多能干細胞-遺傳性心肌病心肌細胞及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬生物醫(yī)學研究與應用領域，具體涉及人類多能干細胞-遺傳性心肌病心肌細胞及其制備技術。
【背景技術】
[0002]人類遺傳性心肌病包括五種心肌病:肥厚型心肌病(hypertrophiccard1myopathy, HCM)、擴張型心肌病(dilated card1myopathy, DCM)、限制型心肌病(restricted card1myopathy)、左心室致密化不全型心肌病(left ventricularnoncompact1n, LVNC)及致心率失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventricularcard1myopathy, ARVC)，是由多種單一基因突變造成的重大心臟疾病。這些單一基因包括表達肌小節(jié)蛋白、細胞骨架蛋白、離子通道蛋白、核纖層蛋白、線粒體蛋白的基因，如肌球蛋白重鏈MHC、肌球蛋白輕鏈MLC、肌鈣蛋白TNNT2、肌球蛋白結合蛋白MBPC3、鈉離子通道蛋白SCN5a、鉀離子通道蛋白KCNH2、核纖層蛋白Iamin等(詳細描述請見Morita H and SeidmanCE, Journal of Clinical Investigat1n, 2005)。這些基因上的不同位點發(fā)生突變后，可以導致遺傳性心肌病的發(fā)生。需要注意的是，同一基因上不同位點發(fā)生突變后，可以導致相同類型的遺傳性心肌病，也可以導致發(fā)生不同類型的遺傳性心肌病。例如肌鈣蛋白TNNT2基因R92Q與DE160突變均導致肥厚型心肌病，而TNNT2 R141W導致擴張型心肌病。
[0003]目前對于遺傳性心肌病并無有效的、針對疾病本質的、特定治療手段或治療藥物?，F今臨床上的治療措施以預防心源性猝死和改善心功能為主，但僅僅能改善患者的一些臨床癥狀，并不直接針對遺傳性心肌病的發(fā)病機制而起到明顯的治愈效果，也不改變心肌病的自然病史。因此，尋找導致遺傳性心肌病的早期的分子通路，進一步搞清發(fā)病機制，對于開發(fā)有效、新型的治療藥物至關重要。
[0004]但是目前對于遺傳性心肌病疾病機制的研究進展緩慢。這主要是由于缺乏能大量方便獲取的且能忠實重現疾病過程的疾病模型。
[0005]從患者的心臟活體獲取遺傳性心肌病的病變人類心肌細胞非常困難，因為來源非常稀少且在體外不易長期存活，并且這些病變心肌細胞已經處于疾病的晚期，對于疾病發(fā)生的早期機制研究并無太多作用。雖然遺傳性心肌病的轉基因動物模型也已經建立，并且對遺傳性心肌病的研究起到了重要作用，但是動物模型由于其心臟的生理功能及分子基礎與人類有較大差別(比如小鼠的心率達500次/秒，是人的10倍)，無法完全重現人類疾病表型，并且針對遺傳性心肌病動物模型的研究也多集中于疾病晚期，并不能作為疾病早期階段心肌肌小節(jié)導致何種病變的有效研究對象。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服上述現有遺傳性心肌病疾病模型的限制，利用TALEN或CR ISPR/CAS9基因編輯技術介導基因重組，將能導致人類家族性遺傳性心肌病的基因突變，導入人類多能干細胞(包括人類胚胎干細胞和誘導多能性干細胞)基因組并替換相對應的正?；颍⑷诉z傳性心肌病多能干細胞疾病細胞株，進而通過多能干細胞定向分化心肌細胞技術(該技術為已公開的成熟技術，具體實施步驟見Lian et al., NatureProtocols, 2012 ;8:162-75)，制備可用于研究與應用的人類遺傳性心肌病疾病心肌細胞。
[0007]本發(fā)明提供了一種建立各種人類遺傳性心肌病特異的多能干細胞細胞株方法，利用新型的TALEN或CRISPR/CAS9基因組編輯技術，通過基因重組方法編輯人類多能干細胞基因組，構建人類遺傳性心肌病多能干細胞。
[0008]具體而言，本發(fā)明的人類遺傳性心肌病_多能干細胞建立方法，其特征在于，利用新型的TALEN或CRISPR/CAS9基因組編輯技術，通過基因重組方法編輯人類多能干細胞基因組，構建人類遺傳性心肌病_多能干細胞疾病細胞株；其包括步驟:
[0009]A、構建針對不同靶基因(該靶基因突變導致遺傳性心肌病，描述見【背景技術】第一段)的 TALEN 或 CRISPR/CAS9 質粒；
[0010]B、構建帶有步驟A所述導致不同遺傳性心肌病的各種相應基因突變的同源基因供體質粒；
[0011]C、培養(yǎng)良好的未分化的人類胚胎干細胞或體外重編程正常人類個體的體細胞為誘導多能性干細胞；
[0012]D、將步驟A獲得的TALEN或CRISPR/CAS9質粒與步驟B獲得的帶有相應突變的同源基因供體質粒共電轉人類多能干細胞，通過基因重組導入將遺傳性心肌病的特異突變導入人類胚胎干細胞或誘導多能性干細胞；
[0013]E、利用Puromycin藥物篩選出雜合或純合的遺傳性心肌病多能干細胞，并建立相應細胞株。
[0014]本發(fā)明中，所述的細胞株為各種帶有導致人類遺傳性心肌病基因突變的人類胚胎干細胞和人類誘導多能干細胞。
[0015]本發(fā)明中，人類遺傳性心肌病_多能干細胞通過多能干細胞定向分化心肌細胞技術(該技術為已公開的成熟技術，具體實施步驟見Lian et al., Nature Protocols, 2012 ；8:162-75)得到的相應的人類遺傳性心肌病變心肌細胞。
[0016]本發(fā)明的人類遺傳性心肌病_多能干細胞細胞的制備方法中，將篩選出的遺傳性心肌病_多能干細胞定向分化為遺傳性心肌病_疾病特異的心肌細胞。
[0017]本發(fā)明的人類遺傳性心肌病_多能干細胞細胞的制備方法中，將分化后的人類遺傳性心肌病特異的心肌細胞進行純化，使其比例達到95%以上。
[0018]本發(fā)明的人類遺傳性心肌病_多能干細胞細胞的制備方法中，將分化后的人類遺傳性心肌病特異的心肌細胞進行相應疾病表型的驗證。
[0019]進一步，本發(fā)明的人類遺傳性心肌病_多能干細胞可用于通過多能干細胞定向分化心肌細胞技術制備得到人類遺傳性心肌病變心肌細胞。
[0020]以及，所述的人類遺傳性心肌病_多能干細胞在用于制備體外人類遺傳性心肌病疾病心肌組織，其中，將分化獲得的人類遺傳性心肌病變心肌細胞與任意支架材料結合，培養(yǎng)形成各類體外人類遺傳性心肌病疾病心肌組織。
[0021]本發(fā)明提供了上述人類遺傳性心肌病_多能干細胞的制備方法，即利用TALEN或CRISPR/CAS9基因組編輯技術，通過基因重組方法編輯人類多能干細胞基因組，構建人類遺傳性心肌病多能干細胞疾病模型。
[0022]本發(fā)明采用分子生物學方法構建針對不同基因突變靶位點的TALEN或CRISPR/CAS9質粒及帶有相應突變和藥物篩選基因的同源基因供體質粒，將二者共電擊轉染進入人類多能干細胞(包括人類胚胎干細胞human embryonic stem cells及人類誘導性多功能干細胞(human induced pluripotent stem cells))，通過基因重組導入導致遺傳性心肌病的特異突變；進而通過嘌呤霉素(Puromycin)等藥物篩選出雜合或純合的遺傳性心肌病多能干細胞系，通過已知的多能干細胞定向分化心肌細胞技術，將其定向分化為人類遺傳性心肌病疾病特異的心肌細胞；從而進行相關的功能研究，探索導致遺傳性心肌病的早期分子通路，進一步搞清發(fā)病機制，尋求新型、有效的治療手段和藥物篩選。
[0023]更具體的，本發(fā)明的人類遺傳性心肌病-多能干細胞的制備方法，包括步驟如下:
[0024]I) TALEN或CRISPR/CAS9質粒