五分鐘后，將17引物添加到該反應混合物中以引發(fā)指數(shù)級擴增階段，該階段也 在42°C下進行，伴有實時檢測。使用與如在實例1中所述的標準單階段正向TMA形式中相 同的引物和檢測探針進行該單階段對照實驗。
[0120] 該HPV16擴增實驗的結果示出于圖7A-圖7C中。如圖7A所示，該單階段形式能 夠檢測最低至約500拷貝/毫升（約200拷貝/反應）的靶模板，而該雙階段形式使靈敏 度改善了 15倍以上，達到約30拷貝/毫升（約13拷貝/反應）（圖7B)。此外，與我們先 前的觀察相符，相比于單階段形式，該雙階段擴增形式與檢測時間的顯著減少相關聯(lián)（圖 7C)。
[0121]實例 5
[0122] PCA3的雙階段擴增
[0123] 此外，用前列腺癌抗原3 (PCA3)測試該雙階段擴增形式。
[0124] 使用類似的雙階段擴增方案。簡而言之，17引物在靶捕獲期間雜交至靶PCA3序 列，然后移除過量的17引物。在擴增的第一階段期間，將非17引物與所有必需的擴增試劑 和酶試劑一起添加，額外的17引物和分子火炬檢測探針除外。在42°C下靜置五分鐘后，將 T7引物和檢測探針添加到該反應混合物中以起始指數(shù)級擴增階段，該階段也在42°C下進 行，伴有實時檢測。使用與標準單階段TMA形式中相同的引物和檢測探針進行該單階段對 照實驗。
[0125] 該PCA3擴增實驗的結果示出于圖8A-圖8C中。如從圖8A-圖8B可見，相比于標 準單階段形式，雙階段形式在分析物濃度低端（約130拷貝/毫升，其等同于約50拷貝/反 應）處獲得顯著改善的靈敏度和精度。此外，類似于我們先前的觀察，相比于單階段形式， 該雙階段擴增形式與檢測時間的顯著減少相關聯(lián)（圖8C)。
[0126]實例6
[0127]PCA3和T2-ERG的雙階段共擴增
[0128] 接下來，我們利用雙階段擴增形式來進行多個靶的同時擴增。在該實例中，使用雙 階段正向TMA方案共擴增PCA3和T2-ERG靶模板，從而確定雙重擴增是否將得到與我們此 前在單重測定中已經觀察到的（實例2-5)相同的靈敏度和精度改善，以及是否提供對在標 準單階段形式中往往會觀察到的分析物之間干擾的減少。
[0129] 簡而言之，17引物在靶捕獲期間雜交至靶PCA3和T2-ERG序列，然后移除過量的 17引物。在擴增的第一階段期間，將非17引物與所有必需的擴增試劑、檢測試劑和酶試劑 一起添加，額外的T7引物除外。在42°C下靜置五分鐘后，將17引物添加到該反應混合物中 以引發(fā)指數(shù)級擴增階段，該階段也在42°C下進行，伴有使用兩個不同的熒光通道（每個靶 一個通道）的實時檢測。使用與如在實例1中所述的標準單階段正向TMA形式中相同的引 物和檢測探針進行該單階段對照實驗。
[0130] 在存在T2-ERG的情況下的PCA3擴增結果示出于圖9A-圖9C。如從圖9A-圖9B 可見，相比于標準單階段形式，雙階段形式在分析物濃度低端（約1，250拷貝/毫升，其等 同于約500拷貝/反應）處獲得顯著改善的靈敏度和精度。這些結果證明該雙階段形式有 效減少了多重反應中分析物之間的干擾。此外，與我們先前的觀察相符，相比于單階段形 式，該雙階段擴增形式與檢測時間的顯著減少相關聯(lián)（圖9C)。
[0131] 在存在PCA3的情況下的T2-ERG擴增結果示出于圖9D-圖9F中。如圖9D所示，該 單階段形式能夠檢測最低至約500拷貝/毫升（約200拷貝/反應）的靶模板，而該雙階 段形式使靈敏度改善了至少10倍，達到約50拷貝/毫升（約20拷貝/反應）（圖9E)。這 些結果還證明了該雙階段形式有效減少了多重反應中分析物之間的干擾。此外，與我們先 前的觀察相符，相比于單階段形式，該雙階段擴增形式與檢測時間的顯著減少相關聯(lián)（圖 9F) 〇
[0132] 要注意的是，多重擴增形式中經改善的測定靈敏度和精度，以及減少的競爭反應 間干擾的組合優(yōu)點（即，如通過單一分析物和雙分析物性能的比較所證實的那樣，諸如如 圖8A所示的單階段形式中僅PCA3的性能，其中1. 1 X 103個拷貝產生強信號，以及如圖9A 所示的單階段形式中在存在T2的情況下PCA3的性能，其中1. 25X 103個PCA3拷貝產生弱 信號（由于來自T2的干擾），以及如圖9B所示的雙階段形式中在存在T2的情況下PCA3 的性能，其中1.25X 103個PCA3拷貝產生非常強的信號，這是因為由T2造成的干擾顯著減 少）是雙階段形式的測定的一般特征。這些顯著的優(yōu)點在此陳述之前并未被預測到。該雙 階段核酸擴增方法的這種特征的其他證明如下。
[0133]實例7
[0134] PCA3、PSA和T2-ERG的雙階段共擴增
[0135] 在該實例中，使用雙階段正向TMA方案共擴增PCA3、PSA和T2-ERG靶模板，從而確 定三重擴增是否將得到與我們此前在單重和雙重測定中已經觀察到的（實例2-6)相同的 靈敏度和精度改善。
[0136] 簡而言之，17引物在靶捕獲期間雜交至靶PCA3、PSA和T2-ERG序列，然后移除過 量的T7引物。在擴增的第一階段期間，將非T7引物與所有必需的擴增試劑、檢測試劑和酶 試劑一起添加，額外的T7引物除外。在42°C下靜置五分鐘后，將T7引物添加到該反應混合 物中以引發(fā)指數(shù)級擴增階段，該階段也在42°C下進行，伴有使用三個不同的熒光通道（每 個靶一個通道）的實時檢測。使用與如在實例1中所述的標準單階段正向TMA形式中相同 的引物和檢測探針進行該單階段對照實驗。
[0137] 在存在PSA和T2-ERG的情況下的PCA3擴增結果示出于圖10A-圖10C。如圖10A 所示，該單階段形式能夠檢測最低至約12, 500拷貝/毫升（約5, 000拷貝/反應）的靶模 板，而該雙階段形式使靈敏度改善了 10倍，達到約1，250拷貝/毫升（約500拷貝/反應） (圖10B)。此外，與我們先前的觀察相符，相比于單階段形式，該雙階段擴增形式與檢測時 間的顯著減少相關聯(lián)（圖10C)。
[0138] 在存在PCA3和PSA的情況下的T2-ERG擴增結果示出于圖10D-圖10F。如圖10D 所示，該單階段形式能夠檢測最低至約5, 000拷貝/毫升（約2, 000拷貝/反應）的靶模 板，而該雙階段形式使靈敏度改善了 100倍，達到約50拷貝/毫升（約20拷貝/反應）（圖 10E)。此外，與我們先前的觀察相符，相比于單階段形式，該雙階段擴增形式與檢測時間的 顯著減少相關聯(lián)（圖10F)。
[0139] 在存在PCA3和T2-ERG的情況下的PSA擴增結果示出于圖10G-圖101。如圖10G 所示，該單階段形式能夠檢測最低至約125, 000拷貝/毫升（約50, 000拷貝/反應）的靶 模板，而該雙階段形式使靈敏度改善了 10倍以上，達到約12, 500拷貝/毫升（約500拷貝 /反應）（圖10H)。此外，與我們先前的觀察相符，相比于單階段形式，該雙階段擴增形式與 檢測時間的顯著減少相關聯(lián)（圖101)。
[0140]實例8
[0141] T2-ERG的雙階段反向TMA形式擴增
[0142] 在該實例中，我們使用T2-ERG作為靶模板測試了雙階段反向TMA方案。這與所有 的先前操作實例相反，其中使用各種正向TMA方案。反向TMA的概述在上文中是結合單引 物擴增陳述的。
[0143] 在此處所用的雙階段反向TMA方案中，非17引物在靶捕獲期間雜交至靶T2-ERG 序列的3'端，然后移除過量的非17引物。該擴增過程被分成兩個不同的階段。在第一階 段期間，將17啟動子提供者與所有必需的擴增試劑、檢測試劑和酶試劑一起引入，額外的 非17引物除外。該17啟動子提供者在3'端處被阻斷，從而使該17啟動子提供者無法酶促 地延伸。在存在逆轉錄酶的情況下，延伸雜交至該靶的非17引物，構建cDNA拷貝，并且通 過該逆轉錄酶的RNaseH活性使靶RNA模板降解。該17啟動子提供者隨后雜交至該cDNA 的3'端，并且進一步延伸該cDNA的3'端，從而填充該17啟動子提供者的啟動子區(qū)并且構 建有活性的雙鏈模板。17聚合酶隨后從該模板產生與該靶模板相同的多個RNA轉錄物。因 為在第1階段的擴增混合物中沒有非T7引物可用，所以該反應無法進一步進行。然后用非 17引物的添加起始第二階段，從而引發(fā)在第1階段中產生的RNA轉錄物庫的指數(shù)級擴增。
[0144] 雙階段反向TMA實驗的結果示出于圖11B。圖11A示出經改進以模擬該雙階段形 式的對照單階段反向TMA實驗的結果。更具體地講，在靶捕獲步驟期間添加該非17引物 (使得從該方案中消除標準的60°C退火步驟）；在第一階段中未添加引物或酶試劑；并且將 非17引物和17啟動子提供者以及酶試劑添加至第二階段以引發(fā)指數(shù)級擴增。如從圖11A 和圖11B可見，相比于改進的單階段反向TMA形式，雙階段反向TMA形式在分析物濃度低端 (約50拷貝/反應）處獲得顯著改善的靈敏度和精度。再次地，該雙階段形式獲得在精度 和較短檢測時間方面的優(yōu)越性能（圖11C)。
[0145]實例9
[0146] T2-ERG、PCA3、PSA和CAP的雙階段反向TMA形式共擴增
[0147] 在該實例中，使用兩個不同的雙階段反向TMA方案共擴增T2-ERG、PCA3、PSA和內 部對照（CAP)靶模板，從而確定四重擴增是否將得到與我們此前在單重、雙重和三重測定 中已經觀察到的（實例2-8)相同的靈敏度和精度改善。
[0148] 在存在500, 000拷貝/反應的PCA3、5, 000, 000拷貝/反應的PSA和5, 000拷貝 /反應的CAP的情況下（空心圓形）或者在僅存在5, 000拷貝/反應的CAP的情況下（實 心菱形），25拷貝/反應的T2-ERG (其非常難以在存在其他靶的情況下以低水平擴增）的 檢測示出于圖12A-圖12C中。圖12A示出以如上文在實例8中所述的改進的單階段反向 TMA形式進行的對照實驗的結果。圖12B示出使用如也在實例8中所述的雙階段反向TMA 形式的雙階段實驗的結果。簡而言之，非17引物在靶捕獲期間雜交至靶T2-ERG、PCA3、PSA 和CAP序列，然后移除過量的非17引物。在擴增的第一階段期間，將17啟動子提供者與所 有必需的擴增試劑、檢測試劑和酶試劑一起添加，額外的非17引物除外。在42°C下靜置五 分鐘后，將非17引物添加到該反應混合物中以引發(fā)指數(shù)級擴增階段，該階段也在42°C下進 行，伴有使用四個不同的熒光通道（每個靶一個通道）的實時檢測。如從圖12A和圖12B 可見，相比于改進的單階段反向TMA形式，雙階段反向TMA形式在存在PCA3、PSA和CAP的 情況下于25拷貝/反應的T2-ERG處獲得改善的靈敏度和精度，以及在僅存在CAP的情況 下于25拷貝/反應的T2-ERG處獲得顯著改善的靈敏度和精度。這些結果還證明了該雙階 段形式有效減少了多重反應中分析物之間的干擾。此外，與我們先前的觀察相符，相比于單 階段形式，該雙階段擴增形式與檢測時間的減少相關聯(lián)。
[0149] 圖12C示出了不同雙階段形式的結果，其中在該反應的第一階段中，PCA3、PSA和 CAP(或者僅CAP)經受線性擴增，而T2-ERG經受指數(shù)級擴增，以及在第二階段中，PCA3、PSA 和CAP經受指數(shù)級擴增，而T2-ERG繼續(xù)指數(shù)級地擴增（所有的四個擴增反應在相同容器中 進行）。靶特異性引物在擴增的不同階段之間的分布在下表1中示出。如從圖12A和圖12C 可見，相比于改進的單階段反向TMA形式，這種不同的雙階段反向TMA形式在存在PCA3、PSA 和CAP的情況下或者在僅存在CAP的情況下于25拷貝/反應的T2-ERG處獲得顯著改善的 靈敏度。如同在先前實例中所述的雙階段形式一樣，這些結果證實這種不同的雙階段形式 有效減少了多重反應中分析物之間的干擾。此外，相比于單階段形式，這種不同的雙階段擴 增形式與檢測時間的減少相關聯(lián)。
[0150]i
【主權項】
1. 一種定量樣品中的靶核酸序列的方法，包括以下步驟： (a) 在允許第一擴增寡核苷酸雜交至所述靶核酸序列的第一部分的條件下，使所述樣 品與特異于所述靶核酸序列的所述第一部分的所述第一擴增寡核苷酸接觸，從而產生包含 所述第一擴增寡核苷酸和所述靶核酸序列的預擴增雜交體； (b) 通過靶捕獲到固體載體上，然后洗滌以移除任何未在步驟（a)中雜交至所述靶核 酸序列的所述第一部分的所述第一擴增寡核苷酸來分離所述預擴增雜交體； (c) 在支持在步驟（b)中分離的所述預擴增雜交體的所述靶核酸序列的至少一部分的 線性擴增但是不支持其指數(shù)級擴增的條件下，在第一階段擴增反應混合物中，在第一階段 的、基本上等溫的、轉錄相關的擴增反應中擴增所述在步驟（b)中分離的所述預擴增雜交 體的所述靶核酸序列的至少一部分，從而獲得包含第一擴增產物的反應混合物， 其中，所述第一階段擴增反應混合物包含第二擴增寡核苷酸，所述第二擴增寡核苷酸 與所述第一擴增寡核苷酸的延伸產物的一部分互補，以及 其中，所述第一擴增產物不是用于在所述第一階段的、基本上等溫的、轉錄相關的擴增 反應期間進行核酸合成的模板； (d) 將包含所述第一擴增產物的所述反應混合物與參與所述第一擴增產物的指數(shù)級擴 增但是在包含所述第一擴增產物的所述反應混合物中缺乏的至少一種組分合并，以產生第 二階段擴增反應混合物， 其中所述第二階段擴增反應混合物另外包含序列特異性雜交探針； (e) 在第二階段的、基本上等溫的、轉錄相關的擴增反應中在所述第二階段擴增反應混 合物中進行所述第一擴增產物的指數(shù)級擴增，從而合成第二擴增產物； (f) 用所述序列特異性雜交探針以固定的時間間隔檢測所述第二階段擴增反應混合物 中所述第二擴增產物的合成；以及 (g) 使用從步驟（f)獲得的結果來定量所述樣品中的所述靶核酸序列。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述第一擴增寡核苷酸包含對于RNA聚合酶的3' 靶特異性序列和5'啟動子序列。
3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述RNA聚合酶是I7RNA聚合酶。
4. 根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述第二擴增寡核苷酸是在所述第 一階段的、等溫的、轉錄相關的擴增反應中酶促延伸的。
5. 根據(jù)權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述固體載體包含經固定的捕獲探 針。
6. 根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的方法， 其中步驟（a)還包括使所述樣品與雜交至所述靶核酸序列的靶捕獲寡核苷酸接觸，并 且 其中所述預擴增雜交體包含雜交至所述靶捕獲寡核苷酸和所述第一擴增寡核苷酸中 的每一者的所述靶核酸序列。
7. 根據(jù)權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述固體載體包含磁性吸引的粒子。
8. 根據(jù)權利要求1至7中任一項所述的方法， 其中所述第一階段和第二階段的、等溫的、轉錄相關的擴增反應中的每一者包含RNA 聚合酶和逆轉錄酶，并且 其中所述逆轉錄酶具有內源性的RNaseH活性。
9. 根據(jù)權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述至少一種組分包含所述第一擴 增寡核苷酸。
10. 根據(jù)權利要求1至9中任一項所述的方法， 其中步驟（c)的所述第一擴增產物是cDNA分子，所述cDNA分子具有與所述樣品中的 所述靶核酸序列相同的極性，并且 其中步驟（e)的所述第二擴增產物是RNA分子。
11. 根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的方法，其中步驟⑷中的所述序列特異性雜 交探針是構象敏感的探針，所述探針在雜交至所述第二擴增產物時產生可檢測的信號。
12. 根據(jù)權利要求1至11中任一項所述的方法，其中步驟（d)中的所述序列特異性雜 交探針是熒光標記的序列特異性雜交探針。
13. 根據(jù)權利要求1至12中任一項所述的方法，其中步驟（g)包括使用線性校正曲線 和從步驟（f)獲得的結果定量所述樣品中的所述靶核酸序列。
14. 根據(jù)權利要求1至13中任一項所述的方法，其中步驟（c)包括在所述第一階段擴 增反應混合物中擴增10倍至10, 〇〇〇倍。
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于核酸擴增的改進方法，所述核酸擴增包括多重擴增，其中所述擴增是在兩種或更多種不同的階段中進行的。所述第一階段擴增反應優(yōu)選地缺乏指數(shù)級擴增所需的一種或多種組分。隨后在擴增的第二、第三或進一步階段(一個或多個)中提供所述缺乏組分，從而導致快速的指數(shù)級擴增反應。所述多階段方案得到在低分析物濃度下更快速和更靈敏的檢測，以及較低的可變性。還公開了用于進行所述受權利要求書保護的方法的組合物。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104755630
【申請?zhí)枴緾N201380053605
【發(fā)明人】N·C·納爾遜, 小萊爾·J·阿諾德, L·戴, S·S·菲爾普斯, J·切利塞里
【申請人】簡·探針公司
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2013年8月30日
【公告號】CA2883219A1, EP2890814A1, US9139870, US20140066326, WO2014036369A1...