及帶有相應突變的同源基因供體質粒的構建，
[0025]在TALEN或CRISPR/CAS9骨架質粒的基礎上，利用PCR、限制性內切酶、連接酶、點突變等分子生物學方法構建針對不同基因突變靶點的TALEN或CRISPR/CAS9質粒(該質粒帶有嘌呤霉素(puromycin)抗性基因，可用于篩選接受了該質粒的陽性細胞克隆)，同時構建帶有相應突變的同源基因供體質粒；
[0026]2)針對不同靶點TALEN或CRISPR/CAS9質粒的活性檢測
[0027]用TALEN或CRISPR/CAS9質粒轉染293T細胞，提取嘌呤霉素篩選后存活細胞的基因組DNA進行PCR，通過觀察DNA測序結果的套峰強弱、T7E1錯配酶酶切效率及TA克隆測序比例檢測活性；
[0028]3)將活性高的TALEN或CRISPR/CAS9質粒與帶有相應突變的同源基因供體質粒共電擊轉染進入人類多能干細胞
[0029]人類多能性干細胞培養(yǎng)液，37°C含5% 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞長滿后，Accutase消化，計數(shù)合適的細胞量，加入相應比例的TALEN或CRISPR/CAS9與帶有相應突變的同源基因供體質粒，選用合適的電壓、脈沖強度及脈沖次數(shù)進行電轉；針對不同多能干細胞細胞系，所選用的電壓、脈沖強度及脈沖次數(shù)需要經過實驗確定最佳數(shù)值，電壓范圍一般在1100暈伏-1400 _伏，脈沖范圍一般為0.5-2 _安，脈沖次數(shù)一般為1-3次。
[0030]4)篩選雜合或純合的遺傳性心肌病多能干細胞系
[0031]挑選嘌呤霉素篩選后存活的克隆，提取基因組DNA，利用PCR、TA克隆測序及Southern Blot等分子生物學方法鑒定雜合或純合的遺傳性心肌病多能干細胞系；
[0032]5)體外培養(yǎng)人類正常及遺傳性心肌病多能性干細胞、分化心肌細胞
[0033]采用專業(yè)的誘導多能性干細胞培養(yǎng)液(可于生物試劑市場上購買，如加拿大Stemcell Technology公司)，在37°C含5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)內培養(yǎng)人類多能性干細胞，細胞長滿后，運用已知方法，聯(lián)合運用Wnt通路的促進劑(小分子藥物CHIR99021)和抑制劑(小分子藥物IWR-1)使其向心肌細胞定向分化；
[0034]6)心肌細胞純化:
[0035]分化20天后，用已知的純化心肌細胞的選擇性培養(yǎng)基(不含葡萄糖的普通DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)，得到純度較高(大于90% )的心肌細胞；
[0036]7)心肌細胞表型鑒定及功能、機制研究
[0037]利用免疫熒光、膜片鉗、多電極微陣列、鈣瞬變等方法驗證誘導分化的心肌細胞具備與正常成人或遺傳性心肌病患者心肌細胞相似的表型及電生理特性，然后采用基因表達芯片結合蛋白質組學和質譜分析，將全基因組表達改變與疾病表型連接起來，研究疾病的發(fā)病機制和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。
[0038]另一方面，本發(fā)明提供了人類遺傳性心肌病_多能干細胞的應用，通過多能干細胞定向分化心肌細胞技術得到的人類遺傳性心肌病病變心肌細胞。
[0039]獲得的各類人類遺傳性心肌病變心肌細胞可以用于建立針對不同致病基因突變導致的人類遺傳性心肌病的體外藥物評價及篩選體系。
[0040]還可以將分化獲得的人類遺傳性心肌病變心肌細胞與任意支架材料結合培養(yǎng)形成的各類體外人類遺傳性心肌病疾病心肌組織。例如，可以采用去細胞化的動物心臟基質作為支架材料，結合分化獲得的人類遺傳性心肌病變心肌細胞，制備各類體外人類遺傳性心肌病疾病心肌組織。
[0041]本發(fā)明最終的產品是不同基因突變導致的肥厚型心肌病、擴張型心肌病、限制型心肌病、左心室致密化不全型心肌病及致心率失常性右室心肌病等的人類遺傳性心肌病的疾病心肌細胞及由其構建的相應疾病人類心肌組織。
[0042]本發(fā)明的人類遺傳性心肌病的疾病心肌細胞具備與人類遺傳性心肌病患者心肌細胞相似的疾病表型及電生理改變，來源廣泛，且能長期體外培養(yǎng)。
[0043]本發(fā)明采用已知的轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALEN)或常間回文重復序列叢集關聯(lián)蛋白系統(tǒng)(CRISPR/CAS9)基因組編輯技術，編輯人類多能干細胞(包括人類胚胎干細胞human embryonic stem cells及人類誘導性多功能干細胞(human inducedpluripotent stem cells))的基因組，將能導致人類家族性遺傳性心肌病的基因突變，導入人類多能干細胞基因組并替換相對應的正常基因，建立人類遺傳性心肌病多能干細胞疾病模型，再通過已知的多能干細胞定向分化心肌細胞技術，進而制備帶有致病性遺傳突變的人類遺傳性心肌病疾病心肌細胞，用于:
[0044]1)體外外模擬人類遺傳性心肌病的發(fā)生；
[0045]2)探尋導致人類遺傳性心肌病的早期分子通路及其發(fā)病機制；
[0046]3)尋求人類遺傳性心肌病的新型、有效的治療靶點；
[0047]4)建立針對不同致病基因突變導致的人類遺傳性心肌病的體外藥物評價及篩選體系；
[0048]5)體外重建人類遺傳性心肌病的疾病心肌組織。
[0049]本發(fā)明利用TALEN或CRISPR/CAS9基因重組技術獲得的人多能干細胞-遺傳性心肌病心肌細胞，具有遺傳性心肌病相似的表型及電生理特性。
[0050]本發(fā)明可以根據不同的基因突變位點設計不同的TALEN或CRISPR/CAS9質粒及帶有相應突變的同源基因供體質粒，構建各種類型的人類遺傳性心肌病的多能干細胞株，再通過已知的人類多能干細胞定向分化心肌細胞技術，獲得大量的不同類別的人類遺傳性心肌病病變心肌細胞，來源廣泛，且能長期體外培養(yǎng)，為研究疾病機制及藥物篩選提供良好的工具。
[0051]本發(fā)明的人類多能干細胞_遺傳性心肌病心肌細胞具有與人類遺傳性心肌病患者心肌細胞相似的疾病表型及電生理改變，可進一步與不同支架和基質材料相結合，制造相應不同的人類遺傳性心肌病的人類病變心肌組織，為探尋各種基因突變導致的不同遺傳性心肌病的早期分子通路，進一步搞清發(fā)病機制，尋求有效、新型的治療手段和篩選有效的相應治療藥物提供了良好的工具和平臺。
【附圖說明】
[0052]圖1，突變同源基因供體質粒構建，其中，
[0053]以能夠導致肥厚型心肌病與擴張型心肌病的肌鈣蛋白TNNT2基因為例，將第160位谷氨酸刪除(Delet1n of E160, DE160)(已知該突變能夠導致遺傳性肥厚型心肌病，詳細描述可見Watkins et al., New England Journal of Medicine, 1995 ;332:1058-64)，造成突變，藥篩基因嘌呤霉素插入左右同源臂中間。
[0054]圖2，引物設計方案，其中，
[0055]DE160位于TNNT2基因的第12位外顯子中，圍繞DE160突變位點，設計左右共6對的 TALEN(L1-3, R1-2)。
[0056]圖3，TALEN質粒切割TNNT2 DE160位點附近DNA效率檢測，其中顯示了，
[0057]DNA剪切一般發(fā)生在雙染色體當中的一個，由于基因組修復過程中會產生核苷酸的增加或刪除，因此PCR測序可發(fā)現(xiàn)有序列套峰出現(xiàn)，提示一個染色體中的靶DNA被剪切，T7EI檢測可測試錯配的DNA情況，T7EI可將錯配DNA切割，電泳后出現(xiàn)兩條條帶。
[0058]圖4，TALEN基因組編輯后篩選陽性人類遺傳性心肌病-多能干細胞突變克隆，
[0059]其中，A，多能干細胞陽性突變克隆篩選技術流程；B，PCR檢測藥篩基因插入陽性的多能干細胞克