:80、1:40、1:20、1:10、1:5，分別放置于37°C溫度下 作用lh、2h、化；移去洗脫液，洗漆，待洗漆完成后，加入底物，37°C避光作用30分鐘，加終止 液終止反應(yīng)；
[021引 妨于450nm的檢測波長下在酶標(biāo)儀上分別讀取每個(gè)微孔的OD值，具體結(jié)果參見 表4，
[0214] 表4不同洗脫液稀釋倍數(shù)下的檢測結(jié)果
[0215]
[0216] 通過比較OD值，W判斷化ISA孔壁上結(jié)合的抗As抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物洗脫程 度，當(dāng)OD值最低時(shí)，抗As抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物洗脫程度達(dá)到最大。如表4所示，當(dāng)洗脫 液中木瓜蛋白酶的濃度：酶標(biāo)抗體中抗體的濃度=1:20時(shí)，抗As抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物洗 脫程度達(dá)到最大。而作用時(shí)間為1K2K化時(shí)，各組OD值變化不大，可見隨著時(shí)間的延長， 酶活力逐漸減弱，在酶濃度不變的情況下，延長消化時(shí)間并不能提高消化率，所W本實(shí)驗(yàn)中 洗脫液的作用時(shí)間為1-化皆可，綜上所述，我們選擇洗脫液1:20作為最適工作濃度，l-3h 作為最適洗脫時(shí)間。
[0217] 麻用連施例1 :
[021引采用酶聯(lián)免疫法檢測100份標(biāo)本血漿中的神-低密度脂蛋白馨合物，按照W下步 驟進(jìn)行檢測：
[0219] 1)將抗LDL抗體蛋白包被于固相載體上；用稀釋緩沖液W 1:500的比例稀釋包被 蛋白，加入化ISA板微孔中，37 °C水浴1小時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[0220] 2)封閉；移去稀釋緩沖液，洗漆，加封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，洗漆， ELISA板37°C放置1小時(shí)后于冰箱中4°C儲(chǔ)存；
[0221] 3)加樣；W標(biāo)本血漿作為待測樣本，W已知含量的神-低密度脂蛋白馨合物作標(biāo) 準(zhǔn)品，用稀釋緩沖液將待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均稀釋20倍，加至微孔中，37°C作用1小時(shí)；
[0222] 4)加抗As抗體；移去樣品，洗漆，加入用稀釋緩沖液稀釋至25000倍的抗As抗體， 37°C作用1小時(shí)，使其與低密度脂蛋白上的神反應(yīng)；
[0223] 5)加酶標(biāo)；移去抗As抗體，洗漆，加入抗體濃度為2yg/mL的酶標(biāo)抗體，37°C作用 1小時(shí)，使其與抗As抗體反應(yīng)；
[0224] 6)底物溫育；移去酶標(biāo)抗體，洗漆，加入底物，37°C避光作用30min，入終止液；
[0225] 7)檢測；于450nm波長下在酶標(biāo)儀上分別讀取待測樣本組和標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，過與 標(biāo)準(zhǔn)品組比較，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程求得待測樣本的中神的含量，結(jié)果如表5所示。
[0226] 表5 100份標(biāo)本血清神-低密度脂蛋白馨合物化ISA檢測結(jié)果
[0227]
[0228]本應(yīng)用實(shí)施例1中，步驟7)中，也可W不使用酶標(biāo)儀檢測，而是直接通過顯色進(jìn)行 定性檢測。 悅W] 麻用連施巧I2
[0230] 采用酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法巧LISA法+AAS法）檢測100份標(biāo)本血漿中 神-低密度脂蛋白馨合物，即采用具體實(shí)施例方法二記載的方法檢測，具體操作步驟如下：
[0231] 1)包被；將抗低密度脂蛋白抗體包被于固相載體上，用稀釋緩沖液稀釋包被蛋白 至500倍，加入化ISA板微孔中，4°C過夜18小時(shí)；
[0232] 2)封閉；移去稀釋緩沖液，洗漆，加封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，洗漆， ELISA板4°C下保存；
[023引扣加樣；W標(biāo)本血漿作待測樣本，W已知含量的神-低密度脂蛋白馨合物作標(biāo)準(zhǔn) 品，用稀釋緩沖液將待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至20倍，加至微孔中，37°C作用1小時(shí)；
[0234] 4)洗脫；移去待測血漿樣本，洗漆，加入0. 8mol/L的化2冊(cè)〇4溶液，37°C作用2小 時(shí)；
[0235] 5)檢測；從化ISA微孔中取適量液體，于原子吸收光譜儀檢測馨合于低密度脂蛋 白上的神，結(jié)果如表6所示。
[0236] 表6100份標(biāo)本血漿神-低密度脂蛋白馨合物AAS檢測結(jié)果
[0237]
[023引
悅3引 麻用連施例3：
[0240] 采用酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法巧LISA法+ICP-MS法）檢測100 份標(biāo)本血漿中神-低密度脂蛋白馨合物，即采用具體實(shí)施例方法=記載的方法檢測，具體 操作步驟如下：
[0241] 1)包被；將抗低密度脂蛋白抗體包被于固相載體上，用稀釋緩沖液稀釋包被蛋白 至500倍，加入化ISA板微孔中，4°C保存18小時(shí)；
[0242]。封閉；移去稀釋緩沖液，洗漆，加封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，洗漆， ELISA板4°C保存；
[0243]扣加樣；W標(biāo)本血漿作待測樣本，W已知含量的神-低密度脂蛋白馨合物作標(biāo)準(zhǔn) 品，用稀釋緩沖液將待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至20倍，加至微孔中，37°C作用2小時(shí)；
[0244] 4)洗脫；移去待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品，洗漆，加入0. 8mol/L的化2冊(cè)〇4溶液，37°C洗脫 2小時(shí)；
[0245] 5)酸化；在溶液中加入硝酸對(duì)溶液進(jìn)行酸化，封口過夜，徹底酸化，加入過氧化 氨，并且加熱趕酸；
[0246] 6)檢測；取樣于電感禪合等離子體質(zhì)譜儀下檢測馨合于低密度脂蛋白上的神，結(jié) 果如表7所不。
[0247] 表7 100份標(biāo)本血清神-低密度脂蛋白馨合物ICP-MS檢測結(jié)果
[0248]

[0250] 上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不能W此來限定本發(fā)明保護(hù)的范圍， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所 要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種砷-低密度脂蛋白螯合物，其特征在于，該砷-低密度脂蛋白螯合物是砷離子與 低密度脂蛋白通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。2. 如權(quán)利要求1所述的砷-低密度脂蛋白螯合物的制備方法，包括以下步驟： A) 砷-低密度脂蛋白螯合物的合成：在提純?cè)从谌梭w的低密度脂蛋白或按照生物學(xué)方 法重組的低密度脂蛋白中加入砷離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液； B) 砷-低密度脂蛋白螯合物純化：采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液中未反 應(yīng)的低密度脂蛋白、特異性抗體和砷離子，即得砷-低密度脂蛋白螯合物。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于， 所述步驟B)中具體包括以下步驟： (1) 溶解樣品：將上述步驟A)的提取的砷-低密度脂蛋白螯合物溶解于生理鹽水中， 得砷-低密度脂蛋白螯合物的溶液； (2) 平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與低密度脂 蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱； (3) 上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)的溶液，然后上柱，使低密度脂 蛋白與填料特異性結(jié)合； (4) 洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lOmol/L的 Na2HPO^f液進(jìn)行洗脫； (5) 收集：收集步驟（4)洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原； (6) 透析：將步驟（5)的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透析過 夜，收集樣本； (7) 平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能與砷 特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱； (8) 上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（6)中樣本，然后上柱； (9) 洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的Na2HPO4 溶液進(jìn)行洗脫； (10) 收集：收集步驟（9)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原； (11) 透析：將步驟（10)的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透析 過夜，收集樣本，即得砷-低密度脂蛋白螯合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的砷-低密度脂蛋白螯合物的制備方法，其特征在于，步驟B) 后還包括步驟C):對(duì)砷-低密度脂蛋白螯合物的鑒定； 其中，步驟C)中具體包括以下步驟： (1) 制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床； (2) 加樣：取步驟B)中提取純化得到的砷-低密度脂蛋白螯合物，加入上樣緩沖液，并 混勻，然后加樣于樣品槽中； (3) 電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳； (4) 檢測：在膠床上找出含砷的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶解，然后 再采用ICP-MS或AAS檢測該液體中是否含有砷以及檢測砷的含量。5. -種如權(quán)利要求1所述的砷-低密度脂蛋白螯合物在制備檢測血樣中砷-低密度脂 蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。6. -種至少包括如權(quán)利要求1所述的砷-低密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑盒。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括包被液，該包被液含有捕獲低密 度脂蛋白的物質(zhì)或捕獲砷的物質(zhì)。8. -種定量檢測砷-低密度脂蛋白螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的權(quán)利要 求1所述的砷-低密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測：酶聯(lián) 免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純 砷-低密度脂蛋白螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純砷-低密度脂蛋白螯合物與原子吸收光 譜結(jié)合法、提純砷-低密度脂蛋白螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免 疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種砷-低密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用，該砷-低密度脂蛋白螯合物是由砷離子通過鋅指結(jié)構(gòu)、巰基、半胱氨酸殘基中的至少一種結(jié)構(gòu)與低密度脂蛋白螯合形成。本發(fā)明建立了砷-低密度脂蛋白螯合物的定性定量檢測方法，以便定量檢測砷-低密度脂蛋白螯合物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)砷污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個(gè)地區(qū)人群血清中砷-低密度脂蛋白螯合物可以間接反映這個(gè)地區(qū)人群受砷污染的情況，從而間接反映這個(gè)地區(qū)砷污染程度。本發(fā)明建立的砷-低密度脂蛋白螯合物定量檢測方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使檢測的重復(fù)性得到大大提高。
【IPC分類】C07K14/775, C07K1/22, G01N33/96, G01N33/92
【公開號(hào)】CN104987395
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510412942
【發(fā)明人】張積仁, 陽帆, 董欣敏, 吳婧, 蔡睿, 孫遙, 趙乙木
【申請(qǐng)人】上海拜豪生物科技有限公司
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年7月14日