一種磁性固定化熒光素酶的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程領域，具體涉及一種磁性固定化熒光素酶的制備方法。
【背景技術】
[0002] 磁性高分子微球是近年發(fā)展起來的一種新型磁性材料，是通過適當方法將磁性無 機粒子與有機高分子結(jié)合形成的具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的復合微球。磁性復合微球不僅 具有普通高分子微球的眾多特性還具有磁響應性。目前，磁性復合微球已廣泛用于生物醫(yī) 學、細胞學和分離工程等諸多領域。制備磁性高分子微球的高分子材料主要有天然高分子 和合成高分子。天然高分子有纖維素、明膠等。合成高分子材料主要有聚苯乙烯、聚丙烯酸 及其共聚物、聚酰胺類、和聚苯胺等。主要方法有包埋法、懸浮聚合法、乳液聚合法、分散聚 合法及原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法等。
[0003]固定化酶是通過物理的或化學的方法，將酶分子束縛在載體上，在保持其高效專 一及溫和的酶催化反應特性的同時，又克服了游離酶的不足之處，呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離 回收容易、可多次重復使用、操作連續(xù)可控等優(yōu)點。
[0004] 傳統(tǒng)酶的固定化方法雖在一定程度上可以增強生物催化劑的穩(wěn)定性，但增強幅度 有待進一步提高，并且在此過程中，生物催化劑酶催化活力通常損失嚴重。運用當代高新技 術和設計合成新型載體以及兩者的有機結(jié)合是引人注目的研宄動向。因此目前不斷地有 新的載體和技術引入每的固定化領域，如：無載體固定化、微波/超聲輔助的固定化、陽光 照射、離子液體，電輔助固定化等等，且固定化生物催化劑的應用也越來越廣泛地應用于醫(yī) 療、生物醫(yī)藥、環(huán)境保護、食品工業(yè)、化學工業(yè)、能源領域等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是一種磁性固定化熒光素酶的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟： (一）制備四氧化三鐵磁性微球： (1) 將水合物FeS04 ? 7H20和Fe2 (S04) 3 ? 9H20加入反應介質(zhì)中，通入氮氣，攪拌至均相 體系； (2) 升溫至85°C，加入堿溶液進行反應，反應120分鐘以上，然后降至室溫； (3) 將反應得到的Fe304以去離子水沖洗10遍以上，然后將其分散于有機載體中，形成 磁流體； (4) 將步驟（3)得到的磁流體、甲基丙烯酸甲酯、表面活性劑、二乙烯基苯、正己烷、聚乙 烯醇、過氧化苯乙酰和去離子水加入反應釜中，在恒溫下不斷攪拌形成乳液； (5) 加入引發(fā)劑反應，時間為200分鐘以上； (6) 熟化； (7) 冷卻，篩選，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗5遍以上，得到聚甲基丙烯酸甲酯微 球； (二）焚光素酶的固定： (1) 將熒光素酶加入緩沖液中，使熒光素酶的終濃度為1. 5-3g/L，浸泡1小時以上； (2) 加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，攪拌； (3) 按體積比加入 0? 1-0. 2%tween80、0. 1-0. 2%tween20、TritonX-100 0? 1-0. 2% 和 5-7%固化劑，攪拌，固化200分鐘以上； (4) 使用磁力架進行磁性分離，倒掉上層清液； (5) 使用緩沖液沖洗。
[0006] 所述有機載體為正己烷和異丙醇的混合物，其中正己烷和異丙醇的體積比為2:3。
[0007] 所述表面活性劑為CTAB和苯扎溴銨。
[0008]所述熟化的溫度為75_80°C，時間為3小時以上。
[0009] 所述引發(fā)劑為過硫酸鉀，加入0? 25%〇。
[0010] 步驟(二）（1)中使用磷酸鹽緩沖液，步驟(二）（5)中使用h印es緩沖液沖洗10遍 以上。
[0011] 步驟(二）在溫度4-20°C環(huán)境中進行。
[0012] 在步驟(二）過程中加入0? 05-0. 1%的BSA。
[0013] 所述固化劑為三聚磷酸鈉、戊二醛和sulfo-NHS(N-羥基硫代琥珀酰亞胺）中的 一種或幾種。優(yōu)選為三聚磷酸鈉和sulfo-NHS。
[0014] 本發(fā)明制備的微球生物相容性好，非常適于基因測序的過程中用于酶的固定。本 發(fā)明的制備方法中的步驟易于操作，原料成本低，能夠適應大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。以本發(fā)明制 備的微球粒徑較小而均一，能夠順利的進行核酸測序反應酶的固定，得到的微球質(zhì)地均勻， 有較好的理化穩(wěn)定性，磁響應性高，還可應用于生物工程中大分子的連接與分離。聚甲基丙 烯酸甲酯微球透光率大，便于測序儀的信號讀取，使噪點更清晰、測算更精確。經(jīng)過本發(fā)明 的方法處理后，熒光素酶性質(zhì)非常穩(wěn)定，效率提高，催化反應過程容易控制，機械強度高，可 重復使用，適合應用于高通量的基因組測序過程中。
【具體實施方式】
[0015] 實施例1 (一）制備四氧化三鐵磁性微球： (1) 將水合物FeS04 ? 7H20 0?lmol和Fe2 (S04) 3 ? 9H20 0? 3mol加入 1L去離子水和乙二 醇的混合液中，通入氮氣，攪拌至均相體系； (2) 升溫至 92°C，加入 3molK0H，0.03molFe(0H)2,0.09molFe(0H)3,反應 120 分鐘， 然后降至室溫； (3) 將反應得到的Fe304以去離子水沖洗10遍，然后將其分散于正己烷和異丙醇中，其 中正己烷和異丙醇的體積比為2:3,形成磁流體； (4) 將步驟（3)得到的磁流體、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴銨、二乙烯基苯、正己烷、 聚乙烯醇、過氧化苯乙酰和去離子水加入反應釜中，在恒溫下不斷攪拌形成乳液； (5) 加入占乳液體系重量比0. 25%。的過硫酸鉀，時間為230分鐘； (6) 熟化，75°C，時間為3小時； (7) 冷卻，篩選，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗6遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球； (二）熒光素酶的固定，于12-18°C環(huán)境中： (1) 將熒光素酶加入磷酸鹽緩沖液中，使熒光素酶的終濃度為2. 5g/L，再加入0. 08%的 BSA，浸泡1小時； (2) 加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，攪拌； (3)加入0.159^￥661180、0.159^￥661120、0.2%1'1^仂1^-100、2%三聚磷酸鈉和 4%sulf〇-NHS，持續(xù)攪拌，固化230分鐘； (4) 使用磁力架進行磁性分離，倒掉上層清液； (5) 使用hepes緩沖液沖洗10遍； 實施例2 (一） 制備四氧化三鐵磁性微球： (1) 將水合物FeS04 ? 7H20 0? 22mol和Fe2 (S04) 3 ? 9H20 0? 3mol加入 1L去離子水，乙醇 和乙二醇的混合液中，通入氮氣，攪拌至均相體系； (2) 升溫至90°C，加入堿溶液進行反應，反應130分鐘，然后降至室溫； (3) 將反應得到的Fe304以去離子水沖洗10遍以上，然后將其分散于正己烷和異丙醇 中，其中正己烷和異丙醇的體積比為2:3,形成磁流體； (4) 將步驟（3)得到的磁流體、甲基丙烯酸甲酯、CTAB、苯扎溴銨、二乙烯基苯、正己烷、 聚乙烯醇、過氧化苯乙酰和去離子水加入反應釜中，在恒溫下不斷攪拌形成乳液； (5) 加入占乳液體系重量比0. 25%。的過硫酸鉀，時間為210分鐘； (6) 熟化，80°C，時間為3. 5小時； (7) 冷卻，篩選，真空干燥，使用80%以上乙醇清洗5遍，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球； (二） 熒光素酶的固定，于8-12°C環(huán)境中： (1) 將熒光素酶加入磷酸鹽緩沖液中，使熒光素酶的終濃度為3g/L，再加入0. 1%的 BSA，浸泡1小時； (2) 加入聚甲基丙烯酸甲酯微球，攪拌； (3) 加入 0?l%tween80、0. 2%tween20、0. 1%TritonX-100 和 5% 戊二醛，持續(xù)攪拌，固化 200分鐘； (4) 使用磁力架進行磁性分離，倒掉上層清液； (5) 使用h印es緩沖液沖洗15遍； 實施例3 (一）制備四氧化三鐵磁性微球： (1) 將水合物FeS04 ? 7H20 0? 15mol和Fe2 (S04) 3 ? 9H20 0? 35mol加入 1L去離子水，乙 醇和乙二醇的混合液中，通入氮氣，攪拌至均相體