對(duì)人體或動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行制備的方法和裝置的制造方法
【專利說(shuō)明】對(duì)人體或動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行制備的方法和裝置現(xiàn)有技術(shù)
[0001]本發(fā)明涉及一種對(duì)權(quán)利要求1的前序部分所述的人體或動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行制備的方法、一種根據(jù)將權(quán)利要求12的前序部分所述的帶有若干個(gè)裝有細(xì)胞培養(yǎng)物的深孔的微滴定培養(yǎng)板，以及一種根據(jù)將權(quán)利要求14的前序部分所述的細(xì)胞培養(yǎng)物的應(yīng)用。
[0002]通常是在人類或動(dòng)物類哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上進(jìn)行對(duì)一定的生物活性物質(zhì)的作用和效應(yīng)進(jìn)行研究的醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞培養(yǎng)物置于被試驗(yàn)的物質(zhì)中并對(duì)細(xì)胞的反應(yīng)進(jìn)行分析研究。
[0003]如今通常會(huì)采用細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞會(huì)附著在表面上，例如會(huì)粘附在細(xì)胞培養(yǎng)皿的底部。為此將人體或動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞懸液滴入到含有培養(yǎng)液的器皿中。然后細(xì)胞在培養(yǎng)液中沉淀和沉降在器皿的底部。在那里附著并且以主要與培養(yǎng)液中所含有的生長(zhǎng)因子有關(guān)的分裂速率進(jìn)行分裂。幾天后，在器皿的底部形成所謂的細(xì)胞集落，該細(xì)胞集落將底部徹底覆蓋住。然后這種細(xì)胞集落只在有限的時(shí)間里是性能穩(wěn)定的。當(dāng)細(xì)胞在器皿中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)-通常是幾天后-細(xì)胞會(huì)從底部脫附和死亡。因此有必要定期進(jìn)行所謂的傳代，會(huì)利用酶使細(xì)胞從器皿底部脫離下來(lái)、進(jìn)行洗滌、分離和然后移液到另外一個(gè)器皿中重新進(jìn)行
[0004]細(xì)胞分裂。這個(gè)過(guò)程被稱為傳代培養(yǎng)并且通常手動(dòng)進(jìn)行。它的成本相對(duì)高昂。此夕卜，在經(jīng)歷每次傳代后，細(xì)胞及其表型以及它的特性都會(huì)有所改變。也就是說(shuō)，它們不再進(jìn)行分化并且會(huì)從一個(gè)具有全部特性的分化階段，例如皮膚細(xì)胞或肝細(xì)胞，而培育生長(zhǎng)成非特殊性的和最終不適于進(jìn)行分析研究的細(xì)胞。原則上適用的是，較新一代的細(xì)胞(子代細(xì)胞)通常比較老一代的細(xì)胞(原代細(xì)胞)的分化程度弱。經(jīng)過(guò)若干次傳代后，細(xì)胞懸液中所包含的細(xì)胞最終具有與原始種子細(xì)胞完全不同的特征。
[0005]后果是，時(shí)而在較老一代的細(xì)胞培養(yǎng)物，時(shí)而在較新一代的細(xì)胞培養(yǎng)物上進(jìn)行的同一個(gè)實(shí)驗(yàn)可能會(huì)得出不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此在已知的細(xì)胞培養(yǎng)物上所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)只能在非常短的幾天時(shí)間內(nèi)是可復(fù)制的，因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)物會(huì)隨著時(shí)間的推移而有所改變。
[0006]不斷分裂的細(xì)胞的另一個(gè)缺點(diǎn)是，細(xì)胞會(huì)處在一個(gè)與生長(zhǎng)中的生物體組織的狀況有顯著差異的狀態(tài)中。生長(zhǎng)中的機(jī)體里的細(xì)胞分裂是一個(gè)相對(duì)非常罕見(jiàn)的事件。它多半只是在組織缺損后才會(huì)發(fā)生和通常會(huì)隨著炎癥反應(yīng)而出現(xiàn)。因此并不會(huì)對(duì)這些細(xì)胞的正常狀態(tài)，而是會(huì)對(duì)極端情況進(jìn)行檢查研究。這些事實(shí)可以說(shuō)明，為什么到目前為止利用這種細(xì)胞培養(yǎng)物所取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)常很少是與臨床檢查結(jié)果相一致的。
[0007]因?yàn)榈侥壳盀橹篃o(wú)法讓靜止的不分裂的細(xì)胞存活更長(zhǎng)的時(shí)間，與之相反的是，會(huì)形成趨勢(shì)，將特別是具有分裂活性的細(xì)胞用于藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)和縮短觀察期。然而，正如從以上所述中不難解釋的那樣，這會(huì)導(dǎo)致結(jié)果更沒(méi)有說(shuō)服力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]因此，本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)用來(lái)進(jìn)行醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的人體或動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行制備的方法，可以通過(guò)該方法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行制備，該細(xì)胞培養(yǎng)物可以在更長(zhǎng)的時(shí)間里，特別是幾星期里都保持性能穩(wěn)定。因此可以在幾星期的時(shí)間間隔里對(duì)同一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。此外，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種采用本發(fā)明所述方法進(jìn)行制備的長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)物，然后可以在該細(xì)胞培養(yǎng)物上進(jìn)行所期望的醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)獨(dú)立權(quán)利要求所記載的特征解決了這個(gè)問(wèn)題?？蓮膹膶贆?quán)利要求中獲悉本發(fā)明的其他實(shí)施方式。
[0010]根據(jù)本發(fā)明，建議采用一種對(duì)用來(lái)進(jìn)行醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的人體或動(dòng)物細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行制備的方法，該方法至少包括以下步驟:
[0011]-將微生物制纖維素所制成的基底插入器皿中；
[0012]-將營(yíng)養(yǎng)素溶液加入器皿中；
[0013]-將人體或動(dòng)物細(xì)胞貼附在基底上；
[0014]-將器皿內(nèi)容物溫度調(diào)節(jié)至所規(guī)定的溫度，特別是調(diào)節(jié)至體溫；
[0015]-等待，直到基底完全被細(xì)胞集落覆蓋住，也就是說(shuō)，所有細(xì)胞進(jìn)行接觸和停止進(jìn)行分裂為止(視起始濃度和細(xì)胞種類而定，這可能持續(xù)幾天至數(shù)周)；
[0016]-優(yōu)選地，根據(jù)物質(zhì)代謝-參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞是否和何時(shí)達(dá)到能反映出它的特征的狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)并且
[0017]-將待試驗(yàn)的生物活性物質(zhì)輸入到位于基底上的細(xì)胞培養(yǎng)物中。
[0018]在將人體或動(dòng)物細(xì)胞淀積在微晶纖維素基底之后，會(huì)進(jìn)行細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)過(guò)程，在進(jìn)行該過(guò)程時(shí)，基底會(huì)逐漸被細(xì)胞所覆蓋。最優(yōu)地，在體溫，也就是在約37°C條件下進(jìn)行這個(gè)過(guò)程。因此，優(yōu)選地，在細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)過(guò)程中，將細(xì)胞培養(yǎng)物維持在約37°C的條件下。當(dāng)細(xì)胞如此密集地覆蓋在基底上，以至于細(xì)胞的外膜相互之間無(wú)縫隙地接觸，細(xì)胞停止分裂。分裂過(guò)程停止后，細(xì)胞需要一定的時(shí)間來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化和實(shí)現(xiàn)所謂的靜止的不分裂的表型?！办o止的不分裂的”這個(gè)表達(dá)此處僅僅是指不再進(jìn)行像細(xì)胞分裂時(shí)那樣較大的形態(tài)改變。在生物化學(xué)方面，這些細(xì)胞非常有活性和能產(chǎn)生例如對(duì)于其分化狀態(tài)來(lái)說(shuō)是典型的因子。在這種狀態(tài)下，細(xì)胞培養(yǎng)物在微生物制纖維素所制成的基底上數(shù)周內(nèi)是性能穩(wěn)定的。
[0019]在本發(fā)明所述方法的單個(gè)方法步驟方面應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是，不一定非得按照所給出的順序來(lái)實(shí)施。例如可以在將營(yíng)養(yǎng)素溶液加入器皿內(nèi)之前就將人體或動(dòng)物細(xì)胞貼附在基底上?？蛇x擇地，也可以先將營(yíng)養(yǎng)素溶液加入器皿內(nèi)和然后才插入基底。專業(yè)人員清楚，他可以在一定的范圍內(nèi)按照意愿對(duì)各個(gè)步驟的順序作出規(guī)定。
[0020]為了進(jìn)行儲(chǔ)存或運(yùn)輸，可以緩慢地將細(xì)胞冷卻至室溫例如15° -30°C，尤其是18° _25°C。沒(méi)有必要為了進(jìn)行儲(chǔ)存或運(yùn)輸而對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍，因?yàn)樗鼈冊(cè)谑覝叵乱材鼙３中阅芊€(wěn)定。
[0021]根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方式，主要由干細(xì)胞或是由干細(xì)胞所獲取的細(xì)胞、例如肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞或腎細(xì)胞，或是例如皮膚等其他器官的細(xì)胞來(lái)制備細(xì)胞培養(yǎng)物。因此可以對(duì)已知的詳細(xì)規(guī)定的細(xì)胞進(jìn)行醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。在由干細(xì)胞所獲取的細(xì)胞的情形下，例如可以借助在US 20030161818A1或US 2003 015 45 06 Al中所公開(kāi)的方法來(lái)對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行制備。在這種情況下，可以由人體臍帶組織來(lái)獲取干細(xì)胞。干細(xì)胞位于所謂的人臍帶華通膠中，一種膠凍樣間質(zhì)，富含透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素，也叫“華通氏膠”(Wharton’ sJelly) ο可以通過(guò)一種酶消化過(guò)程(例如利用膠原酶)從臍帶華通膠中提取干細(xì)胞。
[0022]二者擇一地，當(dāng)然也可以采用直接取自人體或動(dòng)物體的這種細(xì)胞。例如這可通過(guò)對(duì)骨髓或脂肪組織進(jìn)行活檢來(lái)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，例如采用直接來(lái)源于有關(guān)患者的細(xì)胞，進(jìn)而可以進(jìn)行個(gè)性化治療。
[0023]貼附在纖維素基底上的細(xì)胞主要是事先沒(méi)有已經(jīng)進(jìn)行傳代培養(yǎng)的這些細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)一次性細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)過(guò)程從原始細(xì)胞，所謂的原代細(xì)胞，例如干細(xì)胞或是由干細(xì)胞所獲取的沒(méi)有經(jīng)歷分化過(guò)程的細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。也就是說(shuō)，貼附在纖維素基底上的細(xì)胞主要是傳代數(shù)等于零的細(xì)胞?？蛇x地，但是也可以采用傳代數(shù)小于等于五的細(xì)胞。
[0024]沒(méi)有必要為了運(yùn)輸而像常見(jiàn)的那樣對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷凍；而是可以在環(huán)境溫度下，例如在15°和30°C之間進(jìn)行運(yùn)輸。但是溫度也可以更高或是更低。
[0025]當(dāng)環(huán)境溫度在理想的范圍內(nèi)時(shí)，例如在15°和30°C之間時(shí)，讓細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行簡(jiǎn)單的冷卻是夠用的(沒(méi)有使用冷卻裝置)。但是也可以主動(dòng)地，也就是說(shuō)，利用冷卻裝置將細(xì)胞培養(yǎng)物冷卻降至所需要的溫度。
[0026]根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方式，器皿配備有一個(gè)密封鎖扣，例如一個(gè)薄膜或是一個(gè)頂蓋。密封鎖扣應(yīng)尤其能防止例如液體或氣體等培養(yǎng)基進(jìn)入器皿中或是從器皿中逸出。原則上，可以在冷卻之前或之后對(duì)器皿進(jìn)行密封，但是以事先進(jìn)行為宜。
[0027]根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方式，利用一個(gè)薄膜對(duì)器皿進(jìn)行密封，該薄膜例如是與器皿焊接或粘合在一起的。二者擇一地或者額外地也可以預(yù)先規(guī)定一個(gè)頂蓋，該頂蓋將器皿蓋住。
[0028]為了然后能將其例如寄送給實(shí)驗(yàn)室或是客戶，最后還可以對(duì)內(nèi)部裝有細(xì)胞培養(yǎng)物的器皿進(jìn)行包裝，該客戶然后可以對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行醫(yī)學(xué)或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。包裝例如可以包括一個(gè)盒子和絕緣材料。包裝也可以包括一種冷卻劑。
[0029]為了特別是能通過(guò)郵寄對(duì)制備后的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行后續(xù)運(yùn)輸，或是保護(hù)其不遭受機(jī)械載荷和撞擊，建議在器皿中加入一種能提高營(yíng)養(yǎng)素溶液粘度的物質(zhì)或是一種具有比營(yíng)養(yǎng)素溶液更高粘度的物質(zhì)。根據(jù)第一個(gè)二者擇一的方案，例如可以在營(yíng)養(yǎng)素溶液中摻入亞甲基纖維素、聚乙二醇或是其他能提高粘度的物質(zhì)。根據(jù)第二個(gè)二者擇一的方案，也可以在器皿中加入一種粘性更高的物質(zhì)，例如一種凍膠狀物質(zhì)。但是也可以在細(xì)胞培養(yǎng)物上放置一個(gè)固體，例如一個(gè)微晶纖維素體。這樣細(xì)胞培養(yǎng)物就可以粘附在器皿的底部和難以翻向一側(cè)或是浮起。
[0030]根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方式，不對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞進(jìn)行傳代，也就是說(shuō)，優(yōu)先地，細(xì)胞集落不進(jìn)行脫落和細(xì)胞并沒(méi)有像現(xiàn)有技術(shù)那樣進(jìn)行分離和然后重新貼附在另一個(gè)基底上進(jìn)行重新的細(xì)胞分裂。細(xì)胞培養(yǎng)物更優(yōu)選為通過(guò)一次性細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)過(guò)程由原始細(xì)胞，也就是說(shuō)由事前沒(méi)有進(jìn)行傳代的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行制備。
[0031]優(yōu)選地，在同一個(gè)對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)的器皿中對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行包裝和需要時(shí)，寄送給一個(gè)收件人。不必非得將它轉(zhuǎn)裝到其他器皿中。
[0032]根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方式，在一個(gè)微滴定培養(yǎng)板上進(jìn)行前面已提到的方法，該微滴定培養(yǎng)板具有大量深孔。在每個(gè)深孔中插入有微生物制纖維素所制成的基底，加入有營(yíng)養(yǎng)素溶液和將人體或動(dòng)物細(xì)胞貼附在基底上。然后細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)和分裂，直到基底至少被部分覆蓋住為止。在微滴定培養(yǎng)板的各個(gè)深孔中最終會(huì)分布有一部分同一種細(xì)胞培養(yǎng)物。然后可以采用各個(gè)部分培養(yǎng)物進(jìn)行同一種或是不同的醫(yī)學(xué)以及藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0033]細(xì)胞培養(yǎng)物的儲(chǔ)存或運(yùn)輸優(yōu)選地在環(huán)境溫度下進(jìn)行。沒(méi)有必要像通常的那