脂蛋白的物質(zhì)，如抗低密度脂蛋白抗體（抗低密度脂 蛋白抗體）包被于固相載體上，用稀釋緩沖液稀釋抗低密度脂蛋白抗體至250-2000倍，加 入化ISA板微孔中，4°C過夜16-18小時(shí)，或37°C水浴1-3小時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[0105] 2)封閉；移去稀釋緩沖液，并用洗漆緩沖液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入封閉 液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用相應(yīng)洗漆緩沖液進(jìn)行洗漆，洗漆完成后，ELISA板于 37 °C放置1小時(shí)；
[0106] 扣加待測(cè)樣本，并且溫育；從循環(huán)系統(tǒng)中取樣，作待測(cè)樣本；W已知含量的神-低 密度脂蛋白馨合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液稀釋至10-40倍，加至微孔中，37°C作用1-2小 時(shí)；
[0107] 4)洗脫；移去待測(cè)樣本，洗漆，加入洗脫液，在37°C下洗脫1-3小時(shí)；
[010引 W檢測(cè)；從ELISA微孔中取樣，于原子吸收光譜儀檢測(cè)馨合于低密度脂蛋白上的 神，讀出相應(yīng)數(shù)值；
[0109] 該實(shí)施例利用ELISA原理對(duì)血清中的低密度脂蛋白進(jìn)行捕獲，并結(jié)合原子吸收光 譜（AA巧儀檢測(cè)馨合于低密度脂蛋白上的神；由于溶液中僅含有低密度脂蛋白，且所用試 劑中不含神（陰性對(duì)照組結(jié)果為陰性），不會(huì)對(duì)結(jié)果造成干擾，因而當(dāng)所讀取的結(jié)果顯示為 陽性時(shí)，即可證明檢測(cè)出低密度脂蛋白上馨合的神。
[0110] 立法三^酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法巧LISA法+ICP-MS法）檢測(cè) 神-低密度脂蛋白馨合物按照如下步驟檢測(cè)：
[0111] 1)包被；將能夠捕獲低密度脂蛋白的物質(zhì)，如抗低密度脂蛋白抗體包被于固相載 體上，用稀釋緩沖液稀釋抗低密度脂蛋白抗體至250-2000倍，加入化ISA板微孔中，4°C過 夜16-18小時(shí)，或37°C水浴1-3小時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[0112] 2)封閉；移去稀釋緩沖液，并用洗漆緩沖液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入封閉 液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用相應(yīng)洗漆緩沖液進(jìn)行洗漆，洗漆完成后，ELISA板于 37 °C放置1小時(shí)；
[011引扣加待測(cè)樣本，并且溫育；從循環(huán)系統(tǒng)取全血，作待測(cè)樣本；W已知含量的神-低 密度脂蛋白馨合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液稀釋至10-40倍，加至微孔中，37°C作用1-2小 時(shí)；
[0114] 4)洗脫；移去待測(cè)樣本，并用相應(yīng)洗漆緩沖液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入洗脫 液，在37-57C下洗脫1-3小時(shí)；
[0115] 5)酸化；在步驟4)中的溶液中加入酸化劑對(duì)溶液進(jìn)行酸化，封口過夜，徹底酸 化；
[0116] 6)檢測(cè)；加入過氧化氨，并且加熱趕酸，并從化ISA試劑板中洗脫的溶液中取 〇.5mL液體，于電感禪合等離子體質(zhì)譜儀下檢測(cè)馨合于低密度脂蛋白的神，讀出相應(yīng)數(shù)值。
[0117] 該方法在利用ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合感禪合等離子體質(zhì)譜（ICP-M巧原理，用 電感禪合等離子體質(zhì)譜儀檢測(cè)馨合于低密度脂蛋白上的神；即先采用化ISA原理將血清中 的神-低密度脂蛋白馨合物提取出來，再采用感禪合等離子體質(zhì)譜儀對(duì)馨合于低密度脂蛋 白上的神進(jìn)行定量檢測(cè)；由于溶液中僅含有低密度脂蛋白，且所用試劑中不含神，陰性對(duì)照 組結(jié)果為陰性，不會(huì)對(duì)結(jié)果造成干擾，因而當(dāng)所讀取的結(jié)果顯示為陽性時(shí)，即可證明檢測(cè)出 低密度脂蛋白上馨合的神。
[0118] 方法四；提純神-低密麼脂軍白謗合物與酶巧免疫結(jié)合法(提純法+ELISA法）檢 測(cè)神-低密度脂蛋白馨合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0119] 1)從全血中提取非特異性低密度脂蛋白；采用超速離屯、法、高壓液相層析法、凝 膠過濾層析法、凝膠電泳法等方法，從全血中提取低密度脂蛋白，并將提取出的低密度脂蛋 白復(fù)溶，得低密度脂蛋白的溶液；
[0120] 2)包被；將抗神抗體包被于固相載體上，用稀釋緩沖液稀釋抗神抗體至25000~ 200000倍，加入化ISA板微孔中，4°C過夜16-18小時(shí)，或37°C水浴1-3小時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[0121] 3)封閉；移去稀釋緩沖液，并用洗漆緩沖液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入封閉 液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用相應(yīng)洗漆緩沖液進(jìn)行洗漆，洗漆完成后，ELISA板于 37 °C放置1小時(shí)；
[012引 4)加待測(cè)樣本，并且溫育；從步驟1)的溶液中取樣，作待測(cè)樣本；W已知含量的 神-低密度脂蛋白馨合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液稀釋至10-40倍，加至微孔中，37°C作用 1-2小時(shí)；
[0123] 5)酶結(jié)合物溫育；移去待測(cè)樣本，并用洗漆緩沖液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入 用稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)抗體，37°C作用1-2小時(shí)，使其與酶標(biāo)抗體反應(yīng)；
[0124] 6)底物溫育；移去酶標(biāo)抗體，并用相應(yīng)洗漆緩沖液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入 底物，37°C避光作用30分鐘；
[01巧]7)終止反應(yīng)；滴加終止液至每一微孔；
[01%] 8)取波長(zhǎng)450nm，加完終止液后，在酶標(biāo)儀上分別讀取待測(cè)樣本組和標(biāo)準(zhǔn)品的OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過與標(biāo)準(zhǔn)品組比較，求得待測(cè)樣本的含量。
[0127] 本方法中，也可不使用酶標(biāo)儀，直接通過顯色情況進(jìn)行定性檢測(cè)。
[0128] 方法五；提純神-低密度脂蛋白馨合物與原子吸收光譜結(jié)合法（提純法+AAS法） 檢測(cè)血樣中神-低密度脂蛋白馨合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0129] 1)從全血中提取非特異性低密度脂蛋白；采用超速離屯、法、高壓液相層析法、凝 膠過濾層析法、凝膠電泳法等方法，從全血中提取低密度脂蛋白，并將提取出的低密度脂蛋 白復(fù)溶，得低密度脂蛋白的溶液；
[0130] 2)檢測(cè)；從步驟1)的溶液中取樣，于原子吸收光譜儀檢測(cè)馨合于低密度脂蛋白上 的神，讀出相應(yīng)數(shù)值。
[0131] 方法六；提純神-低密度脂蛋白馨合物與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法（提純法 +ICP-MS法）檢測(cè)神-低密度脂蛋白馨合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0132] 1)從全血中提取非特異性低密度脂蛋白；采用超速離屯、法、高壓液相層析法、凝 膠過濾層析法、凝膠電泳法等方法，從全血中提取低密度脂蛋白，并將提取出的低密度脂蛋 白復(fù)溶，得低密度脂蛋白的溶液；
[0133] 2)酸化；從步驟1)的溶液中取樣，在溶液中加入硝酸對(duì)溶液進(jìn)行酸化，封口過夜， 徹底酸化；
[0134] 如檢測(cè)；加入過氧化氨，并且加熱趕酸后取0. 5血溶液，于電感禪合等離子體質(zhì)譜 儀下檢測(cè)馨合于低密度脂蛋白上的神，讀出相應(yīng)數(shù)值。
[01巧]方法四、方法五和方法六均是通過全血提取法分離出低密度脂蛋白，再采用特異 性檢測(cè)方法，測(cè)定低密度脂蛋白中神-低密度脂蛋白馨合物上神的含量；即先采用物理分 離手段，如超速離屯、法、高壓液相層析法、凝膠過濾層析法等，將低密度脂蛋白從待測(cè)血漿 樣本中分離出來并復(fù)溶于生理鹽水中，再利用ELISA原理、原子吸收光譜檢測(cè)或進(jìn)行檢測(cè) 電感禪合等離子體質(zhì)譜法檢測(cè)神-低密度脂蛋白馨合物上的神含量。
[0136] 方法^;：;電泳法+ELISA/AAS/ICP-MS法檢測(cè)神-低密度脂蛋白聲合物，具體如下；
[0137] 1)從全血中提取非特異性低密度脂蛋白；采用超速離屯、法、高壓液相層析法、凝 膠過濾層析法、凝膠電泳法等方法，從全血中提取低密度脂蛋白，將提取出來的低密度脂蛋 白復(fù)溶于生理鹽水中，得低密度脂蛋白的溶液；
[0138] 2)制備膠床；根據(jù)需要選擇合適的介質(zhì)（如瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠等），按 照相應(yīng)要求制備好相應(yīng)膠床；
[0139] 扣加樣；從步驟1)的溶液中取8化溶液，W已知含量的神-低密度脂蛋白馨合 物作標(biāo)準(zhǔn)品，加入2UL上樣緩沖液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0140] 4)電泳；連接電泳板，加電泳緩沖液，進(jìn)行電泳，并根據(jù)需求將蛋白按照分子量、 等電點(diǎn)等參數(shù)的不同進(jìn)行分離；
[0141] 5)檢測(cè)；在膠床上找出含有神的蛋白條帶，將該條帶取出，將該蛋白條帶溶于液 體之中，然后再分別利用化ISA、ICP-MS或AAS等原理檢測(cè)溶于液體中的神含量。
[0142] 此外，還可W利用此方法檢測(cè)神-低密度脂蛋白馨合物的免疫復(fù)合物的等電點(diǎn)、 分子量及含量等。
[0143] 在方法走中，將低密度脂蛋白從全血中提取出來，再采用凝膠電泳法對(duì)所提取的 低密度脂蛋白進(jìn)行分離，再找出富含神的相應(yīng)條帶，再檢測(cè)相關(guān)低密度脂蛋白的含量；即低 密度脂蛋白從紅細(xì)胞中釋放后，可W用多種方法提純出來（例如超速離屯、法、高壓液相層 析法、凝膠過濾層析法、凝膠電泳法，ELISA方法等），將提純出來的低密度脂蛋白復(fù)溶于溶 液中，取一定量的低密度脂蛋白，利用電荷移動(dòng)原理，進(jìn)行電泳（electro地oresis，EP)，在 凝膠板（可根據(jù)需要采用不同介質(zhì)）上可根據(jù)分子量、等電點(diǎn)等不同跑出不同的條帶，尋找 出富含神的相應(yīng)條帶，將凝膠中的蛋白質(zhì)復(fù)溶于溶液中，即可W在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)相關(guān)低 密度脂蛋白的含量，也可W利用ELISA、AAS、ICP-MS等原理檢測(cè)出馨合于低密度脂蛋白上 的神含量，由于溶液中僅含有低密度脂蛋白，且所用試劑中不含神（陰性對(duì)照組結(jié)果為陰 性），不會(huì)對(duì)結(jié)果造成干擾，因而當(dāng)所讀取的結(jié)果顯示為陽性時(shí)，即可證明檢測(cè)出低密度脂 蛋白上馨合的神。
[0144] 連施例1 ;合成法合成神-低密度脂蛋白塞合物，包括W下步驟：
[0145] 本實(shí)施例所制備的神-低密度脂蛋白塞合物，通過凝膠電泳進(jìn)一步分離，并通過 電感禪合等離子體質(zhì)譜或原子吸收光譜進(jìn)行檢測(cè)定性鑒定。
[0146] 制備神-低密度脂蛋白馨合物的方法，包括W下步驟：
[0147] 本實(shí)施例所使用的試劑如下：
[0148] 1)棚酸鹽緩沖液，其摩爾濃度為0. 01M，其制備方法示例如下：稱取0. 31g棚酸溶 于400血d地2〇中，用0.Imol/L的化OH調(diào)節(jié)抑至9. 0,定容至500血。
[0149] 2化DTA-NaHC〇3混合液，其制備方法如下；取 1. 86g邸TA? 2H2〇 和 16. 8gNaHC〇3， 溶于900血d地2〇中，用1.OM化OH調(diào)整抑至8. 0定容至1000血，高壓滅菌，室溫保存；
[0150] 3HTC邸購買自日本同仁化學(xué)研究所，貨號(hào)M030 ;
[015U 4)低密度脂蛋白溶液；稱取4.Omg低密度脂蛋白溶于4. 0血0. 01MpH9. 0棚酸鹽 緩沖液中，充