液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并洗 漆；
[0213] (3)加酶標(biāo)抗體；移去封閉液，洗漆后，加入用稀釋緩沖液稀釋至2yg/mL的HRP 酶標(biāo)抗體，37°C作用2小時(shí)，使其與抗化抗體反應(yīng)；
[0214] (4)洗脫；移去酶標(biāo)抗體，加入用稀釋緩沖液稀釋的洗脫液，使洗脫液中按木瓜蛋 白酶的濃度；酶標(biāo)抗體中抗體的濃度=1:5、1:10、1:20、1:40、1:80的倍比將洗脫液加至微 孔中，每個(gè)濃度作3個(gè)復(fù)孔，分別放置于37°C下作用1K2K化；移去洗脫液，洗漆，待洗漆完 成后，加入底物，37°C避光作用30分鐘，加終止液終止反應(yīng)； 悅巧]妨于450nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下在酶標(biāo)儀上分別讀取每個(gè)微孔的0D值，具體結(jié)果參見(jiàn) 表4，
[0216] 表4不同洗脫液稀釋倍數(shù)下的檢測(cè)結(jié)果
[0217]
[0218] 通過(guò)比較0D值，W判斷化ISA孔壁上結(jié)合的抗化抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物洗脫程 度，當(dāng)0D值最低時(shí)，抗化抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物洗脫程度達(dá)到最大。如表4所示，當(dāng)洗脫 液中木瓜蛋白酶的濃度；酶標(biāo)抗體中抗體的濃度的倍比為1:20,OD值低于其它試驗(yàn)組，洗 脫程度最大。而作用時(shí)間為1K2K化時(shí)，各組0D值變化不大，可見(jiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活 力逐漸減弱，在酶濃度不變的情況下，延長(zhǎng)消化時(shí)間并不能提高消化率，所W本實(shí)驗(yàn)中洗脫 液的作用時(shí)間為1-化皆可，綜上所述，我們選擇洗脫液1:20作為最適工作濃度，1-化作為 最適洗脫時(shí)間。
[0219]應(yīng)用實(shí)施例 悅20] 麻用連施巧I1
[0221] 采用全血提取法提取出隸-低密度脂蛋白馨合物，采用酶聯(lián)免疫法巧LISA法）檢 巧。100份標(biāo)本血漿中的隸-低密度脂蛋白馨合物，即采用具體實(shí)施例方法一記載的方法檢 巧。，具體操作步驟如下：
[0222] 1)包被；將抗低密度脂蛋白抗體包被于固相載體上，用稀釋緩沖液稀釋至500倍， 加入ELISA板微孔中，37°C保存1小時(shí)后于冰箱中4°C儲(chǔ)存；
[0223] 2)封閉；移去稀釋緩沖液，洗漆，加封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，洗漆， ELISA板37°C放置1小時(shí)后于冰箱中4°C儲(chǔ)存；
[0224]扣加樣；W標(biāo)本血漿作為待測(cè)樣本，W已知含量的隸-低密度脂蛋白馨合物作標(biāo) 準(zhǔn)品，用稀釋緩沖液將待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均稀釋至20倍，加至微孔中，37°C作用1小時(shí)；
[0225] 4)加二抗：移去樣品，洗漆，加入用稀釋緩沖液稀釋至2500倍的抗化抗體，37°C 作用1小時(shí)，使其與低密度脂蛋白上的金屬隸反應(yīng)；
[0226] 5)加酶標(biāo)；移去抗化抗體，洗漆，加入用稀釋緩沖液稀釋至抗體濃度為2yg/mL 的酶標(biāo)抗體，37°C作用1小時(shí)，使其與抗化抗體反應(yīng)；
[0227] 6)底物溫育；移去酶標(biāo)抗體，洗漆，加入底物，37 °C避光作用30min，滴加入終止 液； 悅2引 7)檢測(cè)；于450nm波長(zhǎng)下在酶標(biāo)儀上分別讀取待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的0D值，結(jié)果如 表5所示。
[0229] 表4方法一對(duì)100份標(biāo)本血漿的實(shí)測(cè)結(jié)果
[0230]
[0232] 本應(yīng)用實(shí)施例1中，步驟7)中，也可W不使用酶標(biāo)儀檢測(cè)，而是直接通過(guò)顯色進(jìn)行 定性檢測(cè)。 悅扣]麻用連施巧I2
[0234] 采用酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法巧LISA法+AAS法）檢測(cè)100份標(biāo)本血漿中 隸-低密度脂蛋白馨合物，即采用具體實(shí)施例方法二記載的方法檢測(cè)，具體操作步驟如下：
[0235] 1)包被；將抗低密度脂蛋白抗體包被于固相載體上，用稀釋緩沖液稀釋包被蛋白 至500倍，加入化ISA板微孔中，4°C過(guò)夜18小時(shí)；
[0236] 2)封閉；移去稀釋緩沖液，洗漆，加封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，洗漆， ELISA板4°C下保存；
[0237] 扣加樣；W標(biāo)本血漿作待測(cè)樣本，W已知含量的隸-低密度脂蛋白馨合物作標(biāo)準(zhǔn) 品，用稀釋緩沖液將待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至20倍，加至微孔中，37°C作用1小時(shí)； 悅測(cè) 4)洗脫；移去待測(cè)血漿樣本，洗漆，加入0. 8mol/L的化2冊(cè)〇4溶液，37°C作用2小 時(shí)；
[0239]W檢測(cè)；從ELISA微孔中取樣，于原子吸收光譜儀檢測(cè)馨合于低密度脂蛋白上的 隸，結(jié)果如表6所示。
[0240] 表6方法二對(duì)100份標(biāo)本血漿的實(shí)測(cè)結(jié)果
[0241]
悅創(chuàng)應(yīng)用連施例3；
[0244] 采用酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法巧LISA法+ICP-MS法）檢測(cè)100 份標(biāo)本血漿中隸-低密度脂蛋白馨合物，即采用具體實(shí)施例方法=記載的方法檢測(cè)，具體 操作步驟如下：
[0245] 1)包被；將抗低密度脂蛋白抗體包被于固相載體上，用稀釋緩沖液稀釋包被蛋白 至500倍，加入化ISA板微孔中，4°C保存18小時(shí)；
[0246] 。封閉；移去稀釋緩沖液，洗漆，加封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，洗漆， ELISA板4°C保存；
[0247] 扣加樣；W標(biāo)本血漿作待測(cè)樣本，W已知含量的隸-低密度脂蛋白馨合物作標(biāo)準(zhǔn) 品，用稀釋緩沖液將待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至20倍，加至微孔中，37°C作用2小時(shí)；
[0248] 4)洗脫；移去待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品，洗漆，加入0. 8mol/L的化2冊(cè)〇4溶液，37°C洗脫 2小時(shí)；
[0249] 5)酸化；在溶液中加入硝酸對(duì)溶液進(jìn)行酸化，封口過(guò)夜，徹底酸化，加入過(guò)氧化 氨，并且加熱趕酸；
[0250] 6)檢測(cè)；取樣于電感禪合等離子體質(zhì)譜儀下檢測(cè)馨合于低密度脂蛋白上的隸，結(jié) 果如表7所不。
[0巧1 ] 表7方法=對(duì)100份標(biāo)本血漿的實(shí)測(cè)結(jié)果
[0巧2]
[0巧4] 上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不能W此來(lái)限定本發(fā)明保護(hù)的范圍， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所 要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種汞-低密度脂蛋白螯合物，其特征在于，該汞-低密度脂蛋白螯合物是汞離子與 低密度脂蛋白螯合物通過(guò)巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。2. 制備如權(quán)利要求1所述的汞-低密度脂蛋白螯合物的方法，包括以下步驟： A) 汞-低密度脂蛋白螯合物的合成：在提純?cè)从谌梭w的低密度脂蛋白或按照生物學(xué)方 法重組的低密度脂蛋白中加入汞離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得反應(yīng)溶液； B) 汞-低密度脂蛋白螯合物純化：采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液中未反 應(yīng)的低密度脂蛋白、特異性抗體和汞離子，即得汞-低密度脂蛋白螯合物。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于， 所述步驟B)中具體包括以下步驟： (1) 溶解樣品：將上述步驟A)的汞-低密度脂蛋白螯合物溶解于生理鹽水中，得汞-低 密度脂蛋白螯合物溶液； (2) 平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與低密度脂 蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱； (3) 上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)的溶液，然后上柱，使低密度脂 蛋白與填料特異性結(jié)合； (4) 洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lOmol/L的 Na2HPO^f液進(jìn)行洗脫； (5) 收集：收集步驟⑷的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原； (6) 透析：將步驟（5)的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透析過(guò) 夜，收集樣本； (7) 平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能與汞 特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱； (8) 上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（6)中樣本，然后上柱； (9) 洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的Na2HPO4 溶液進(jìn)行洗脫； (10) 收集：收集步驟（9)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原； (11) 透析：將步驟（10)的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透析 過(guò)夜，收集樣本，即得汞-低密度脂蛋白螯合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的汞-低密度脂蛋白螯合物的制備方法，其特征在于，步驟B) 后還包括步驟C):對(duì)汞-低密度脂蛋白螯合物的鑒定； 其中，步驟C)中具體包括以下步驟： (1) 制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床； (2) 加樣：取步驟B)中提取純化得到的汞-低密度脂蛋白螯合物，加入上樣緩沖液，并 混勻，然后加樣于樣品槽中； (3) 電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳； (4) 檢測(cè)：在膠床上找出含汞的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶解，然后 再采用ICP-MS或AAS檢測(cè)是否含有汞以及檢測(cè)汞的含量。5. -種如權(quán)利要求1所述的汞-低密度脂蛋白螯合物在制備檢測(cè)血樣中汞-低密度脂 蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。6. -種至少包括如權(quán)利要求1所述的汞-低密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑盒。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括包被液，該包被液含有捕獲低密 度脂蛋白的蛋白或捕獲金屬汞的物質(zhì)。8. -種定量檢測(cè)汞-低密度脂蛋白螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的權(quán)利要 求1所述的汞-低密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)：酶聯(lián) 免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純 汞-低密度脂蛋白螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純汞-低密度脂蛋白螯合物與原子吸收光 譜結(jié)合法、提純汞-低密度脂蛋白螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免 疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種汞-低密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用，該汞-低密度脂蛋白螯合物是汞與低密度脂蛋白通過(guò)巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成，可用于制備檢測(cè)人體汞-低密度脂蛋白螯合物的試劑。本發(fā)明首次證實(shí)了汞離子可直接作用于低密度脂蛋白。本發(fā)明建立了汞-低密度脂蛋白螯合物的定性定量檢測(cè)方法，以檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群體內(nèi)低密度脂蛋白的含量，從而間接反映一個(gè)地區(qū)汞污染程度以及對(duì)人群的健康影響。本發(fā)明建立的汞-低密度脂蛋白螯合物定量檢測(cè)方法準(zhǔn)確度高重、復(fù)性好。
【IPC分類】G01N33/92, C07K14/775, G01N33/96
【公開(kāi)號(hào)】CN104987397
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510413249
【發(fā)明人】張積仁, 陽(yáng)帆, 董欣敏, 吳婧, 蔡睿, 孫遙, 趙乙木
【申請(qǐng)人】上海拜豪生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年7月14日