通過W下詳細說明結(jié)合附圖可W進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施 例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不W任何方式限制本發(fā)明掲示的其余內(nèi)容。
[0024] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克?。簩?驗室指南》第 3 版（NewYork:ColdSpringHarbor1 油oratoryPress, 2005)中所述的 條件進行。
[00巧]【實施例1】通用核酸探針標記膠體金顆粒 1、 設(shè)計琉基化的通用探針序列： 5 ^ -SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3 ^ 2、 將設(shè)計好的通用探針(濃度0.ImM) 20y1加入到10y1的TCEP-肥1 (濃度IOOmM) 中，用水補足110y1，室溫還原琉基化DNA通用換針； 3、 將處理后的通用探針加入到30nm直徑顆粒的膠體金液中，室溫過夜解育。
[0026] 4、加入2%SDS液使其終濃度為0. 01%，室溫解育30min。
[0027] 5、向溶液中逐滴加入2M的化Cl,至終濃度為0.15M。
[0028] 6、離屯、純化金標核酸探針：15000巧m離屯、15min，沉淀用洗涂液（0. 15M化Cl, 0.01%505)洗四次，膠體金沉淀重懸于重懸液（0.151化(：1，5%854,0.25%1^6611，10%薦 糖）中，既得標記好的通用核酸探針標記膠體金顆粒。
[0029]【實施例2】核酸檢測試紙條的制備 在制備核酸檢測試紙條時需要的主要原材料：玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜（NC膜)、樣 本墊、吸水紙、PVC底板等。
[0030] 1、膠體金墊的制備：將玻璃纖維膜切割成0. SXlcm見方小模塊，每個模塊上用槍 均勻滴加10y1的標金核酸探針液，室溫使之干燥，封閉保存?zhèn)溆谩?br>[003。 2、噴膜： 檢測線（T線）：能夠捕獲結(jié)合特異探針B序列，（5uM)，噴膜量：2~3 y Vcm ; 質(zhì)控線（C線）：能夠捕獲結(jié)合特異探針A序列，（5uM)，噴膜量：2~3 y 1/cm ; 噴膜完畢后，將膜條置于室溫干燥，在紫外交聯(lián)儀中自動交聯(lián)一次，放于37°C潔凈恒溫 箱內(nèi)干燥2小時，存于干燥環(huán)境中備用。
[0032] 3、試紙條組裝 分別裁取2cm長的吸水紙、包被好的NC膜、吸附金標探針的玻璃纖維膜、樣品墊從上到 下依次固定于PVC底板上，即成檢測試紙條。試紙條的組裝結(jié)構(gòu)圖如圖3。
[0033]【實施例3】通用多重檢測試紙條檢測肺炎支原體（MP)和肺炎衣原體（Cpn)核酸擴 增片段 擴增MP核酸的引物序列： R引物：5' -TAATACGACTCACTATAGGGAGACTCGTGAACTTGGTGTGGTTT-3， F引物：5, -GGCAGTCAGACGATGATTACAGGC-3， 檢測MP的特異探針AU序列輛條）為： 5^ -GTTCGAGCCACGTCCTCATTAGTTTTCCTCCAGCTCTGAACGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT -3' 5^ -GTTCGAGCCACGTCCTCATTAGTTTTATGATAAGGCTTCAAGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT -3' 檢測MP的特異探針Bl、北序列(兩條）為： 5' -GGTTCGCCTCGAAGAATTTTCTGTAGGAATGAATGT-3' 5' -CCCTCGACCAAGCCAATTTTCTGTAGGAATGAATGT-3' 檢測MP的T線包被序列為：5' -ACATTCATTCCTACAG-3' 擴增Cpn核酸的引物序列： R引物：5, -TAATACGACTCACTATAGGGAGAATACGTGAGCAGCTCTCTCGTT-3' F引物：5' -AGACTTCATGCAAATTGTTTCC-3' 檢測Cpn的特異探針AU序列輛條）為： 5^ -GTTCGAGCCACGTCCTCATTAGTTTTTTGTGGAGTTACTGTATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTT CT-3> -GTTCGAGCCACGTCCTCATTAGTTTTGGAGCTACTTTAGTTGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTT CT-3> 檢測Cpn的特異探針BI、B2序列(兩條）為： 5' - TGTCAGATCAACAAGTTTTTGTAGGCCTCTAAGCCGTCCA-3' 5' -TTMATCTAGAAAAGCTTTTGTAGGCCTCTAAGCCGTCCA-3' 檢測Cpn的T線包被序列為：5' -TGGACGGCTTAGAGGCCTAC-3' C線處包被序列：5' -CTAATGAGGACGTGGCTCGAAC-3' a、T7線性擴增肺炎支原體和肺炎衣原體核酸片段：
95°C，2min，42°C，2min后補加擴增酶混合液（AMV&T7聚合酶&RNaseH)ly1，在42°C反 應45min后，待檢。
[0034] b、檢測a中的肺炎支原體和肺炎衣原體特異擴增產(chǎn)物： MP/CPn擴增產(chǎn)物 10y1 CPn-特異探針Bl(IuM) Iyl CPn-特異探針B2 (IuM) Iyl CPn-特異探針Al(IOuM) Iyl CPn-特異探針A2 (IOuM) Iyl MP-特異探針Bl(IuM) Iyl MP-特異探針Bl(IuM) Iyl MP-特異探針Al(IOuM) Iyl MP-特異探針A2 (IOuM) Iyl 層析液（10XSSC+0. 4%SDS) 至 100y1 42°CIOmin后點在試紙條上5min后觀察結(jié)果巧日圖4)。
【主權(quán)項】
1. 一種核酸多重檢測的膠體金標檢測試劑盒，包括： (1) 、膠體金試紙條：所用試紙條被固定于PVC底板上，從左往右依次是樣品墊、玻璃纖 維、NC膜、吸水紙；NC膜上有T線(檢測線）和C線(質(zhì)控線)，所述檢測線處包被一段核酸序 列，該序列能特異性雜交結(jié)合相應的特異探針B系列，檢測線有一條或一條以上；所述C線 處包被另一段核酸序列，該序列能特異性雜交結(jié)合特異探針A系列；通用探針5'端巰基化 修飾，也可進行其他化學基團修飾，如-NH 2(氨基)，然后標記膠體金顆粒，且能特異探針A系 列互補配對雜交，將標記膠體金后的通用探針固定于試紙條的玻璃纖維素膜上； (2) 、分別盛有特異探針A系列、特異探針B系列的探針管：特異探針A系列包括三個部 分，其一端可與通用探針雜交，中間能與待測核酸雜交，另一端可以與包被在NC膜上C線處 的核酸雜交，對應于一種待測核酸的特異探針A系列可以有一種以上，分別和待測核酸的 不同區(qū)域互補配對雜交，裝在不同的探針管里；特異探針B系列包括兩部分，其一端可與待 測核酸雜交，另一端可以與包被在NC膜上相應T線處的核酸雜交，對應于一種待測核酸的 特異探針B系列可以有一種以上，分別和待測核酸的不同區(qū)域互補配對雜交，裝在不同的 探針管里。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸多重檢測的膠體金標檢測試劑盒，其特征在于：所述通 用探針序列為：5-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGITGCTCTCCAITITTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAG GC_3(Seq No. 1)，其中SH為巰基，5'端為巰基修飾，也可進行其他的化學基團修飾，如_NH2。3. 權(quán)利要求1-2所述的核酸多重檢測的膠體金標檢測試劑盒在病原體核酸檢測中的 應用，其特征在于：所述的病原體是寄生蟲、真菌、細菌、病毒、支原體以及衣原體。4. 一種核酸多重檢測的膠體金標快速檢測方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 、設(shè)計探針：通用探針、針對每一種待測核酸的特異探針A系列和特異探針B系列， 其中，通用探針的5'端巰基化修飾后標記膠體金顆粒，且可以和特異探針A系列互補配對 雜交；特異探針A系列包括三個部分，其一端可與通用探針雜交，中間可以與待測核酸雜 交，另一端可以與包被在NC膜上C線處的核酸雜交，對應于一種待測核酸的特異探針A系 列可以有一種以上，分別和待測核酸的不同區(qū)域互補配對雜交；特異探針B系列包括兩部 分，其一端可與待測核酸雜交，另一端可以與包被在NC膜上相應T線處的核酸雜交，對應于 一種待測核酸的特異探針B系列可以有一種以上，分別和待測核酸的不同區(qū)域互補配對雜 交； (2) 、制備膠體金試紙條：所述試紙條被固定于PVC底板上，從左往右依次是樣品墊、玻 璃纖維、NC膜、吸水紙；NC膜上有T線(檢測線）和C線(質(zhì)控線）;所述檢測線處包被一段核 酸序列，該序列能特異性雜交結(jié)合針對一種待測核酸的特異探針B系列，檢測線有一條或 一條以上；所述C線處包被另一段核酸序列，該序列能特異性雜交結(jié)合特異探針A系列；將 標記膠體金后的通用探針置于試紙條的膠體金墊上，將特異探針A系列、特異探針B系列和 待測核酸特異擴增產(chǎn)物雜交后滴在樣品墊上層析，檢測線顯色表示有待測核酸存在，質(zhì)控 線顯色表示檢測有效。5. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸多重檢測的膠體金標快速檢測方法，其特征在于： 所述通用探針序列為：5-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGITGCTCTCCAITITTAGAAGGCGTCC GTCTTTGAGGC-3 (Seq No. 1)，其中SH為巰基，5'端為巰基修飾，也可進行其他的化學基團修 飾，如-NH20
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用膠體金層析技術(shù)進行多重核酸檢測的方法及試劑盒，屬于醫(yī)學生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供核酸檢測試紙條，將通用探針標記上膠體金顆粒后固定于玻璃纖維素膜上，其設(shè)計為通用序列，試紙條的NC膜上有檢測線和質(zhì)控線，檢測線處包被一段核酸序列，能特異性雜交結(jié)合相應的特異探針B系列，檢測線有一條或一條以上；質(zhì)控線處包被一段核酸序列，該序列能特異性雜交結(jié)合特異探針A系列，特異探針A系列和通用探針互補配對雜交；特異探針A系列和特異探針B系列將金標探針和核酸擴增片段串聯(lián)結(jié)合到一塊，實現(xiàn)核酸片段的特異檢測。本方法對實驗人員技術(shù)要求低，所需檢測時間短，無需特殊的儀器設(shè)備，易于向基層及偏遠農(nóng)村醫(yī)療機構(gòu)的推廣。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105154565
【申請?zhí)枴緾N201510658968
【發(fā)明人】李先強, 姜昕, 陳巨
【申請人】武漢中幟生物科技股份有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年10月12日