燥，得桑葚多糖提取物。
[0053] 2. 1. 3酶溶液的配制
[0054] 葡萄糖氧化酶（0. 2wt%~0. 4wt%水溶液）：取葡萄糖氧化酶2~4重量份，精密 稱定，先用少量的水溶解，然后加入適量的水，兩次加水共計1000重量份，混勻，即得。
[0055] 2. 2用苯酚-硫酸法測定多糖含量
[0056] 2. 2. 1操作流程
[0057] 取桑葚多糖粗提物一配制成適當(dāng)濃度的溶液一取一定體積的桑葚多糖粗提物溶 液于具塞試管中一加lmL的苯酸溶液一充分震蕩一迅速加入濃硫酸5mL -沸水浴5分鐘一 冷卻至室溫一用紫外分光光度計測490nm波長處的吸光度一計算多糖含量。
[0058] 2. 2. 2桑葚多糖提取率的計算
[0059] 桑葚多糖提取率（％ )=粗多糖質(zhì)量/桑葚質(zhì)量X 100%
[0060] 2. 3提取工藝的單因素考察
[0061] 2.3.1酶解溫度的考察
[0062] 取預(yù)處理過的桑葚置于容器中，加入水，水的用量為12倍預(yù)處理后的桑葚重量， 調(diào)節(jié)pH為5，放入恒溫恒濕箱分別保持溫度在25 °C、35 °C、45 °C、55 °C、65 °C、75 °C和85 °C，加 入葡萄糖氧化酶的量為桑葚重量的〇. 3 %，酶解120分鐘后超聲，過濾，濃縮，醇沉兩次，得 桑葚多糖提取物，再用硫酸-苯酚法顯色，用紫外分光光度計測定吸光度，酶解溫度對桑葚 多糖提取效果的影響見圖1。
[0063] 由圖1知，酶解溫度在55°C左右時，桑葚多糖提取效果較好。
[0064] 2. 3. 2酶的用量的考察
[0065] 取預(yù)處理過的桑葚于容器中，加入水，水的用量為12倍預(yù)處理后的桑葚重量， 調(diào)節(jié)pH為5,保持溫度在55°C，加入葡萄糖氧化酶的量分別為桑葚重量的0. 1%、0. 2%、 0. 3%、0. 4%、0. 5%和0. 6%，酶解120分鐘后超聲，過濾，濃縮，醇沉兩次，得桑葚多糖提取 物，再用硫酸-苯酚法顯色，用紫外分光光度計測定吸光度，酶的用量對桑葚多糖提取效果 的影響見圖2。
[0066] 由圖2知，酶的用量在預(yù)處理后的桑葚重量的0. 3%左右時，桑葚多糖提取效果較 好。
[0067] 2. 3. 3水的用量的考察
[0068] 取預(yù)處理過的桑葚于容器中，加入水，水的用量分別為預(yù)處理后的桑葚重量的6、 8、10、12、14、16和18倍，調(diào)節(jié)pH為5,保持溫度在55°C，加入葡萄糖氧化酶的量為預(yù)處理后 的桑葚重量的0. 3 %，酶解120分鐘后超聲，過濾，濃縮，醇沉兩次，得桑葚多糖提取物，再用 硫酸-苯酚法顯色，用紫外分光光度計測定吸光度，水的用量對桑葚多糖提取效果的影響 見圖3。
[0069]由圖3知，水的用量為預(yù)處理后的桑葚重量的14倍左右時，桑葚多糖提取效果較 好。
[0070] 2.3.4酶解時間的考察
[0071] 取預(yù)處理過的桑葚于容器中，加入水，水的用量為12倍預(yù)處理后的桑葚重量，調(diào) 節(jié)pH為5,保持溫度在55°C，加入葡萄糖氧化酶的量為桑葚重量的0. 3%，分別酶解15、 30、45、60、75、90、105和120分鐘后超聲，過濾，濃縮，醇沉兩次，得桑葚多糖提取物，再用硫 酸-苯酚法顯色，用紫外分光光度計測定吸光度，酶解時間對桑葚多糖提取效果的影響見 圖4。
[0072] 由圖4知，酶解時間在60分鐘左右時，桑葚多糖提取效果較好。
[0073] 2.4桑葚多糖提取工藝的響應(yīng)面設(shè)計實驗
[0074] 2. 4. 1因素與水平
[0075] 影響桑葚多糖提取工藝的主要因素有葡萄糖氧化酶的酶解時間（&，min)、酶的用 量（X 2，％ )、水的用量（X3，倍）、酶解溫度（X4，°C )4個因素，本實驗采用四因素三水平的 BBD響應(yīng)曲面設(shè)計法（見表2)，以吸光度（A)為指標，對其工藝的水平參數(shù)進行優(yōu)選，所選 因素水平及響應(yīng)曲面設(shè)計試驗結(jié)果見表3和表4。
[0076] 表2響應(yīng)面實驗因素水平設(shè)計表
[0077]
[0078] 2.4.2實驗方法
[0079] 按響應(yīng)面設(shè)計1~29號條件進行實驗，用紫外分光光度計測其吸光度。
[0080] 2.4.3響應(yīng)面設(shè)計試驗結(jié)果分析
[0081] 表3響應(yīng)面試驗設(shè)計表
[0082]
[0083]
[0084] 表4桑葚多糖含量的方差分析
[0085]
[0087] 模擬回歸方程：
[0088] 桑葚多糖提取率=15.88 - 0.31X, - 0.30X2+0.38X3+0.19X4+0.81X02+O.IC^X; -O.IOX^X.J -0.46X2X, -f0.20X2X4 -f0.90X;X4 -0.74X：' -0.85X; - 0.66X] -1.17X'；
[0089] 通過響應(yīng)面設(shè)計、方差分析、圖5~圖16可知，這四個影響因素均對桑葚多糖提取 率有較為明顯的影響。最佳提取條件為：酶解時間為38分鐘、酶的用量為0. 3%、水的用量 為11倍、酶解溫度為58°C。
[0090] 2. 5桑葚多糖提取物對化學(xué)性肝損傷抑制作用試驗：
[0091] (1)急性酒精性肝損傷模型實驗
[0092] 急性酒精性肝損傷模型實驗造模方法：昆明種小鼠（SPS級，許可證號 SCXK (湘）2009-0012)，體重20±2g，在溫度為22±0. 5°C，光照周期為12h: 12h環(huán)境中飼養(yǎng) 10天后實驗，實驗前24h禁食，任意飲水。隨機將每10只小鼠分為一組，共6組，分別為： 病理模型組、常規(guī)對照組、陽性對照組和桑葚多糖提取物組（低劑量組、中劑量組和高劑量 組）。桑葚多糖提取物組：分別灌胃給藥50mg/kg/天（低劑量組），100mg/kg/天（中劑量 組），150mg/kg/天（高劑量組），陽性對照組：灌胃給藥150mg/kg/天，病理模型組與常規(guī) 對照組灌胃給予同體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃30天，末次給藥后4小時后除對照組外其余各 組均按14mL/kg的量給予50%的酒精，末次灌胃禁食不禁水16小時后，摘眼球取血分離血 清，按ALT Elisa試劑盒、AST Elisa試劑盒（均購自Elisa試劑盒公司）的說明書分別測 定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST)的水平。取血后斷頸處死小鼠立即取出肝 臟，按1:10加入冰生理鹽水，冰浴下勾衆(zhòng)，4000r/min離心5min，取上清液按SOD Elisa試 劑盒、GSH-Px Elisa試劑盒、GSH Elisa試劑盒和MDA Elisa試劑盒的說明書分別測超氧化 物歧化酶（S0D)、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px)的活性及谷胱甘肽（GSH)和丙二醛（MDA) 的含量。結(jié)果見表5、圖17和圖18。
[0093] 表5桑葚多糖提取物對小鼠急性酒精性肝損傷S0D和GSH-Px活性及GSH和MAD 含量的影響±sd)
[0094]
[0096] (2)亞急性酒精性肝損傷模型實驗
[0097] 亞急性酒精性肝損傷模型實驗造模方法：昆明種小鼠（SPS級，許可證號 SCXK(湘）2009-0012)，體重20±2g，在溫度為22±0. 5°C、光照周期為12h: 12h環(huán)境中飼養(yǎng) 10天后實驗，實驗前24h禁食，任意飲水。隨機將每10只小鼠分為一組，共6組，分別為： 病理模型組、常規(guī)對照組、陽性對照組和桑葚多糖提取物組（低劑量組、中劑量組和高劑量 組）。桑葚多糖提取物組：分別灌胃給藥50mg/kg/天（低劑量組），100mg/kg/天（中劑量 組），150mg/kg/天（高劑量組），陽性對照組：灌胃給藥150mg/kg/天，病理模型組與常規(guī) 對照組灌胃給予同體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃20天，從第21天起，除對照組外其余各組每天 給藥4小時后，均按14mL/kg的量給予38%的酒精，末次灌胃禁食不禁水16小時后，摘眼 球取血分離血清，按ALT Elisa試劑盒、AST Elisa試劑盒的說明書分別測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST)的水平。取血后斷頸處死小鼠立即取出肝臟，按1:10加入冰 生理鹽水，冰浴下勾衆(zhòng)，4000r/min離心5min，取上清液按SOD Elisa試劑盒、GSH-Px Elisa 試劑盒、GSH Elisa試劑盒和MDA Elisa試劑盒的說明書分別測超氧化物歧化酶（S0D)、谷 胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px)的活性及谷胱甘肽（GSH)和丙二醛（MDA)的含量。結(jié)果見表 6、圖19和圖20。
[0098] 表6桑葚多糖提取物對小鼠急性酒精性肝損傷S0D和GSH-Px活性及GSH和MAD 含量的影響（夂土sd)
[0099]
[0101] 由表5、表6、圖17~圖20可知，本發(fā)明提取的桑葚多糖提取物能明顯降低血清 中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST)的水平，有效提高肝臟中超氧化物歧化酶 (S0D)和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px)的活性，明顯降低肝臟中谷胱甘肽（GSH)和丙二醛 (MDA)的含量，且具有明顯的劑量依賴性。
[0102] 本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明結(jié)合傳統(tǒng)桑葚多糖的提取方法，通過響應(yīng)曲面方 法，綜合考慮提