一種生物發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種生物發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]熊果苷，又名熊果甙、熊果素、熊果葉甙、熊果酚甙或楊梅甙，是一種源于杜鵑花科熊果屬的多年生常綠小灌木植物-熊果的葉子細胞里的皮膚脫色成份。
[0003]熊果苷是源于綠色植物的天然活性物質(zhì)，集“綠色植物、安全可靠”和“高效脫色”三者合諧統(tǒng)一于一體的皮膚脫色組份，它能迅速滲入肌膚，在不影響細胞增殖濃度的同時，能有效地抑制皮膚中的酪氨酸酶的活性，阻斷黑色素的形成，通過自身與酪氨酶直接結(jié)合，加速黑色素的分解與排泄，從而減少皮膚色素沉積，祛除色斑和雀斑，而且對黑色素細胞不產(chǎn)生毒害性、刺激性、致敏性等副作用，同時還有殺菌、消炎的作用。它是當今流行的最為安全有效美白原料，也是二十一世紀的理想皮膚美白祛斑活性劑。
[0004]熊果苷能有效地抑制皮膚中的生物酪氨酸酶活性，阻斷黑色素的形成，通過自身與酪氨酶直接結(jié)合，加速黑色素的分解與排泄，從而減少皮膚色素沉積，祛除色斑和雀斑，是目前國內(nèi)外常用于美白化妝品中的主要原料。近年來，國內(nèi)熊果苷的生產(chǎn)和相關(guān)化妝品的開發(fā)有了迅速的發(fā)展，國外對熊果苷的研宄和開發(fā)更為深入，并取得了許多進展。熊果素有α和β兩型，研宄發(fā)現(xiàn)，α型對酪氨酸酶活性的抑制力比β型強約10倍。α型熊果苷的美白機理是直接抑制酪氨酸酶活性，從而達到減少黑色素的生成，同時還發(fā)現(xiàn)，濃度為I mM的α型熊果苷未見抑制細胞生長，而β型熊果苷在同樣濃度則出現(xiàn)有效的抑制，進一步說明α型熊果苷不是通過殺死黑素細胞來實現(xiàn)人體皮膚的美白效果的。此外，α型熊果苷與人體黑素瘤細胞培養(yǎng)過程中未發(fā)現(xiàn)對苯二酚的存在。這不僅說明了 α型熊果苷在使用過程中是穩(wěn)定的，而且進一步說明了 α型熊果苷的美白作用是其本身的作用而不是其通過分解對苯二酚來實現(xiàn)。而β型熊果苷會使人體降低人體自身對紫外線的防御。因此使用α型熊果苷作為化妝品添加劑比β型熊果苷更安全，且對人體沒有任何副作用。
[0005]目前國內(nèi)外對于α型熊果苷的研宄較多，其中國外對于熊果苷的研宄比較充分，同時已經(jīng)有了在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用，而國內(nèi)研宄熊果苷并沒有十分深入，對于制備熊果苷的方法主要是通過化學方法合成，但是通過化學方法合成的方式并不能生產(chǎn)α熊果苷，而對于發(fā)酵方法生產(chǎn)國內(nèi)也只是在前期研宄的過程中，并沒有報道可以成功進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。申請?zhí)枮?01110431955.9的中國專利公開了一種利用脂肪酶催化合成α -熊果苷的方法，其能夠通過假絲酵母脂肪酶催化合成α -熊果苷，但是其合成過程比較復(fù)雜，對于大規(guī)模生產(chǎn)不易控制，且生產(chǎn)成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于為了克服以上現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種生物發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)α熊果苷的大規(guī)模生產(chǎn)，同時工藝過程簡單易控，α熊果苷合成轉(zhuǎn)化率高。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種生物發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷的方法，利用液化面粉、麩皮、碳酸鈣、磷酸二氫鉀、乙二胺四乙酸二鈉和尿素作為發(fā)酵基質(zhì)，在其中加入對苯二酚，利用米曲霉{Aspergillusoryzae)進行發(fā)酵制備而成。
[0008]所述的生物發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷的方法，步驟如下:
步驟一，將小麥面粉加入水中進行液化，得到液化面粉；
步驟二，將麩皮、碳酸鈣、磷酸二氫鉀、乙二胺四乙酸二鈉和尿素加入到液化面粉中，攪拌混合均勻，得到混合基體；
步驟三，將米曲霉{Aspergillus oryzae)接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，于40_42°C的條件下培養(yǎng)活化5-10小時；
步驟四，將步驟三中的米曲霉接入步驟二的混合基體中，在38-40°C的條件下培養(yǎng)3-6小時，然后在混合基體中加入對苯二酚，混合均勻，保持發(fā)酵溫度42-45°C，發(fā)酵時間24-48小時，得到發(fā)酵混合物；
步驟五，將發(fā)酵混合物加入到乙醇中浸泡3-5小時，并加入0.1M的鹽酸，混合均勻，超聲提取20-30分鐘，過濾得到濾液一；
步驟六，將濾液一采用納濾的方式過濾，得到濾液二 ；
步驟七，將濾液二進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到α熊果苷。
[0009]所述的生物發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷的方法，步驟一中小麥面粉液化的方法為在小麥面粉中加入10-15倍重量份的水，攪拌混合均勻，然后加熱至80-85°C，攪拌30-40分鐘，得到液化面粉。
[0010]所述的生物發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷的方法，步驟二中加入麩皮與小麥面粉的質(zhì)量比為0.1-0.3:1，加入碳酸鈣與小麥面粉的質(zhì)量比為0.04-0.06:1，加入磷酸二氫鉀與小麥面粉的質(zhì)量比為0.02-0.05:1，加入乙二胺四乙酸二鈉與小麥面粉的質(zhì)量比為0.01-0.03:1，加入尿素與小麥面粉的質(zhì)量比為0.01-0.03:1。
[0011]所述的生物發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷的方法，步驟三中米曲霉的接種量為0.6_1%。
[0012]所述的生物發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷的方法，步驟四中米曲霉的接種量為0.3-0.5%。
[0013]所述的生物發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷的方法，步驟四中對苯二酚加入的量為混合基體中固體物質(zhì)質(zhì)量的0.04-0.08%，對苯二酚的加入方式為以噴霧的形式噴到混合基體表面。
[0014]所述的生物發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷的方法，步驟五中的乙醇為無水乙醇，加入無水乙醇與混合基體的質(zhì)量比為1-2:1。
[0015]所述的生物發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷的方法，步驟五中加入鹽酸的量為加入乙醇量的1-4% ο
[0016]所述的生物發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷的方法，步驟六中納濾采用的納濾膜的截留分子量是 200-400Da。
[0017]本發(fā)明提供了一種利用微生物發(fā)酵合成α熊果苷的方法，發(fā)明人在大量實驗的基礎(chǔ)上創(chuàng)造性的發(fā)現(xiàn)，通過米曲霉可以進行發(fā)酵生產(chǎn)α熊果苷，而通過利用液化面粉、麩皮、碳酸鈣、磷酸二氫鉀和尿素作為發(fā)酵基質(zhì)，通過在發(fā)酵過程中加入對苯二酚，能夠發(fā)酵制備得到α熊果苷，而在分離α熊果苷的過程中，采用了納濾的手段，可以有效的截留濾液中的離子，從而達到有效的分離α熊果苷的作用。相對于常用的大孔樹脂分離α熊果苷的方式，使用納濾的手段提高了效率，簡化了工藝，同時達到了非常好的分離效果。發(fā)明人在研宄的過程中，按照常規(guī)的方式在發(fā)酵過程中加入了對苯二酚和葡萄糖，結(jié)果顯示加入葡萄糖后，最終得到α熊果苷的轉(zhuǎn)化率反而降低，另外，在培養(yǎng)基中加入乙二胺四乙酸二鈉可以有助于提高α熊果苷提取純度和轉(zhuǎn)化率。由此可見，采用本發(fā)明提供的發(fā)酵基質(zhì)進行發(fā)酵可以更好的制備得到α熊果苷。
[0018]【具體實施方式】:
下面通過【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0019]本發(fā)明在對濾液一進行精濾的過程中，為了能夠除去濾液一中的雜質(zhì)離子，采用了納濾的手段，通過納濾可以進一步對濾液中的α熊果苷進行了純化，提高了收率，同時方便利后期可以更好的對α熊果苷進行提純處理。本發(fā)明采用的納濾膜為能夠有效去除鈣鎂離子以及其他重金屬離子的膜，可以使用乙酸纖維素系聚合物、聚酰胺、磺化聚砜、聚丙烯腈、聚酯、聚酰亞胺和乙烯基聚合物等高分子材料。這些膜都可以從市場上直接購買獲得。
[0020]實施例1
一種生物