買自日本同仁化學(xué)研究所，貨號M030 ;
[0149] 4)低密度脂蛋白溶液；稱取4. Omg低密度脂蛋白溶于4. 0血0. 01M pH9. 0棚酸鹽 緩沖液中，充分振蕩溶解，配制成1. Omg/mL的低密度脂蛋白溶液；
[0150] 5)透析袋的截留分子量14000,購買自BioshopInc;
[015U 透析袋的預(yù)處理；將透析袋放入500血的邸TA-NaHC03溶液中，煮沸l(wèi)Omin;傾棄 邸TA-NaHC03溶液，用d地20輕輕漂洗，再用500血5mmol/L邸TA煮沸l(wèi)Omin;棄掉煮沸液，徹 底用d地20清洗，加入大量的d地20浸泡透析袋4°C過夜。使用時，戴上手套，取出透析袋， 用大量的dd&O徹底沖洗其內(nèi)外表面；
[0152] 制備隸-低密度脂蛋白馨合物的方法，包括W下步驟：
[0153] A)隸-低密度脂蛋白馨合物的合成；在提純源于人體的低密度脂蛋白或按照生 物學(xué)方法重組的低密度脂蛋白中加入隸離子進行馨合反應(yīng)，得反應(yīng)溶液，具體包括W下步 驟：
[0巧4] 1)取2. Omg ITC邸溶于2mLDMS0中；
[0巧5] 2)緩慢將步驟1制備的液體加入低密度脂蛋白溶液中，邊滴加邊震蕩，于25°C， l(K)r/min的搖床中作用24h，然后用透析袋透析24h，除去未與低密度脂蛋白結(jié)合的ITCBE；
[0156] 3)將透析所得的液體用Imol/L肥1調(diào)節(jié)抑值至7. 0,然后緩慢逐漸滴加80y1 Immol/L隸離子溶液，邊滴加邊振蕩，W免隸離子使蛋白變性沉淀；
[0157]4)將加好的溶液在25°C，lOOr/min的搖床中反應(yīng)化，用處理好的透析袋進行透析 2化；
[0158] 5)將透析好的液體于-20°C分裝保存，得到隸-低密度脂蛋白馨合物的反應(yīng)溶液。
[0159] B)隸-低密度脂蛋白馨合物純化；采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液中 未反應(yīng)的低密度脂蛋白、特異性抗體和隸離子，即得隸-低密度脂蛋白馨合物，具體包括W 下步驟：
[0160] (1)溶解樣品；將上述步驟A)的隸-低密度脂蛋白馨合物溶解于生理鹽水中，得 隸-低密度脂蛋白馨合物溶液；
[0161] (2)平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與低密 度脂蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0162] (3)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)的溶液，然后上柱，使低密 度脂蛋白與填料特異性結(jié)合；
[0163] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 化2冊〇4溶液進行洗脫；
[0164] (5)收集；收集步驟（4)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0165] (6)透析；將步驟巧）的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次后，4°C透 析過夜，收集樣本；
[0166] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與隸特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0167] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0168] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 化2冊〇4溶液進行洗脫；
[0169] (10)收集；收集步驟巧）的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0170] (11)透析；將步驟（10)的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次后，4°C 透析過夜，收集樣本，即得隸-低密度脂蛋白馨合物。
[0171] C)對隸-低密度脂蛋白塞合物的鑒定，具體步驟如下：
[017引（1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)制備膠床；
[0173](2)加樣；取步驟B)中提取純化得到的隸-低密度脂蛋白馨合物，復(fù)溶于生理鹽 水中，得隸-低密度脂蛋白馨合物的溶液，取8yL上述溶液，加入2yL上樣緩沖液，并混 勻，然后加樣于樣品槽中；
[0174] (3)電泳；連接電泳板，加電泳緩沖液進行電泳；電泳過程中，電流為22mA恒流，環(huán) 境溫度為4度；至漠酪藍移至膠底部時停止電泳，圖1為本發(fā)明所述隸-低密度脂蛋白塞合 物的非變性電泳條帶圖，M泳道為變性Marker,LDL泳道為低密度脂蛋白；
[017引 （4)檢測；在膠床上找出含隸的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶解， 然后再采用ICP-MS或AAS檢測是否含有隸W及檢測隸的含量。
[0176] D)鑒定結(jié)果
[0177] 1)AAS檢測結(jié)果
[0178] 取步驟C)分離出的蛋白條帶溶液，W石墨爐原子吸收光譜法（AA巧初步測定低密 度脂蛋白中重金屬隸的含量，如下表所示，W化C1溶液、邸r溶液、KC1溶液為空白對照；
[0179] 表1低密度脂蛋白中隸的含量
[0180]
[0181] 2)同步福射X巧光分析
[0182] 蛋白條帶內(nèi)微量元素含量的SRXRF分析在北京正負電子對撞機任EPC)的4W1" 同步福射束線上完成。儲存環(huán)中電子束流能量為2. 2GeV，束流強度100mA。樣品移動臺 (TSA200型，北京卓立漢光公司）可在計算機控制的步進馬達驅(qū)動下沿X、Y二維方向上移 動W改變?nèi)肷涔獍呶恢?，移動步長為0. 0025mm。從樣品發(fā)射出的X射線由Si(Li)探測器 (PGTInc.LS30143-D巧探測，探頭與入射SR線共平面且相互垂直，距樣品照射點20mm，信 號用PGT多道分析儀（MCA4000)獲取輸出。用11.化eV的單色同步福射光激發(fā)樣品，調(diào)節(jié) 入射光斑（Immx3mm)位置使之處于條帶一端，在300s的測定時間內(nèi)，光斑一直沿條帶均勻 緩慢移動，計數(shù)結(jié)束時光斑移到該條帶另一端。沿電泳方向每1mm取一個譜。采用AXIL 軟件處理數(shù)據(jù)，并用來源于空氣且含量恒定的Ar信號峰對其它元素峰進行歸一處理，W抵 消束流強度變化對信號強弱產(chǎn)生的影響。在相同的條件下W同樣的方式測量定量標準干膠 膜的巧光譜。
[0183]圖2為本發(fā)明所述的隸-低密度脂蛋白馨合物的電泳條帶的同步福射X線巧光分 析圖，圖中橫坐標為蛋白條帶位置，縱坐標為改條帶隸金屬能量（含量）值。
[0184] 檢測條件的確定
[0185] 1.抗低密度脂蛋白抗體、抗化抗體最佳工作濃度W及血漿的最佳稀釋倍數(shù)的確 定。
[0186] 酶聯(lián)免疫法檢測隸-低密度脂蛋白馨合物的方法，具體包括W下步驟：
[0187] 1)包被；將抗低密度脂蛋白抗體蛋白包被于固相載體上，分別用稀釋緩沖液將包 被蛋白;250、1 ;500、1 ;10000、和1 ;2000的倍比稀釋，加入化ISA板微孔中，每個濃度包 被S排，4°C保存18小時；
[0188] 2)封閉；移去稀釋緩沖液，洗漆，加入封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，洗 漆；
[0189] 3)加待測樣本；用稀釋緩沖液將待測血漿樣本按1 ;10、1 ;20、1 ;40的倍比稀釋， 加至微孔中，W已知含量的隸-低密度脂蛋白馨合物作標準品，設(shè)置陰性對照和空白對照， 加至微孔中，37°C作用1小時；
[0190] 4)加二抗：移去待測血漿樣本，洗漆，加入用稀釋緩沖液按1 ;2500、1:5000、1 ; 10000、1 ;200000的倍比稀釋的抗化抗體，37°C作用1小時，使其與低密度脂蛋白上的金屬 隸反應(yīng)；
[0191] 5)加酶標；移去抗化抗體，洗漆，加入用稀釋緩沖液稀釋的HRP酶標抗體，37°C作 用1小時，使其與抗化抗體反應(yīng)；
[0192] 6)底物溫育；移去酶標抗體，洗漆，加入底物，37°C避光作用30min，加入終止液；
[0193] 7)檢測；于450nm波長下在酶標儀上分別讀取標準品、待測血漿、陽性對照、陰性 對照和空白對照樣本的OD值。
[0194] 本實施例中，采用本發(fā)明提供的隸-低密度脂蛋白馨合物標準品作為陽性對照， 分別W不加待測血漿作為陰性對照1，即依次加入了抗低密度脂蛋白抗體、封閉液、抗化抗 體、酶標和底物；
[01巧]W不加抗化抗體的對照試驗組作為陰性對照2,即依次加入了抗低密度脂蛋白抗 體、封閉液、待測血漿、酶標和底物；
[0196] W不加酶標的對照試驗組作為陰性對照3、即依次加入了抗低密度脂蛋白抗體、封 閉液、待測血漿、抗化抗體和底物；
[0197] W同時不加待測樣本和抗化抗體的對照試驗組作為陰性對照4,即依次加入了抗 低密度脂蛋白抗體、封閉液、酶標和底物；
[0198] W不加抗低密度脂蛋白抗體作的對照試驗組為空白對照1，即加入了封閉液、待測 血漿、抗化抗體、酶標和底物；
[0199] W及W只加底物的對照試驗組為空白對照2,W只加PBS的對照試驗組為空白對 照3。
[0200] 表2為不同抗低密度脂蛋白抗體稀釋倍比、血漿稀釋倍比、抗化抗體稀釋倍比的 樣本OD值數(shù)據(jù)，
[0201] 表2不同抗低密度脂蛋白抗體、化抗體化及血漿稀釋倍比下的檢測結(jié)果
[0202]
[020引從表2可知，抗低密度脂蛋白抗體的稀釋倍比為1:500時，樣本OD值大于平行條 件下的其它抗低密度脂蛋白抗體的稀釋倍比；該組樣本中，血漿稀釋倍比為1:20時，抗化 抗體稀釋倍比為1:2500時，OD值最大，為0. 789。
[0204] 表3為抗低密度脂蛋白抗體的稀釋倍比為1:500、血漿稀釋倍比為1:20、抗化抗 體稀釋倍比為1:2500時的陽性對照、陰性對照和空白對照的0D檢測值，
[0205] 表3陽性對照、陰性對照及空白對照的檢測結(jié)果
[0206]
[0207]
[0208] 從表3可知，在表2所確定的條件下進行試驗，陰性對照組0D檢測值小于0.1，說 明該優(yōu)化條件下，本方法的系統(tǒng)誤差性小，滿足分析方法要求，所W選此值所對應(yīng)的濃度作 為最佳工作濃度。
[0209] 2.ELISA洗脫液最佳工作濃度及洗脫時間確定
[0210] 為尋求最適宜的洗脫條件，通過酶聯(lián)免疫法在抗化抗體與酶標抗體溫育后，W不 同濃度的洗脫液進行洗脫，再通過酶標儀檢測0D值，具體步驟如下：
[0211] (1)包被；將抗化抗體包被于固相載體上，用稀釋緩沖液按1 ;500的倍比稀釋，加 入化ISA板微孔中，4°C保存16小時； 悅1引 似封閉：移去稀釋緩沖液，洗漆后，加封閉