隆，有陽性條帶的證明突變同源基因已插入正確位點(diǎn)；C，OCR產(chǎn)物測序顯示一條染色體上的TNNT基因DE160位點(diǎn)已被成功刪除。
[0060]圖5，TNNT2 DE160刪除突變多能干細(xì)胞克隆定向分化為心肌細(xì)胞，顯示帶有DE160刪除的心肌細(xì)胞具有肥厚型心肌病心肌細(xì)胞的表型，
[0061]其中，A，免疫熒光顯示DE160心肌細(xì)胞比正常心肌細(xì)胞肥大，肌絲結(jié)構(gòu)排列紊舌L ；
[0062]B，RT-PCR顯示肥厚型心肌病相關(guān)基因表達(dá)升高，與肥厚型心肌病表型相符合；
[0063]C，MEA顯示與正常心肌細(xì)胞相比，DE160心肌細(xì)胞收縮節(jié)律出現(xiàn)異常；
[0064]D，DE160心肌細(xì)胞對鈣離子通道阻滯劑Verapamil有更高的耐受性，具有肥厚性心肌病相似的電生理特性；
[0065]E，視頻記錄顯示隨著誘導(dǎo)分化正常心肌細(xì)胞收縮頻率逐漸加快，DE160雜合心肌細(xì)胞收縮頻率逐漸減慢，可能是其心肌細(xì)胞逐漸失代償?shù)慕Y(jié)果，而DE160純合心肌細(xì)胞喪失收縮功能；原子力顯微系統(tǒng)測試心肌細(xì)胞收縮力顯示DE160心肌細(xì)胞收縮力略有提高，符合肥厚型心肌病表型。
【具體實(shí)施方式】
[0066]本發(fā)明采用已知的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)或常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)(CRISPR/CAS9)基因組編輯技術(shù)，編輯人類多能干細(xì)胞(包括人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells)及人類誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(human inducedpluripotent stem cells))的基因組，根據(jù)不同的基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)革El向特異的TALEN或CRISPR/CAS9質(zhì)粒，通過基因組編輯技術(shù)介導(dǎo)基因重組，將能導(dǎo)致人類家族性遺傳性心肌病的基因突變，導(dǎo)入人類多能干細(xì)胞基因組并替換相對應(yīng)的正?；?，建立不同基因突變導(dǎo)致的各類人類遺傳性心肌病的多能干細(xì)胞疾病模型和多能干細(xì)胞細(xì)胞株。
[0067]理論上本發(fā)明可以針對任意基因的突變所造成的人類遺傳性心肌病制備相對應(yīng)的多能干細(xì)胞模型與細(xì)胞株。再通過已知的多能干細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞技術(shù)，進(jìn)而制備不同人類遺傳性心肌病的病變心肌細(xì)胞。
[0068]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案和步驟實(shí)現(xiàn)的:
[0069]A、構(gòu)建針對不同基因突變靶點(diǎn)的TALEN或CRISPR/CAS9質(zhì)粒，并檢測其對靶基因的剪切活性；
[0070]B、構(gòu)建帶有相應(yīng)突變的同源基因供體質(zhì)粒；
[0071]C、培養(yǎng)良好的未分化的人類胚胎干細(xì)胞或正常人類個(gè)體的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞；
[0072]D、將活性高的TALEN或CRISPR/CAS9質(zhì)粒與帶有相應(yīng)突變的同源基因供體質(zhì)粒共電擊轉(zhuǎn)染進(jìn)入人類多能干細(xì)胞(包括胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞)，通過基因重組將導(dǎo)致遺傳性心肌病的特異突變導(dǎo)入人類多能干細(xì)胞基因組；
[0073]E、摸索合適的篩選藥物(如嘌呤霉素Puromycin)濃度篩選出雜合或純合的遺傳性心肌病多能干細(xì)胞系；
[0074]F、將篩選出的人類遺傳性心肌病多能干細(xì)胞定向分化為人類遺傳性心肌病疾病特異的心肌細(xì)胞；
[0075]G、將分化后的人類遺傳性心肌病特異的心肌細(xì)胞進(jìn)行純化，使其比例達(dá)到95%以上，驗(yàn)證表型并進(jìn)行功能及機(jī)制的研究。
[0076]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有描述，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有完整的描述:例如，Sambrook《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第2版(1989);《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編輯，1984)；《蛋白質(zhì)純化》((Richard R.Burgess)，或者可按照試劑生產(chǎn)商所提供的說明書進(jìn)行。
[0077]實(shí)施例1
[0078]1) TALEN或CRISPR/CAS9質(zhì)粒及帶有相應(yīng)突變的同源基因供體質(zhì)粒的構(gòu)建
[0079]在骨架質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，構(gòu)建針對不同突變靶點(diǎn)的TALEN或CRISPR/CAS9質(zhì)粒及帶有相應(yīng)突變的同源基因供體質(zhì)粒。例如HCM(DE160、R403Q)，DCM(DK210、E244D)，RCM(R145W、I79N)，LVNC(L301Q、R131W)，ARVC (Q62K、D1373A)等，TALEN 及突變同源基因質(zhì)粒構(gòu)建(如圖1，圖2圖例所不)；
[0080]2)針對不同靶點(diǎn)TALEN或CRISPR/CAS9質(zhì)粒的活性檢測
[0081]用TALEN或CRISPR/CAS9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，提取Puromycin篩選后存活細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行PCR，通過觀察套峰強(qiáng)弱、T7E1錯(cuò)配酶酶切效率及TA克隆測序比例檢測活性(如圖3所示);
[0082]3)將活性高的TALEN或CRISPR/CAS9質(zhì)粒與Donor質(zhì)粒共電轉(zhuǎn)人類多能干細(xì)胞
[0083]人類多能性干細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C含5% 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞長滿后，Accutase消化，計(jì)數(shù)合適的細(xì)胞量，加入相應(yīng)比例的TALEN或CRISPR/CAS9與Donor質(zhì)粒，選用合適的電壓、脈沖強(qiáng)度及脈沖次數(shù)進(jìn)行電轉(zhuǎn)；
[0084]4)篩選雜合或純合的遺傳性心肌病多能干細(xì)胞系
[0085]挑選Puromycin篩選后存活的克隆，提取基因組DNA，利用PCR、TA克隆測序及Southern Blot等分子生物學(xué)方法鑒定雜合或純合的遺傳性心肌病多能干細(xì)胞系細(xì)胞株(如圖4所示);
[0086]5)體外培養(yǎng)人類正常及遺傳性心肌病多能性干細(xì)胞、分化心肌細(xì)胞
[0087]采用誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞培養(yǎng)液(購于Stemcell Technolgy公司)，37°C含5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞長滿后，聯(lián)合運(yùn)用Wnt通路的促進(jìn)劑和抑制劑使其向心肌細(xì)胞定向分化；所述的促進(jìn)劑為小分子化合物CHIR99021 (可于Selleck公司購買)，抑制劑為小分子化合物IWR-1 (可于Selleck公司購買)。
[0088]6)心肌細(xì)胞純化
[0089]分化20天后，用純化心肌細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)基(不含葡萄糖的普通DMEM培養(yǎng)基，可購自CELLGR0公司)培養(yǎng)，得到純度較高的心肌細(xì)胞；
[0090]7)心肌細(xì)胞表型鑒定及功能、機(jī)制研究
[0091]利用免疫熒光、膜片鉗、鈣瞬變等方法驗(yàn)證誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞具備與正常成人或遺傳性心肌病患者心肌細(xì)胞相似的表型及電生理特性(如圖5所示)；然后采用Microarray結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜分析，將全基因組表達(dá)改變與疾病表型連接起來，研究疾病的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。
[0092]按本發(fā)明上述方法得到的人類多能干細(xì)胞-遺傳性心肌病心肌心肌細(xì)胞具有與人類遺傳性心肌病患者心肌細(xì)胞相似的疾病表型及電生理改變，既來源廣泛又能長期體外培養(yǎng)，解決了人類病變心肌組織來源稀少且不易長期體外培養(yǎng)的弊端，而且可以研究遺傳性心肌病的早期發(fā)病機(jī)制。
[0093]實(shí)施例2
[0094]通過上述方法得到的人多能干細(xì)胞-遺傳性心肌病心肌細(xì)胞，利用多電極微陣列手段可檢測其收縮功能和電生理特性；進(jìn)一步，在該心肌細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中加入不同小分子化學(xué)藥物或中草藥制劑等，可通過多電極微陣列系統(tǒng)檢測其收縮功能和電生理功能變化，預(yù)測所測試小分子化學(xué)藥物或中草藥制劑可能對人體心臟組織的功能影響，篩選新型、有效的治療藥物；例如圖5顯示了，本發(fā)明對攜帶TNNT2