、乳酸、丙酸、3-羥基丙酸、丁酸、葡萄 糖酸、衣康酸、檸檬酸、琥珀酸、3-羥基丙酸、富馬酸、馬來酸和乙酰丙酸。氨基酸可包括谷氨 酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。附加的目標 化合物包括甲烷、乙烯、丙酮和工業(yè)酶。
[0060] 糖轉化為目標化合物的發(fā)酵可通過一種或多種適當?shù)纳锎呋瘎┰谝徊交蚨嗖?發(fā)酵過程中進行。生物催化劑可以是選自細菌、絲狀真菌和酵母的微生物。生物催化劑可 為野生型微生物或重組微生物，并且可包括例如屬于埃希氏菌（Escherichia)、發(fā)酵單胞 菌（Zymomonas)、酵母屬（Saccharomyces)、假絲酵母屬（Candida)、畢赤酵母屬（Pichia)、 鏈霉菌（Streptomyces)、芽胞桿菌（Bacillus)、乳酸桿菌（Lactobacillus)和梭菌 (Clostridiuma)屬的生物體。通常，生物催化劑的示例包括重組大腸桿菌、運動發(fā)酵單胞 菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌、釀酒酵母、嗜熱梭菌、高溫產(chǎn)氫菌、以及樹干畢赤酵母。
[0061] 通常，生物催化劑能夠利用葡萄糖和木糖，并且可另外利用阿拉伯糖。例如，對 于所期望的目標化合物生產(chǎn)是有效的生物催化劑的任何發(fā)酵單胞菌菌株均可使用。發(fā)酵 單胞菌細胞天然地利用葡萄糖、果糖和/或蔗糖作為發(fā)酵底物生產(chǎn)乙醇，但木糖不被代 謝。希望使用已針對木糖利用工程化的發(fā)酵單胞菌細胞，其已完成如下。通常，四種基因 已被引入運動發(fā)酵單胞菌（Z.mobilis)，用于表達參與木糖代謝的四種酶，以創(chuàng)建木糖利用 代謝途徑，如US5, 514, 583、US5, 712, 133、US6, 566, 107、TO95/28476、Feldmann等人 ((1992)ApplMicrobiolBiotechnol38:354-361)和Zhang等人（（1995)Science267: 240-243)中所述。這些基因包括編碼木糖異構酶的基因，該酶催化木糖轉化成木酮糖；以 及編碼木酮糖激酶的基因，該酶磷酸化木酮糖以形成5-磷酸木酮糖。另外還表達了戊糖 磷酸途徑中的兩種酶，轉酮醇酶和轉醛醇酶，它們將5-磷酸木酮糖轉化成連接戊糖代謝與 Entner-Douderoff糖酵解途徑的中間體，該途徑使木糖代謝成乙醇（參見圖1)。編碼這 些酶的DNA序列可從能夠代謝木糖的多種微生物中的任何一種獲得，諸如腸細菌和一些酵 母以及真菌。編碼區(qū)的來源可包括黃單胞菌（Xanthomonas)、克雷伯氏菌（Klebsiella)、 埃希氏菌（Escherichia)、紅細菌（Rhodobacter)、黃桿菌（Flavobacterium)、醋 桿菌（Acetobacter)、葡糖桿菌（Gluconobacter)、根瘤菌（Rhizobium)、農(nóng)桿菌 (Agrobacterium)、沙門氏菌（Salmonella)、假單胞菌（Pseudomonads)和發(fā)酵單胞菌 (Zymomonas)。大腸桿菌（E.coli)的編碼區(qū)通常被使用。
[0062] 將編碼DNA序列可操作地連接至在發(fā)酵單胞菌細胞中表達的啟動子諸如運動 發(fā)酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶的啟動子（GAP啟動子）和運動發(fā)酵單胞菌烯醇酶的 啟動子（ENO啟動子）。如US7, 989, 206中所公開的具有增加的表達的突變體GAP啟動 子對于在發(fā)酵單胞菌中表達也是有用的。編碼區(qū)可從啟動子開始單個表達，或者兩個或 更多個編碼區(qū)可接合到一個操縱子中，從相同啟動子開始一起表達?？蓪⑺玫那逗匣?因引入發(fā)酵單胞菌細胞并保持在質粒上，或者使用例如同源重組、定點整合、或隨機整合 而整合進基因組中。經(jīng)工程化以表達木糖利用代謝途徑的菌株的示例包括CP4(pZB5) (US5, 514, 583)、ATCC31821/pZB5(US6, 566, 107)、8b(US7, 223, 575;Mohagheghi等人， (2004)Biotechnol.Lett. 25 ;321-325)、以及ZW658(AITCC#PTA-7858)。經(jīng)工程化以表達木 糖利用代謝途徑的發(fā)酵單胞菌細胞在能夠在包含木糖作為唯一糖類的培養(yǎng)基中生長之前， 一般需要在含木糖的培養(yǎng)基中適應一段時間。
[0063]發(fā)酵單胞菌細胞可另外工程化，以用于阿拉伯糖利用，如US5, 843, 760中所述。 為了允許阿拉伯糖的利用，除木糖利用途徑的基因之外還表達的基因包括：1)使L-阿拉 伯糖轉化為L-核酮糖的L-阿拉伯糖異構酶，2)使L-核酮糖轉化為L-核酮糖-5-磷酸的 L-核酮糖激酶，和3)使L-核酮糖-5-磷酸轉化為D-木酮糖的L-核酮糖-5-磷酸-4-差 向異構酶（US5, 843, 760)。如US2011/0143408中所公開的，通過另外表達阿拉伯糖-質 子協(xié)同載體，諸如通過表達來自araE基因的編碼區(qū)，可實現(xiàn)改善的阿拉伯糖利用。
[0064]此外，發(fā)酵單胞菌細胞可具有改進了菌株的一個或多個另外的基因修飾，諸如提 高生長速率和/或細胞群、提高木糖的利用和/或允許使用其他糖類諸如阿拉伯糖、提高對 抑制性化合物諸如乙酸鹽的耐受性、或提高乙醇的生產(chǎn)的基因修飾。例如，編碼整合宿主因 子的a亞基的內(nèi)源性himA基因可經(jīng)過基因修飾以減少其表達，這改善了在包含乙酸鹽的 培養(yǎng)基中的生長，如US7, 897, 396中所述。乙酸鹽存在于生物質水解產(chǎn)物中，因此當使用 包含生物質水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基時，對這種組分的提高的耐受性是期望的。
[0065]在另一個示例中，可進行使葡萄糖-果糖氧化還原酶（GF0R)活性降低的基因修 飾，如US7, 741，119中所述。GF0R以及himA基因的表達的降低，可以是通過任何方法，諸 如上文關于降低醛糖還原酶活性所描述的那些。
[0066] 在另一個示例中，可進行使核糖-5-磷酸異構酶（RPI)活性增加的基因修飾，如在 共同擁有和共同未決的US2012/0156746中所公開的。RPI表達的提高可通過提高內(nèi)源性RPI編碼基因的表達而實現(xiàn)，諸如利用活性高于天然啟動子的啟動子，或通過表達編碼在發(fā) 酵單胞菌中具有核糖-5-磷酸異構酶活性的任何蛋白質或多肽的異源性基因。
[0067]在另一個示例中，使用US7, 989, 206和US7, 998, 722中所公開的突變的、高活 性啟動子表達了作為木糖利用代謝途徑的部分被表達的木糖異構酶。在其中所公開的突 變體啟動子是運動發(fā)酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子。另外，木糖異構酶 可為包括在由EC5. 3. 1. 5鑒定的酶分類中的I組木糖異構酶，如在公布為US8, 623, 623 的共同擁有和共同未決的US2011/0318801中所公開的。在其中公開了I組木糖異構酶， 諸如從分離自密蘇里游動放線菌（Actinoplanesmissouriensis)的編碼區(qū)表達的，在發(fā) 酵單胞菌中具有比2組木糖異構酶更高的活性。在其中通過分子系統(tǒng)發(fā)育的生物信息 學分析（使用如應用在PHYLIP中的PHYLIP鄰接算法（PhylogenyInferencePackage 版本 3.5c;Felsenstein(1989)Cladistics5:164-166))、GroupSim分析（Capra和 Singh(2008)Bioinformatics24 :1473-1480)、和剖面隱馬爾科夫模型（使用HMMER軟件包 的hmmsearch算法；JaneliaFarmResearchCampus，Ashburn，VA)定義了I組木糖異構 酶。
[0068] 在另一個示例中，發(fā)酵單胞菌細胞可適應生長于包含乙醇和乙酸銨的脅迫培養(yǎng)基 中，如US8, 247, 208中所公開的。當使用包含纖維素生物質水解產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基（其包 含乙酸鹽）時，具有改善的乙酸鹽耐受性的這些發(fā)酵單胞菌菌株是尤其有用的。
[0069] 以上參考文獻中所公開的菌株和本文所述的菌株提供了可用作生物催化劑的菌 株的示例并且包括ATCC31821/pZB5、ZW658 (ATCC#PTA-7858)、ZW800、ZW801-4、ZW801-4 ::AhimA、AcR#3、ZW705、AR3 7-321、ZW1-XA111、以及R70B1。
[0070] 生產(chǎn)乙醇的另外的生物催化劑諸如酵母和經(jīng)基因修飾的大腸桿菌菌株 (Underwood等人，（2002)Appl.Environ.Microbiol. 68 :6263_6272)，以及生產(chǎn)其他目標化 合物的生物催化劑諸如以上列出的那些可在使用本發(fā)明方法生產(chǎn)的可發(fā)酵糖的發(fā)酵中使 用。例如，被工程化以表達丁醇合成途徑的酵母細胞和被工程化用于生產(chǎn)1，3_丙二醇的大 腸桿菌已有所描述。生物催化劑中丁醇合成（包括異丁醇、1-丁醇和2-丁醇）途徑的工 程化已公開于，例如，1^ 8,206,970、1^ 20070292927、1^ 20090155870、1]5 7,851，188、以 及US20080182308。生物催化劑中1，3-丙二醇途徑的工程化已公開于US6, 514, 733、US 5,686,276、US7,005,291、US6, 013, 494、以及US7,629,151。
[0071] 為了利用木糖作為碳源，可將酵母細胞工程化以表達完全木糖利用途徑。將酵母 諸如釀酒酵母（S.cerevisiae)工程化以由木糖生產(chǎn)乙醇描述于Matsushika等人（六口口1. Microbiol.Biotechnol. (2009)84:37-53)和Kuyper等人（FEMSYeastRes. (2005)5: 399-409)中。
[0072]通過大腸桿菌重組菌株（Zhou等人，（2003)Appl.Environ.Microbiol. 69 : 399-407)、芽孢桿菌（US7,098,009)和米根霉（Rhizopusoryzae)(Tay和Yang(2002) Biotechnol.Bioeng. 80:1-12)的天然菌株在發(fā)酵中生產(chǎn)了乳酸。大腸桿菌重組菌株已用 作生物催化劑在發(fā)酵中生產(chǎn)1，3_丙二醇（US6,013,494、US6,514,733)和己二酸（Niu 等人，（2002)Biotechnol.Prog. 18:201-211)。使用重組梭菌（Clostridia)(Cheryan等 人，（1997)Adv.Appl.Microbiol.43:1-33)和新鑒定的酵母菌株（Freer(2002)World J.Microbiol.Biotechnol. 18 :271-275)通過發(fā)酵制備了乙酸。通過重組大腸桿菌和其 他細菌生產(chǎn)琥珀酸公開于US6, 159, 738中，并且通過重組大腸桿菌突變體生產(chǎn)琥珀酸公 開于Lin等人（2005)Metab.Eng. 7:116-127 中。通過光滑球擬（Torulopsisglabrata) 酵母突變體（Li等人，（2001)Appl.Microbiol.Technol. 55 :680_685)和大腸桿菌突變體 (Yokota等人，（1994)Biosci.Biotech.Biochem. 58:2164-2167)生產(chǎn)了 丙酮酸。使用大 腸桿菌重組菌株作為生物催化劑用于生產(chǎn)對羥基肉桂酸（US20030170834)和奎尼酸（US 7, 642, 083)。
[0073] 在發(fā)酵中使用丙酸丙酸桿菌（Propionibacteriumacidipropionici)突變體 生產(chǎn)丙酸（Suwannakham和Yang(2005)Biotechnol.Bioeng. 91 :