括與位于選自W下一組PR0KR2分子的一個或多個區(qū)域或鏈段內的一 個或多個氨基酸相互作用的抗PR0KR抗體；(a)N端細胞外區(qū)域（序列號178,第1至54位 氨基酸）；化）細胞外環(huán)1(序列號178,第110至137位氨基酸）；（c)細胞外環(huán)2 (序列號 178,第193至221位氨基酸）；W及/或細胞外環(huán)3 (序列號178,第297至310位氨基酸）。
[0061] 抗體結合的表位可包含位于上述任何PROKR1和/或PROKR2區(qū)域或鏈段內由3個 或更多個（如 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或W上）氨基酸組成 的單個連續(xù)序列?；蛘?，該表位可包含位于上述一個或多個PROKR分子區(qū)域或鏈段內的多 個非連續(xù)氨基酸（或氨基酸序列）。例如，本發(fā)明的抗體可與位于PROKR1的N端細胞外區(qū) 域內的一個或多個氨基酸相互作用，也可W與位于一個或多個PROKR1細胞外環(huán)內的一個 或多個氨基酸相互作用。
[0062] 本領域內普通技術人員所熟知的各種技術都可用于確定抗體是否與多膚或蛋 白質內的"一種或多個氨基酸相互作用"。示例性巧術巧巧如Antibodies,Harlowand Lane(ColdSpring化rborPress,ColdSpring化rb.，NY)中所述的常規(guī)交叉阻斷檢測、 丙氨酸掃描突變分析、膚印跡分析化eineke，2004,MethodsMolBiol248 ;443-463)和膚 切割分析。此外，還可采用諸如抗原的表位切除、表位提取和化學修飾等方法（Tomer, 2000， ProteinScience9 ;487-496)。可用于識別與抗體相互作用的多膚內氨基酸的另一種方法 是通過質譜法檢測氨/気交換。總的來說，氨/気交換方法設及用気標記目標蛋白質，隨后 將抗體與気標記的蛋白質結合。然后，將蛋白質/抗體復合物轉移到水中，W允許在除了由 抗體（其保持気標記）所保護的殘基W外的所有殘基處發(fā)生氨-気交換?？贵w解離后，對目 標蛋白質進行蛋白酶切割和質譜分析，由此顯示對應于與抗體相互作用的特定氨基酸的気 標記的殘基。請參閱例如1^虹;[]1肖（1999)4]131八;[0318;[0油6111131:巧267(2);252-259 出]1徑6]1 andSmith(2001)Anal.Qiem.73;256A-265A。X射線晶體學也可W用于抗原/抗體復合物 的表位作圖。
[0063] 本發(fā)明還包括與本文所描述的任何特異性示例性抗體（如化M6386N、肥M6385N、 H4H6663P、H4H6669P、H4H6671P、H4冊680P、H4冊690P、H4H6696P、H4H6698P、H4H6701P、 H4冊706P等）結合于同一表位的抗PR0KR抗體。同樣地，本發(fā)明還包括與本文所描述的任 何特異性示例性抗體（如化M6386N、肥M6385N、H4冊663P、H4冊669P、H4冊671P、H4冊680P、 H4冊690P、H4冊696P、H4冊698P、H4冊701P、H4冊706P等）競爭性結合于PR0KR1和/或 PR0KR2的抗PR0KR抗體。
[0064] 使用本領域中已知的常規(guī)方法，人們可W很容易地確定某一抗體是否與參照抗 PR0KR抗體結合于同一表位或與參照抗PR0KR抗體競爭性結合。例如，為了確定某一待測 抗體是否與本發(fā)明的參照抗PR0KR抗體結合于同一表位，就讓參照抗體與PR0KR蛋白結合。 然后，評估待測抗體與PR0KR分子結合的能力。如果待測抗體在與參照抗PR0KR抗體飽和 結合之后能夠與PR0KR結合，就可W得出待測抗體和參照抗PR0KR抗體與不同表位結合的 結論。否則，如果待測抗體在與參照抗PR0KR抗體飽和結合之后不能與PR0KR分子結合，則 待測抗體就可能與本發(fā)明的參照抗PR0KR抗體所結合的同一表位結合。然后可W進行其他 常規(guī)實驗（如膚突變和結合分析），W證實所觀察到的待測抗體之缺乏結合實際上是由于 待測抗體與參照抗體結合于同一表位所致，還是由于空間阻斷（或另一種現象）導致所觀 察到的缺乏結合。此類實驗可通過化ISA、RIA、Biacore、流式細胞術或本領域中可用的其 他任何定量或定性抗體結合檢測方法來進行。根據本發(fā)明的某些實施方案，如果如1倍、5 倍、10倍、20倍或100倍過量的一種抗體抑制另一種抗體的結合達至少50%，但更好的情 況是75%、90%或甚至99%，如在競爭性結合檢測中所測量（請參閱如化n曲ansetal.，CancerRes. 1990 ;50 ;1495-1502)，則該兩種抗體就結合于同一（或重疊）表位。或者，如 果抗原中降低或消除一種抗體結合的幾乎所有氨基酸突變都能降低或消除另一種抗體的 結合，則該兩種抗體就被視為結合于同一表位。如果降低或消除一種抗體結合的氨基酸突 變中僅有某個亞組的突變能夠降低或消除另一種抗體的結合，則該兩種抗體就被視為結合 于"重疊表位"。
[00化]為了確定某一抗體是否與參照抗PROKR抗體競爭性結合，則在兩個方向實施上述 結合方法；在第一個方向，讓參照抗體在飽和條件下與PROKR蛋白結合，隨后評估待測抗體 與PROKR分子的結合。在第二個方向，讓待測抗體在飽和條件下與PROKR分子結合，隨后評 估參照抗體與PROKR分子的結合。如果在兩個方向上都只有第一個（飽和）抗體能夠與 PROKR分子結合，則可W得出待測抗體和參照抗體與PROKR競爭性結合的結論。如同本領 域內普通技術人員所熟知的，與參照抗體競爭性結合的抗體未必與參照抗體結合于同一表 位，而是可結合于某個重疊或相鄰表位，從而在空間上阻斷參照抗體的結合。 人源抗體的制備
[0066] 用于產生單克隆抗體，包括完全人源單克隆抗體的方法是本領域已知的。任何此 類已知的方法都可在本發(fā)明的情況下用于產生與人類PROKR特異性結合的人源抗體。
[0067] 采用VELOCIMMUNETM技術或其他產生單克隆抗體的相似方法，初步分離出對PROKR具有高親和力的含有一個人類可變區(qū)和一個小鼠恒定區(qū)的嵌合抗體。如下面實驗部 分中所顯示，確定并選擇具有所需特性，包括親和力、選擇性、表位等的抗體。小鼠恒定區(qū) W所需的人類恒定區(qū)替換，W產生本發(fā)明的完全人源抗體，如野生型或經過修飾的IgGl或 IgG4。選定的恒定區(qū)可因具體用途而異，高親和力抗原結合和祀標特異性特征則保留在可 變區(qū)內。 生物等效物
[0068] 本發(fā)明的抗PROKR抗體和抗體片段包括某些蛋白，其含有的氨基酸序列不同于所 述抗體的氨基酸序列，但保留了與人類PROKR結合的能力。當與親本序列相比時，此類變異 體抗體和抗體片段包含一個或多個氨基酸添加、缺失或替換，但顯示出與所述抗體基本上 等同的生物學活性。同樣地，當與所公開的序列相比時，本發(fā)明的編碼抗PROKR抗體的DNA 序列含有的序列包含一個或多個核巧酸的添加、缺失或替換，但可編碼與本發(fā)明的抗PROKR 抗體或抗體片段生物學上基本等效的抗PROKR抗體或抗體片段。此類變異體的氨基酸和 DNA序列的實例已在上面討論。
[0069] 如果例如兩種抗原結合蛋白或抗體是醫(yī)藥等效物或醫(yī)藥替換物，當在相似實驗條 件下W單劑或W多劑方式W相同摩爾劑量給藥時，其吸收速率和程度未顯示出顯著差異， 則視它們具有生物等效性。對于某些抗體，如果它們的吸收程度相當但吸收速率并不相當， 也將視為是等效物或醫(yī)藥替換物，并仍可視為具有生物等效性，因為吸收速率的差異是有 意設計并反映在標簽上，而且此類差異對于達到有效的體內藥物濃度并不重要（如慢性用 途），并認為對于所研究的特定醫(yī)藥產品在醫(yī)學上并不重要。
[0070] 在一個實施方案中，如果兩種抗原結合蛋白在安全性、純度和藥效方面沒有臨床 意義上的差異，則它們具有生物等效性。
[0071] 在一個實施方案中，如果患者可W在參照產品和生物產品之間轉換一次或多次而 預期不會增加出現副作用的風險，包括與無轉換的連續(xù)治療相比在免疫原性方面沒有臨床 意義上的變化或有效性降低，則該兩種抗原結合蛋白具有生物等效性。
[0072] 在一個實施方案中，如果兩種抗原結合蛋白在使用條件下都通過一種或多種共同 的作用機制起作用，且此類機制是已知的，則它們具有生物等效性。
[0073] 生物等效性可通過體內和體外方法來證明。生物等效性的測量方法包括如（a)人 體或其他哺乳類動物的體內試驗，其中血液、血漿、血清或其他生物體液中抗體或其代謝物 的濃度作為時間的函數來測量；化）已與人體體內試驗生物利用度數據建立了相關性并可 合理預測人體體內試驗生物利用度數據的體外試驗；（C)人體或其他哺乳類動物的體內試 驗，其中抗體（或其祀標）的適當的急性藥理作用是作為時間的函數來測量的；W及（d)有 良好對照的臨床試驗，可確定抗體的安全性、療效，或生物利用度或生物等效性。
[0074] 可通過如對無助于生物學活性的殘基或序列進行各種替換，或刪除無助于生物學 活性的端部或內部殘基或序列，來構建本發(fā)明的抗PROKR抗體的生物等效變異體。例如，可 刪除或W其他氨基酸替換對于生物學活性無關緊要的半脫氨酸殘基，W防在復性時形成不 必要或不正確的分子內二硫鍵。在其他情況下，生物等效抗體可包括包含修飾所述抗體的 糖基化特征的氨基酸改變（如消除或去除糖基化的突變）的抗PROKR抗體變異體。 物種選擇性和物種交叉反應性
[00巧]本發(fā)明包括與人類PROKR(如細胞表面表達的人類PROKR1和/或細胞表面表達的 人類PR0K喲結合，但不與來自其他物種的PROKR結合的抗PROKR抗體。本發(fā)明還包括與 人類PROKR(如細胞表面表達的人類PR0KR1和/或細胞表面表達的人類PR0KR2)結合，并 同時與來自一個或多個非人類物種的一個或多個PROKR蛋白結合的抗PROKR抗體。本發(fā)明 還包括阻斷前動力蛋白介導的人類PR0KR1和/或人類PR0KR2活化，但不阻斷前動力蛋白 介導的一種或多種非人類PROKR活化的抗PROKR抗體。本發(fā)明還包括阻斷前動力蛋白介導 的人類PR0KR1和/或人類PR0KR2活化，也阻斷前動力蛋白介導的一種或多種非人類PROKR 活化的抗PROKR抗體。
[0076] 例如，本發(fā)明的抗PROKR抗體可結合及/或阻斷人類PR0KR1和/或人類PR0KR2， 并可結合及/或阻斷（或不結合或不阻斷，視情況而定）一種或多種小鼠、大鼠、豚鼠、地 鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔子、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、食蟹猴、滅猴、擲猴或黑猩猩的PR0KR1 或PR0KR2。例如，如本文實施例5中所顯示，本發(fā)明的某些示例性抗體阻斷PK1介導的 人類PR0KR1活化，還阻斷PK1介導的猴PR0KR1活化（如H4冊696、H4冊698、H4冊701和 H4冊385)。另一方面，抗體H1M6386表現出強效的阻斷PK1介導的人類PR0KR1活化的作用， 但并未表現出任何可檢測到的對PK1介導的猴PR0KR1活化的阻斷作用。在審閱了本文所 提供的具體實施例后，對本領域內普通技術人員而言，本發(fā)明的示例性抗PROKR抗體的其 他交叉反應/交叉阻斷模式將變得明顯。 多特異性抗體
[0077] 本發(fā)明的抗體可W是單特異性、雙特異性或多特異性。多特異性抗體可W是 特異于一個祀多膚的不同表位，或者可W包含特異于一個W上祀多膚的抗原結合結構 域。請參閱如化ttetal.，1991，J.Immunol. 147 ；6〇-69；Kuferetal. ,2004,Trends Biotechnol.22 ;238-244。本發(fā)明的抗PROKR抗體可W與另一個功能性分子（如另一種膚 或蛋白質）連接或共表達。例如，抗體或其片段可W與一個或多個其他分子實體（如另一 種抗體或抗體片段）功能性地連接（如通過化學偶聯、基因融合、非共價結合或其他方式），W產生具有第二結合特異性的雙特異性或多特異性抗體。例如，本發(fā)明包括雙特異性抗體， 其中免疫球蛋白的一個臂特異于人類PROKR或其片段，而免疫球蛋白的另一個臂則特異于 第二治療祀標或共輛至治療性基團。本發(fā)明包括雙特異性抗體，其包含一個與PR0KR1特異 性結合的第一抗原結合結構域和一個與PR0KR2特異性結合的第二抗原結合結構域。
[007引可W在本發(fā)明的情況下使用的示例性雙特異性抗體形式設及使用一個第一免疫 球蛋白（Ig)CH3結構域和一個第二Ig句3結構域，其中第一和第二Ig句3結構域彼此相 差至少一個氨基酸，且與沒有氨基酸差異的雙特異性抗體相比，其中至少一個氨基酸差異 降低了雙特異性抗體與蛋白A的結合。在一個實施方案中，第一IgCh3結構域與蛋白A結 合，而第二IgCh3結構域含有一個降低或消除其與蛋白A結合的突變，如H95R修飾（按照 IMGT外顯子編號；按照抓編號為H435R)。第二Ch3還可W包含Y96F修飾（按照IMGT編 號；按照歐盟編號為Y436巧?？稍诘诙﨏h3內發(fā)現的其他修飾包括；對于IgGl抗體；D16E、 L18M、M4S、K52N、V57M和V82I(按照IMGT編號；按照抓編號分別為D356E、L358M、N384S、 K392N、V397M和V422I);對于IgG2抗體；M4S、K52N和V82I(按照IMGT編號；按照歐盟編