茯苓多糖的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及茯苓多糖的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 茯苓多糖是茯苓的重要化學(xué)成分之一，近代臨床及藥理研究表明，茯苓多糖具有 很好的抗腫瘤作用，該多糖具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，還能增強(qiáng)細(xì)胞 的免疫反應(yīng)并激活機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫檢測(cè)系統(tǒng)，具有一定的抗腫瘤功效。然而，茯苓多糖由 于提取工藝落后，得到的產(chǎn)品呈黃褐色，這是由于茯苓多糖中色素含量較多，影響了茯苓多 糖的色澤，不僅如此，常規(guī)工藝提取的茯苓多糖對(duì)小鼠 Lewis肺癌腫瘤的抑制有效率僅為 19. 6%~35%〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種茯苓多糖的提取方法，該方法得到的茯苓多 糖純度高，且抗腫瘤活性好。
[0004] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是茯苓多糖的提取方法，包括以下步驟：
[0005] 1)將茯苓破碎，用6~12倍重量80~95v%乙醇回流提取2~3次，每次回流 2~3h，過(guò)濾，取濾渣備用；
[0006] 2)將濾渣用6~12倍重量的水回流提取2~3次，每次提取2~3h，過(guò)濾，收集 濾液備用；
[0007] 3)將濾液濃縮至60°C下相對(duì)密度為I. 1~1. 3的浸膏，加入乙醇沉淀，離心得沉 淀；
[0008] 4)將沉淀依次用2~4倍重量的無(wú)水乙醇、丙酮分別洗滌，將洗滌后的沉淀用2~ 4倍蒸餾水溶解，過(guò)截留分子量為6萬(wàn)的中空纖維膜，收集濃縮液，然后將濃縮液過(guò)截留分 子量為10萬(wàn)的中空纖維膜，收集透過(guò)液離心，過(guò)濾，取濾液備用；
[0009] 5)取濾液噴霧干燥，即為茯苓多糖。
[0010] 步驟3)中，往浸膏中加入90~95v%的乙醇至乙醇含量為80~85v%。
[0011] 步驟4)中，洗滌后的沉淀溶于蒸餾水后，先過(guò)截留分子量為6萬(wàn)的中空纖維膜，這 樣活性分子量低于6萬(wàn)的多糖以及低聚糖、單糖和色素均隨著透過(guò)液流出，收集的濃縮液 過(guò)截留分子量為10萬(wàn)的中空纖維膜，大分子蛋白質(zhì)以及分子量高于10萬(wàn)的多糖被截留，收 集透過(guò)液。
[0012] 本發(fā)明兩次過(guò)中空纖維膜，不僅可以最大程度地去除雜質(zhì)和色素，以保證成品純 度和色澤，且提取得到的茯苓多糖分子量在6萬(wàn)~10萬(wàn)之間，其抗腫瘤活性比其他區(qū)間范 圍內(nèi)的多糖活性要高。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0014] 實(shí)施例1
[0015] 1)將茯苓破碎，用6倍重量80v%乙醇回流提取2次，每次回流2h，過(guò)濾，取濾渣備 用；
[0016] 2)將濾渣用6倍重量的水回流提取2次，每次提取2h，過(guò)濾，收集濾液備用；
[0017] 3)將濾液濃縮至60°C下相對(duì)密度為I. 1的浸膏，往浸膏中加入90v%的乙醇至乙 醇含量為80v%沉淀，離心，得到沉淀；
[0018] 4)將沉淀依次用2倍重量的無(wú)水乙醇、丙酮分別洗滌，將洗滌后的沉淀用2倍蒸餾 水溶解，過(guò)截留分子量為6萬(wàn)的中空纖維膜，收集濃縮液，然后將濃縮液過(guò)截留分子量為10 萬(wàn)的中空纖維膜，收集透過(guò)液離心，過(guò)濾，取濾液備用；
[0019] 5)取濾液噴霧干燥，即為茯苓多糖。用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量為90. 9%，顏 色為白色。
[0020] 對(duì)照組
[0021] 1)將茯苓破碎，用6倍重量80v%乙醇回流提取2次，每次回流2h，過(guò)濾，取濾渣備 用；
[0022] 2)將濾渣用6倍重量的水回流提取2次，每次提取2h，過(guò)濾，收集濾液備用；
[0023] 3)將濾液濃縮至60°C下相對(duì)密度為I. 1的浸膏，往浸膏中加入90v%的乙醇至乙 醇含量為80v%沉淀，離心，得到沉淀；
[0024] 4)將沉淀依次用2倍重量的無(wú)水乙醇、丙酮分別洗滌，將洗滌后的沉淀用2倍蒸餾 水溶解，上D303型大孔樹脂，用水洗脫至流出液無(wú)色透明，收集流出液，濃縮，噴霧干燥，即 為茯苓多糖。用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量為86. 0%，顏色為淺黃色。
[0025] 實(shí)施例2
[0026] 1)將茯苓破碎，用12倍重量95v%乙醇回流提取3次，每次回流3h，過(guò)濾，取濾渣 備用；
[0027] 2)將濾渣用12倍重量的水回流提取3次，每次提取3h，過(guò)濾，收集濾液備用；
[0028] 3)將濾液濃縮至60°C下相對(duì)密度為1. 3的浸膏，往浸膏中加入95v%的乙醇至乙 醇含量為85v%沉淀，離心，得到沉淀；
[0029] 4)將沉淀依次用4倍重量的無(wú)水乙醇、丙酮分別洗滌，將洗滌后的沉淀用4倍蒸餾 水溶解，過(guò)截留分子量為6萬(wàn)的中空纖維膜，收集濃縮液，然后將濃縮液過(guò)截留分子量為10 萬(wàn)的中空纖維膜，收集透過(guò)液離心，過(guò)濾，取濾液備用；
[0030] 5)取濾液噴霧干燥，即為茯苓多糖。用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量為91. 3%，顏 色為白色。
[0031] 實(shí)施例3
[0032] 1)將茯苓破碎，用10倍重量90v%乙醇回流提取2次，每次回流2h，過(guò)濾，取濾渣 備用；
[0033] 2)將濾渣用10倍重量的水回流提取2次，每次提取2h，過(guò)濾，收集濾液備用；
[0034] 3)將濾液濃縮至60°C下相對(duì)密度為1. 2的浸膏，往浸膏中加入95v%的乙醇至乙 醇含量為85v%沉淀，離心，得到沉淀；
[0035] 4)將沉淀依次用3倍重量的無(wú)水乙醇、丙酮分別洗滌，將洗滌后的沉淀用3倍蒸餾 水溶解，過(guò)截留分子量為6萬(wàn)的中空纖維膜，收集濃縮液，然后將濃縮液過(guò)截留分子量為10 萬(wàn)的中空纖維膜，收集透過(guò)液離心，過(guò)濾，取濾液備用；
[0036] 5)取濾液噴霧干燥，即為茯苓多糖。用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量為91. 6%，顏 色為白色。
[0037] 為驗(yàn)證本發(fā)明的茯苓多糖具有較強(qiáng)的免疫促進(jìn)作用，現(xiàn)進(jìn)行以下動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
[0038] 1、抗Lewis肺癌活性實(shí)驗(yàn)
[0039] 取清潔級(jí)C57BL/6小鼠30只，小鼠體重18~20g，隨機(jī)分為3組，每組10只，分別 為實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。
[0040] 取生長(zhǎng)旺盛的小鼠 Lewis肺癌腫瘤細(xì)胞以常規(guī)方法制成勻漿約1~2X 107cfu/ml 的癌細(xì)胞懸浮液，于每只小鼠的右腋皮下接種〇. 2ml癌細(xì)胞懸浮液，24h后，各組開始每日 口服給藥一次，實(shí)驗(yàn)組給藥實(shí)施例1的茯苓多糖，陰性對(duì)照組給藥生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給 藥對(duì)照例1的茯苓多糖，給藥劑量見下表1，連續(xù)給藥10天。停藥后次日處死所有動(dòng)物，截 取足趾稱重并計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤生長(zhǎng)抑制率按下列公式計(jì)算，抑制率（％) = (陰性對(duì) 照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組/陽(yáng)性對(duì)照組瘤重）/陰性對(duì)照組瘤重X 100。
[0041 ]表 1
[0043] 注：與陰性對(duì)照組相比，*p < 0· 05，**p < 0· 01。
[0044] 由上表可知，米用常規(guī)方法提取的獲等多糖對(duì)小鼠 Lewi s肺癌的抑制率達(dá) 32. 85%，而本發(fā)明提取的茯苓多糖對(duì)小鼠 Lewis肺癌的抑制率高達(dá)56. 25%，明顯優(yōu)于常 規(guī)茯苓多糖。
[0045] 2、抗C-26結(jié)腸癌活性實(shí)驗(yàn)
[0046] 取清潔級(jí)C57BL/6小鼠30只，小鼠體重18~20g，隨機(jī)分為3組，每組10只，分別 為實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。
[0047] 取生長(zhǎng)旺盛的小鼠 C-26結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞以常規(guī)方法制成勻漿約1~2 X IO7Cfu/ ml的癌細(xì)胞懸浮液，于每只小鼠的右腋皮下接種0. 2ml癌細(xì)胞懸浮液，24h后，各組開始每 日口服給藥一次，實(shí)驗(yàn)組給藥實(shí)施例1的茯苓多糖，陰性對(duì)照組給藥生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組 給藥對(duì)照例1的茯苓多糖，給藥劑量見下表2,連續(xù)給藥10天。停藥后次日處死所有動(dòng)物， 截取足趾稱重并計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤生長(zhǎng)抑制率按下列公式計(jì)算，抑制率（％) =(陰性 對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組/陽(yáng)性對(duì)照組瘤重）/陰性對(duì)照組瘤重X 100。
[0048] 表 2

[0050] 注：與陰性對(duì)照組相比，，*p < 0· 05，**p < 0· 01。
[0051] 由上表可知，采用常規(guī)方法提取的茯苓多糖對(duì)小鼠 C-26結(jié)腸癌的抑制率達(dá) 26. 75%，而本發(fā)明提取的茯苓多糖對(duì)小鼠 Lewis肺癌的抑制率高達(dá)54. 52%，明顯優(yōu)于常 規(guī)茯苓多糖。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 茯苓多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 將茯苓破碎，用6~12倍重量80~95v%乙醇回流提取2~3次，每次回流2~ 3h，過(guò)濾，取濾渣備用； 2) 將濾渣用6~12倍重量的水回流提取2~3次，每次提取2~3h，過(guò)濾，收集濾液 備用； 3) 將濾液濃縮至60°C下相對(duì)密度為I. 1~1. 3的浸膏，加入乙醇沉淀，離心得沉淀； 4) 將沉淀依次用2~4倍重量的無(wú)水乙醇、丙酮分別洗滌，將洗滌后的沉淀用2~4倍 蒸餾水溶解，過(guò)截留分子量為6萬(wàn)的中空纖維膜，收集濃縮液，然后將濃縮液過(guò)截留分子量 為10萬(wàn)的中空纖維膜，收集透過(guò)液離心，過(guò)濾，取濾液備用； 5) 取濾液噴霧干燥，即為茯苓多糖。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茯苓多糖的提取方法，其特征在于：步驟3)中，往浸膏中加 入90~95v%的乙醇至乙醇含量為80~85v%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種茯苓多糖的提取方法，包括以下步驟：1)將茯苓乙醇提取，取濾渣備用；2)將濾渣水提，收集濾液備用；3)將濾液濃縮浸膏，乙醇沉淀，離心得沉淀；4)將沉淀依次無(wú)水乙醇、丙酮分別洗滌，將洗滌后的沉淀用蒸餾水溶解，過(guò)截留分子量為6萬(wàn)的中空纖維膜，收集濃縮液，然后將濃縮液過(guò)截留分子量為10萬(wàn)的中空纖維膜，收集透過(guò)液離心，過(guò)濾，取濾液備用；5)取濾液噴霧干燥，即為茯苓多糖。本發(fā)明的茯苓多糖純度高，色澤潔白，且抗腫瘤活性強(qiáng)。
【IPC分類】C08B37/00
【公開號(hào)】CN105061627
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510542528
【發(fā)明人】文繼承
【申請(qǐng)人】桂林茗興生物科技有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年8月31日