325_337)，并且通過酪 丁 酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum)(Wu和Yang(2003)Biotechnol.Bioeng. 82: 93-102)制備丁酸。通過梭菌屬（Clostridiumsp.)菌株 17crl(Janssen(2004)Arch. Microbiol. 182:482-486)由蘇氨酸通過發(fā)酵制備丙酸鹽和丙醇。使用酵母樣普魯蘭出芽 短梗霉（Aureobasidiumpullulans) (Anantassiadis等人，（2005)Biotechnol.Bioeng. 91 : 494-501)，通過黑曲霉突變體（Singh等人，（2001)IndianJ.Exp.Biol. 39:1136-43)制備 葡糖酸。通過氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacteroxydans)突變體（Elfari等人，（2005) ApplMicrobiol.Biotech. 66 :668_674)制備5-酮基-D-葡糖酸，通過土曲霉（Aspergillus terreus)突變體（Reddy和Singh(2002)Bioresour.Technol. 85 :69_71)生產(chǎn)衣康酸， 通過黑曲霉突變體菌株（Ikram-Ul-Haq等人，（2005)Bioresour.Technol.96 :645_648) 生產(chǎn)梓檬酸，并且通過吉利蒙念珠菌FTI20037 (Mussatto和Roberto(2003)J.Appl. Microbiol. 95:331-337)生產(chǎn)木糖醇。通過重組紅串紅球菌（Pseudomonasputida)和富 養(yǎng)羅爾斯通氏菌（Ralstoniaeutropha)(Gorenflo等人，（2001)Biomacromolecules2: 45-57)生產(chǎn)包含4-羥基戊酸酯和顯著量的3-羥基丁酸3-羥基戊酸的生物聚酯。通過重 組大腸桿菌（Ui等人，（2004)Lett.Appl.Microbiol. 39:533-537)制備L-2, 3-丁二醇。
[0074] 使用棒狀桿菌（Corynebacterium)、短桿菌（Brevibacterium)、以及沙雷氏菌 (Serratia)的營養(yǎng)缺陷型菌株和氨基酸類似物抗性菌株實(shí)現(xiàn)通過發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸。例如， 日本專利公布56008596描述了使用組氨酸類似物抗性菌株生產(chǎn)組氨酸，EP136359描述了 使用重組菌株生產(chǎn)組氨酸。日本專利公布47004505和51019037描述了使用色氨酸類似 物抗性菌株生產(chǎn)色氨酸。日本專利公布47038995、51006237、54032070描述了使用異亮氨 酸類似物抗性菌株生產(chǎn)異亮氨酸。日本專利公布56010035描述了使用苯丙氨酸類似物抗 性菌株生產(chǎn)苯丙氨酸。已經(jīng)描述了使用需要苯丙氨酸生長的酪氨酸抗性菌株（Agr.Chem. Soc.Japan50(1)R79-R87 (1976)或重組菌株（EP263515、EP332234)生產(chǎn)酪氨酸，并且描 述了使用L-精氨酸類似物抗性菌株（Agr.Biol.Chem. (1972)36 :1675-1684,日本專利公布 54037235和57150381)生產(chǎn)精氨酸。也在大腸桿菌菌株ATCC31882、31883和31884中通 過發(fā)酵生產(chǎn)苯丙氨酸。US6, 962, 805描述了在重組棒狀桿菌中生產(chǎn)谷氨酸。在Okamoto 和Ikeda(2000)J.BiosciBioeng. 89 :87-79中描述了通過大腸桿菌突變株生產(chǎn)蘇氨酸。 通過百合棒狀桿菌（Corynebacteriumlilium)突變株（Kumar等人，（2005)Bioresour. Technol. 96 :287-294)生產(chǎn)甲硫氨酸。
[0075] 通過生物催化劑也已經(jīng)制備出有用的肽、酶和其他蛋白質(zhì)（例如參見US 6, 861，237、US6, 777, 207、US6, 228, 630)。
[0076] 通過生物催化劑在發(fā)酵中生產(chǎn)的目標(biāo)化合物可使用多種本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行 回收。可通過離心、過濾、微量過濾和納米過濾從其他發(fā)酵組分中分離產(chǎn)品。可通過離子交 換、溶劑萃取、或電透析提取產(chǎn)品?？墒褂眯跄齽┮杂兄诋a(chǎn)品分離。作為一個(gè)具體示例，可 使用ABE發(fā)酵領(lǐng)域已知的方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離生物生產(chǎn)的1-丁醇（參見例如，Durre， Appl.Microbiol.Biotechnol.49 :639_648 (1998)，Groot等人，Process.Biochem.27 : 61-75(1992)，以及其中的參考文獻(xiàn)）。例如，可通過離心、過濾、潷析等從發(fā)酵培養(yǎng)基中去除 固體。然后，可使用諸如蒸餾、共沸蒸餾、液液萃取、吸附、汽提、膜蒸發(fā)、或全蒸發(fā)的方法從 發(fā)酵培養(yǎng)基中分離1-丁醇。通過例如使反應(yīng)混合物經(jīng)過有機(jī)溶劑、蒸餾和柱層析提取，可 以實(shí)現(xiàn)從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中純化1，3-丙二醇（US5, 356, 812)。就該方法而言尤其好的有 機(jī)溶劑是環(huán)己烷（US5, 008, 473)。氨基酸可以通過如離子交換樹脂吸附和/或結(jié)晶的方法 從發(fā)酵培養(yǎng)基中收集。通常使用蒸餾和分子篩回收醇。
[0077]遞
[0078] 任何生物催化劑諸如如上所述的那些用于通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的可發(fā)酵糖的發(fā) 酵。與具體生物催化劑一起使用的發(fā)酵條件可如以上引用的參考文獻(xiàn)中所述或如本領(lǐng)域技 術(shù)人員所已知的。
[0079]例如，以下描述使用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生產(chǎn)乙醇的大規(guī)模發(fā)酵。將所需運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單 胞菌細(xì)胞在搖瓶中在約30°C至約37°C下的半復(fù)合培養(yǎng)基中生長，在軌道式振蕩器中在約 150rpm下振蕩，然后將其轉(zhuǎn)移到包含類似培養(yǎng)基的10L種子發(fā)酵罐中。種子培養(yǎng)物在種子 發(fā)酵罐中厭氧生長，直至〇D6。。介于3和6之間，然后將其轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)發(fā)酵罐中，其中的發(fā)酵 參數(shù)經(jīng)最優(yōu)化用于乙醇生產(chǎn)。從種子罐轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)罐的典型種菌體積在約2%至約20% v/V的范圍內(nèi)。發(fā)酵培養(yǎng)基可僅由水解產(chǎn)物構(gòu)成，或可包括水解產(chǎn)物之外的組分，諸如山梨 醇或甘露糖醇，最終濃度為約5mM，如US7, 629, 156中所述。發(fā)酵可為分批方法、補(bǔ)料分批 方法或連續(xù)方法，分批方法和補(bǔ)料-分批培養(yǎng)方法是常用的并且是本領(lǐng)域熟知的，示例可 存在于Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology，Crueger，Crueger和 Brock，第二版（1989)SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36, 227，（1992)〇
[0080] 通常使用苛性溶液（諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、或氫氧化鈉）和硫酸或磷酸將發(fā)酵 控制在pH4. 5-6. 5。發(fā)酵罐的溫度控制在30°C-37°C。為使發(fā)泡最小化，可根據(jù)需要向容 器中添加消泡劑（任何類別基于硅氧烷的、基于有機(jī)物的等等）。
[0081] 上述任何條件組和這些條件中在本領(lǐng)域熟知的附加變化是通過利用木糖的重組 發(fā)酵單胞菌細(xì)胞產(chǎn)生乙醇的合適條件。通常，培養(yǎng)物在沒有補(bǔ)充空氣、氧氣、或其他氣體的 情況下被溫育（這可包括諸如厭氧、微氧、或微需氧發(fā)酵的條件），持續(xù)至少約20小時(shí)，并可 進(jìn)行約48小時(shí)、120小時(shí)或更長。
[0082] 此外，可使用同時(shí)糖化和發(fā)酵（SSF)工藝或混合糖化和發(fā)酵（HSF)工藝進(jìn)行發(fā)酵。 在HSF中，部分糖化在發(fā)酵單胞菌細(xì)胞的添加之前進(jìn)行，然后同時(shí)發(fā)生進(jìn)一步的糖化和發(fā) 酵。第二階段同時(shí)糖化和發(fā)酵可如公布為US8, 647, 850的美國專利申請(qǐng)公布2011/0318803 中所述進(jìn)行。在這種工藝中，發(fā)酵單胞菌細(xì)胞在糖化-發(fā)酵混合物中有高濃度不溶性固體 的情況下，于低葉輪攪拌條件下在同時(shí)糖化和發(fā)酵反應(yīng)過程中生長，以用于生產(chǎn)高濃度的 乙醇。
[0083]實(shí)您1
[0084] 本發(fā)明將在以下的實(shí)例中進(jìn)一步限定。應(yīng)該理解，這些實(shí)例盡管說明了本發(fā)明的 優(yōu)選實(shí)例，但僅是以例證的方式給出的。通過上述論述和這些實(shí)例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確 定本發(fā)明的必要特征，并且在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種 變化和修改以適應(yīng)多種用途和條件。
[0085] 縮寫詞的含義如下："hr"是指小時(shí)，"min"是指分鐘，"sec"是指秒，"d"是指天， "L"是指升，"mL"是指毫升，"yL"是指微升，"g"是指克，"yg"是指微克，"ng"是指納克， "g/L"是指克每升，"mM"是指毫摩爾，"yM"是指微摩爾，"nm"是指納米，"ymol"是指微摩 爾，"pmol"是指皮摩爾，"0D6。。"是指在600nm測(cè)得的光密度，"w/v"是指重量每體積，"w/w" 是指重量每重量，"sacc"是糖化，"ferm"是發(fā)酵，"av"是平均，"glue"是葡萄糖，"xyl"是 木糖，"arab"是阿拉伯糖。
[0086] 一般方法
[0087]糖化
[0088]使用酶混合物A.CC.eUe.t，asel(_Trio?(Genencor，PaloAlto,CA)將預(yù)處理的玉米 秸桿酶促水解。用于水解的固體負(fù)載保持在20重量％或25重量％。在糖化之前，通過滴定 測(cè)定將pH調(diào)節(jié)至5. 3所需硫酸的量。糖化在pH5. 3、47°C和250rpm攪拌下進(jìn)行48h。每 個(gè)水解在具有250g總糖化混合物的1. 0L帶導(dǎo)流板燒瓶中進(jìn)行。在24hr和48hr處取樣用 于HPLC分析。
[0089] 牛物催化劑
[0090]菌株CD2
[0091] 在實(shí)例1-3中，使用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株C2D作為發(fā)酵中的生物催化劑，從而生產(chǎn) 乙醇。菌株020來源于菌株六1?3 7-31，后者來源于菌株21705，其在1^ 8,247,208中公開， 該專利以引用方式并入本文。在菌株ZW705在恒濁器中生長之后，分離菌株AR3 7-31，如US 2012/0329114中所述，該專利以引用方式并入本文；該菌株在其中也稱為適應(yīng)型7-31。在 該連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)裝置中，乙酸銨和乙醇在水解產(chǎn)物培養(yǎng)基中的濃度隨時(shí)間推移而增大。將 AR3 7-31的整個(gè)基因組測(cè)序并且與ZW705基因組的序列相比較。發(fā)現(xiàn)菌株AR3 7-31在運(yùn) 動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因組（NCBIReference:NC_006526. 2)的zmol432開放閱讀框中具有基因 修飾，其中zm〇1432注釋為編碼"鐮孢菌酸抗性蛋白"。這種修飾的效果是改善菌株在水解 產(chǎn)物培養(yǎng)基中的表現(xiàn)。
[0092] 對(duì)菌株AR3 7-31進(jìn)行進(jìn)一步修飾以改善其性能。通過引入araB、araA和araD基 因表達(dá)作為Pgap-BAD操縱子來加入阿拉伯糖利用途徑，如US2011/0143408中所述，該專 利以引用方式并入本文。Pgap-BAD操縱子整合進(jìn)pnp基因座中，從而導(dǎo)致由pnp基因座表 達(dá)C-端截短蛋白，如共同擁有和共同未決的美國專利申請(qǐng)#13/711646中所公開，該專利申 請(qǐng)以引用方式并入本文。araE阿拉伯糖-質(zhì)子協(xié)同載體被表達(dá)，以改善阿拉伯糖利用，如 US2011/0143408中所公開，該專利以引用方式并入本文。通過引入編碼RPI的另外的基 因，核糖-5-磷酸異構(gòu)酶活性的提高表達(dá)被工程化，如US2012/0156746中所公開，該專利 以引用方式并入本文。所得的經(jīng)修飾的C2D菌株利用木糖和阿拉伯糖在水解產(chǎn)物培養(yǎng)基中 生產(chǎn)乙醇。
[0093]菌株R70B1
[0094] 由菌株ZW1(ATCC31821)制備運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株