，配制方法示例：取1. 42徑化2冊〇4、0. 96g巧樣酸，然后加入dd&O至50血，即得；
[0化^ 洗脫液的配制方法示例；將木瓜蛋白酶用抑8. 0, 0.Imol/LTris-HCI緩沖液配 制成l-2mg/mL，再加入Immol/L二硫蘇糖醇值TT)37°C解育30min，得洗脫液；
[0化引上樣緩沖液可由如下比例的組分配制而成；Tris-HCI;1%漠酪藍(lán)；dd&O;甘氨酸 =15. 5 ;2. 5 ;7 ;25,其中Tris-HCI的抑為6.8、摩爾濃度為1M;
[0053] 電泳緩沖液的配制方法如下：取3.OgTris、14. 4g甘氨酸、溶于SOOmLd地2〇中，調(diào) 抑至8. 3后，定容至1L;
[0054] 捕獲神的物質(zhì)為貨號為"廣州然科公司RK15728"的鼠抗AsmAb;其中，本發(fā)明所 述與神特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗As抗體、二抗、抗神抗體均為捕獲神的物質(zhì)；
[0055] 本發(fā)明提供一種神-低密度脂蛋白馨合物，神離子與低密度脂蛋白通過琉基或/ 和半脫氨酸殘基馨合而成。
[0056] 具體地，神-低密度脂蛋白馨合物是由神通過結(jié)合鋒指結(jié)構(gòu)、琉基、半脫氨酸殘基 中的至少一種結(jié)構(gòu)與低密度脂蛋白上的載脂蛋白B或膽固醇、甘油S醋等結(jié)合而形成的馨 合物。
[0057] 本發(fā)明還提供神-低密度脂蛋白馨合物的制備方法，包括W下步驟：
[005引 A)神-低密度脂蛋白的合成；在提純源于人體的低密度脂蛋白或按照生物學(xué)方法 重組的低密度脂蛋白中加入神離子進行馨合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0059] B)神-低密度脂蛋白馨合物純化；采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液中 未反應(yīng)的低密度脂蛋白、特異性抗體和神離子，即得神-低密度脂蛋白馨合物，具體包括W 下步驟：
[0060] (1)溶解樣品；將上述步驟A)的提取的神-低密度脂蛋白馨合物溶解于生理鹽水 中，得神-低密度脂蛋白馨合物的溶液；
[0061] 似平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與低密 度脂蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0062] 所述能與低密度脂蛋白特異性結(jié)合的填料為吸附有可與低密度脂蛋白特異性結(jié) 合物質(zhì)的硅膠或樹脂；
[0063] (3)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)的溶液，然后上柱，使低密 度脂蛋白與填料特異性結(jié)合；
[0064] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 化2冊〇4溶液進行洗脫；
[0065] (5)收集；收集洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0066] (6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0067] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與神特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0068] 所述能與神特異性結(jié)合的填料為吸附有可與神特異性結(jié)合物質(zhì)的硅膠或樹脂；
[0069] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0070] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 化2冊〇4溶液進行洗脫；
[0071] (10)收集；收集洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[007引（11)透析；將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得神-低密度脂蛋白馨合物。
[007引 C);對神-低密度脂蛋白馨合物的鑒定，具體包括W下步驟：
[0074] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[007引 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的神-低密度脂蛋白馨合物，加入上樣緩沖 液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0076] 做電泳：連接電泳板，進行電泳；
[0077] (4)檢測；在膠床上找出含神的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶解， 然后再采用ICP-MS或AAS檢測該液體中是否含有神W及檢測神的含量。
[007引本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的神-低密度脂蛋白馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試 劑盒。
[0079] 在本發(fā)明中，能實現(xiàn)本發(fā)明目的的試劑盒可W列出W下幾種，但并不限于此。
[0080] 一種檢測血樣中神-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括：含有可用于捕獲低密 度脂蛋白的包被液，還包括封閉液、洗漆緩沖液、可捕獲神的物質(zhì)作為二抗、酶標(biāo)抗體、底 物、終止液、稀釋緩沖液、陽性對照、陰性對照等。
[0081] 一種檢測血樣中神-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括：含有可用于捕獲低密 度脂蛋白的包被液，還包括封閉液、洗漆緩沖液、洗脫液、陽性對照、陰性對照等。
[0082] 一種檢測血樣中神-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括：含有可用于捕獲低密 度脂蛋白的包被液，還包括封閉液、洗漆緩沖液、洗脫液、酸化劑、過氧化氨、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對 照等。
[0083] 一種檢測血樣中神-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括提取低密度脂蛋白所需 提取試劑、復(fù)溶液、含有可用于捕獲神的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗漆緩沖液、酶標(biāo)抗體、底 物、終止液、稀釋緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照等。
[0084] 一種檢測血樣中神-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括提取低密度脂蛋白所需 提取試劑、復(fù)溶液、陽性對照、陰性對照等。
[0085] 一種檢測血樣中神-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括提取低密度脂蛋白所需 提取試劑、復(fù)溶液、酸化劑、過氧化氨、陽性對照、陰性對照等。
[0086] 一種檢測血樣中神-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括提取低密度脂蛋白所需 提取試劑、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、加樣緩沖液、溶解膠床上含神的蛋白條帶所需液體、含有可用 于捕獲神的物質(zhì)的包被液、封閉液、洗漆緩沖液、酶標(biāo)抗體、底物、終止液、陽性對照、陰性對 照等。
[0087] 一種檢測血樣中神-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括提取低密度脂蛋白所需 提取試劑、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、加樣緩沖液、溶解膠床上含神的蛋白條帶所需液體、陽性對 照、陰性對照等。
[008引一種檢測血樣中神-低密度脂蛋白馨合物的試劑盒，包括提取低密度脂蛋白所需 提取試劑、膠床介質(zhì)、復(fù)溶液、加樣緩沖液、溶解膠床上含神的蛋白條帶所需液體、硝酸、過 氧化氨、陽性對照、陰性對照等。
[0089] 上述幾種試劑盒中，所述陽性對照為標(biāo)準(zhǔn)品，即馨合有神的低密度脂蛋白馨合物 或馨合有神的BSA馨合物；所述陰性對照為不含有標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋洗脫液。
[0090] 上述試劑盒用于檢測神-低密度脂蛋白馨合物，W提高檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性， 并使之在臨床中得到推廣。
[0091] 本發(fā)明還提供一種定量檢測神-低密度脂蛋白馨合物的方法，W已知含量的上述 的神-低密度脂蛋白馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用W下方法之一對樣品進行檢測；酶聯(lián)免疫法、 酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純神-低 密度脂蛋白馨合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純神-低密度脂蛋白馨合物與原子吸收光譜結(jié)合 法、提純神-低密度脂蛋白馨合物與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原 子吸收光譜或電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。在本發(fā)明中，用檢測神-低密度脂蛋白馨合 物的方法可W列出的有W下幾種，但并不限于W下幾種。
[0092] 立法二;酶聯(lián)免疫法檢測神-低密度脂蛋白馨合物，按W下步驟進行檢測：
[0093] 1)包被；用稀釋緩沖液將可W捕獲低密度脂蛋白的物質(zhì)稀釋至250~2000倍，加 入化ISA板微孔中，4°C下過夜16-18小時，或37°C水浴1-3小時，儲存冰箱；
[0094] 2)封閉；移去稀釋緩沖液，并用洗漆液進行洗漆，待洗漆完成后，加入1% -5%牛 血清白蛋白或脫脂奶粉作為封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，并用相應(yīng)洗漆液進行洗 漆。洗漆完成后，ELISA板于337°C放置1小時；
[00巧]扣加待測樣本，并且溫育；從循環(huán)系統(tǒng)取樣，作待測樣本；W已知含量的神-低密 度脂蛋白馨合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液將待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均稀釋至10-40倍，加至微 孔中，37°C作用1-2小時；
[0096] 4)加入可W捕獲神的物質(zhì)，并且溫育；移去待測樣本，并用洗漆緩沖液進行洗漆， 待洗漆完成后，加入用稀釋緩沖液稀釋25000~200000倍的抗神抗體，37°C作用1-2小時， 使抗神抗體與低密度脂蛋白上的神反應(yīng)；
[0097] 5)酶結(jié)合物溫育；移去抗神抗體，洗漆，加入用稀釋緩沖液稀釋的HRP酶標(biāo)抗體， 37°C作用1-2小時，使其與HRP酶標(biāo)抗體反應(yīng)；
[009引 6)底物溫育；移去酶標(biāo)抗體，并用洗漆緩沖液進行洗漆，待洗漆完成后，加入底 物，37°C避光作用30分鐘；
[0099] 7)終止反應(yīng)；滴加終止液至每一微孔；
[0100] 8)取波長450皿，加完終止液后，將化ISA板置于酶標(biāo)儀上分別讀取待測樣本組和 標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過與標(biāo)準(zhǔn)品組比較，求得待測樣本的含量。
[0101] 本方法中，步驟8)也可不使用酶標(biāo)儀，直接通過顯色情況進行定性檢測。
[0102] 該方法利用ELISA原理，可W將全血中的特異性低密度脂蛋白提取出來，提取出 來的低密度脂蛋白上部分馨合有神，而該部分低密度脂蛋白上的神可W被抗神的特異性抗 體所捕獲，之后可W再被辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標(biāo)記的抗體所捕獲（該抗體不 識別包被蛋白），捕獲上的抗體在顯色劑及終止液的作用下，可W在儀器下讀出OD值，而不 含有馨合神的低密度脂蛋白，則不會被抗神的特異性抗體所捕獲，也不會與辣根過氧化物 酶、堿性磯酸酶等酶標(biāo)記的抗體所捕獲，而所用試劑中也不含有神（陰性對照組結(jié)果為陰 性），因而當(dāng)所讀取的OD值結(jié)果顯示為陽性時，即可證明檢測出低密度脂蛋白上馨合的神。
[0103] 方法二:酶巧免疫巧LISA)與原子吸收光譜（AA巧結(jié)合法檢測神-低密度脂蛋白 馨合物，按W下步驟進行檢測：
[0104] 1)包被；將能夠捕獲低密度