DE160突變的人類胚胎干細胞-肥厚型心肌病心肌細胞加入了兒茶酚胺類小分子藥物腎上腺素，觀察到腎上腺素對肥厚型心肌病心肌細胞有正性肌力作用，但是造成這些細胞的電活動異常，產(chǎn)生了心律失常。加入腎上腺素受體阻滯劑美托洛爾(metoprolol)后，對腎上腺素致肥厚型心肌病心肌細胞心律失常的作用起到了很好的阻滯效果。
[0095]實施例3
[0096]藥物的心臟毒性是阻礙藥物發(fā)展的關(guān)鍵因素，基于轉(zhuǎn)基因細胞及動物的藥物心臟毒性篩選，往往存在一些假陰性及假陽性的結(jié)果，導致不必要的死亡，而且藥物的心臟毒性效應更易發(fā)生在有基礎(chǔ)心臟病變的患者。通過上述方法可以構(gòu)建一系列人多能干細胞-遺傳性心肌病心肌細胞，其含有人類正常心肌細胞表面所有的離子通道，可以反映離子通道間復雜的相互作用，更精確地預測藥物的心臟毒性，成為良好的藥物毒性篩選的平臺。
[0097]實施例4
[0098]利用上述方法得到的人多能干細胞-遺傳性心肌病心肌細胞，結(jié)合組織工程學技術(shù)，可以進一步體外重建正常人類和遺傳性心肌病的人類心室肌組織，從組織層面深入研究遺傳性心肌病突變對心室肌發(fā)育和功能的影響及遺傳性心肌病的基本病理過程。例如，由自然心臟基質(zhì)和多種人類細胞制備的組織工程心肌組織；該組織工程心肌組織通過臨床轉(zhuǎn)化后，可用于1)體外檢測各類藥物對人類心臟組織的毒性作用；2)治療或替代心肌梗死后的壞死心肌組織。這種組織工程化人類心肌組織由去細胞化的自然心臟基質(zhì)作為支架，接種有人多能干細胞_遺傳性心肌病多能干細胞分化來源的正常心臟的各種細胞成分制成。構(gòu)建的組織工程化心肌組織將去細胞化的大鼠或豬的心臟為自然心臟基質(zhì)作為工程化心肌組織基質(zhì)，將去細胞化的基質(zhì)架構(gòu)后，制得不同尺寸和外形的心臟基質(zhì)片段，將人多能干細胞-遺傳性心肌病多能干細胞定向分化為心血管系統(tǒng)細胞和人的脂肪組織提取的脂肪干細胞與大鼠或豬心臟基質(zhì)結(jié)合培養(yǎng)，制成有功能的工程化人類心臟組織。這種組織工程化人類心肌組織具有與正常人類心肌組織相似的細胞組分、細胞外基質(zhì)及生物學功能，可以進行體外藥物的測試和篩選、初步的臨床前期小動物的體內(nèi)移植研究和治療療效觀察，最終為實現(xiàn)人類心血管疾病的個體化治療提供有意義的輔助。
[0099]更具體的，通過下述技術(shù)方案和步驟實現(xiàn):
[0100]A.取去細胞化得大鼠或豬心臟，獲得自然心臟基質(zhì)；
[0101]B.將去細胞化的大鼠或豬心臟基質(zhì)按需制成形狀、尺寸不同的基材；
[0102]C.根據(jù)本發(fā)明獲得人多能干細胞_遺傳性心肌病多能干細胞，定向分化為該人類的心血管系統(tǒng)細胞
[0103]D.將分化后的誘導多能干細胞來源的心肌細胞進行純化，使其比例達到95%以上，制成種子細胞1 ;
[0104]E、分離相同個體的脂肪干細胞，體外培養(yǎng)，制成種子細胞2 ;
[0105]F、將種子細胞1和種子細胞2混合后接種于去細胞化的大鼠或豬心臟基質(zhì)上，體外三維培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程化心肌組織。
[0106]脂肪干細胞的分離和培養(yǎng):將所得同一個體的脂肪組織以PBS液沖洗兩遍，剪碎，II型膠原酶37°C消化；FBS終止消化，離心，棄上清，細胞重懸于PBS中，過濾，所得濾液離心，棄上清，DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，種于培養(yǎng)皿中37°C，5% C02恒溫箱中培養(yǎng)，2_3日換一次培養(yǎng)液，直到細胞融合至60% -75%密度時傳代；
[0107]將純化后的人多能干細胞_遺傳性心肌病心肌細胞和脂肪干細胞接種到所采用的的大小、形狀不同的大鼠或豬去細胞化心臟基質(zhì)上，經(jīng)體外三維培養(yǎng)，構(gòu)建不同形狀和尺寸的組織工程化心肌組織。采用去細胞化的自然心臟基質(zhì)作為心肌組織基質(zhì)，具有良好生物相容性、力學性能和生物降解性。所制得的組織工程化心肌組織與正常心肌組織相似，具有正常心臟的各種細胞成分、細胞外基質(zhì)及生物學活性。制得的組織工程化人類心肌組織具有與正常人類心肌組織相似細胞成分和電生理功能，既保持一定的機械強度，基本力學性能，又具有合理的孔隙率，良好的細胞相容性，生物降解性，不會引起炎癥反應，是一種可以用于移植的具有生物學活性的活組織?？蛇M一步用于進行體外藥物的測試和篩選，以及初步的臨床前期小動物的體內(nèi)移植研究和治療療效觀察，最終對實現(xiàn)人類心血管疾病的個體化治療提供有意義的輔助。
【主權(quán)項】
1.一種人類遺傳性心肌病-多能干細胞，其特征在于，通過下述方法制備，利用新型的TALEN或CRISPR/CAS9基因組編輯技術(shù)，通過基因重組方法編輯人類多能干細胞基因組，構(gòu)建人類遺傳性心肌病-多能干細胞疾病細胞株；其包括步驟: A、構(gòu)建針對不同靶基因的TALEN或CRISPR/CAS9質(zhì)粒，所述靶基因突變導致遺傳性心肌?。? B、構(gòu)建帶有步驟A所述導致不同遺傳性心肌病的各種相應基因突變的同源基因供體質(zhì)粒； C、培養(yǎng)良好的未分化的人類胚胎干細胞或體外重編程正常人類個體的體細胞為誘導多能性干細胞； D、將步驟A獲得的TALEN或CRISPR/CAS9質(zhì)粒與步驟B獲得的帶有相應突變的同源基因供體質(zhì)粒共電轉(zhuǎn)人類多能干細胞，通過基因重組導入將遺傳性心肌病的特異突變導入人類胚胎干細胞或誘導多能性干細胞； E、利用Puromycin藥物篩選出雜合或純合的遺傳性心肌病多能干細胞，并建立相應細胞株。2.按權(quán)利要求1所述的人類遺傳性心肌病-多能干細胞細胞，其特征在于，所述的細胞株為各種帶有導致人類遺傳性心肌病基因突變的人類胚胎干細胞和人類誘導多能干細胞。3.按權(quán)利要求1或者2所述的人類遺傳性心肌病-多能干細胞細胞，其特征在于，人類遺傳性心肌病-多能干細胞通過多能干細胞定向分化心肌細胞技術(shù)得到的相應的人類遺傳性心肌病變心肌細胞。4.如權(quán)利要求1所述的人類遺傳性心肌病-多能干細胞細胞，其特征在于，所述的制備方法中，將篩選出的遺傳性心肌病-多能干細胞定向分化為遺傳性心肌病疾病特異的心肌細胞。5.如權(quán)利要求4所述的人類遺傳性心肌病-多能干細胞細胞，其特征在于，所述的制備方法中，將分化后的人類遺傳性心肌病特異的心肌細胞進行純化，使其比例達到95%以上。6.如權(quán)利要求4所述的人類遺傳性心肌病-多能干細胞細胞，其特征在于，所述的制備方法中，將分化后的人類遺傳性心肌病特異的心肌細胞進行相應疾病表型的驗證。7.權(quán)利要求1所述的人類遺傳性心肌病-多能干細胞在用于制備通過多能干細胞定向分化心肌細胞技術(shù)得到人類遺傳性心肌病變心肌細胞中的應用。8.權(quán)利要求1所述的人類遺傳性心肌病-多能干細胞在用于制備體外人類遺傳性心肌病疾病心肌組織中的用途，其中，將分化獲得的人類遺傳性心肌病變心肌細胞與任意支架材料結(jié)合，培養(yǎng)形成各類體外人類遺傳性心肌病疾病心肌組織。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學研究與應用領(lǐng)域，具體涉及人類多能干細胞-遺傳性心肌病心肌細胞及其制備技術(shù)。本發(fā)明提供了一種人類遺傳性心肌病-多能干細胞，利用TALEN或CRISPR/CAS9基因組編輯技術(shù)，構(gòu)建人類遺傳性心肌病多能干細胞。本發(fā)明制得的人類遺傳性心肌病變心肌細胞，可以與任意支架材料結(jié)合培養(yǎng)形成的各類體外人類遺傳性心肌病疾病心肌組織。本發(fā)明的人類遺傳性心肌病的疾病心肌細胞具備與人類遺傳性心肌病患者心肌細胞相似的疾病表型及電生理改變，來源廣泛，且能長期體外培養(yǎng)。為尋求有效、新型的治療手段和篩選有效的相應治療藥物提供了良好的工具和平臺。
【IPC分類】C12N15/85, C12N5/10
【公開號】CN105039399
【申請?zhí)枴緾N201510198437
【發(fā)明人】孫寧, 詹永坤, 李賓
【申請人】復旦大學
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年4月21日