一階段擴(kuò)增反應(yīng)。該第一階段擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生多個(gè)第一擴(kuò)增產(chǎn)物， 該第一擴(kuò)增產(chǎn)物隨后在允許該第一擴(kuò)增產(chǎn)物的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增的條件下經(jīng)受第二（或者更晚） 階段擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生多個(gè)第二擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0079] 在第二方面的改進(jìn)型式中，本發(fā)明提供了一種用于擴(kuò)增樣品中的多個(gè)不同靶核酸 序列的方法，其中一些而并非所有靶核酸序列經(jīng)受線性擴(kuò)增，和/或一些而并非所有靶核 酸序列經(jīng)受指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。第一階段擴(kuò)增的至少三個(gè)變型被設(shè)想為：（1)靶序列中的一些經(jīng) 受線性擴(kuò)增，而剩余的則保持為未擴(kuò)增；(2)靶序列中的一些經(jīng)受指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，而剩余的則 保持為未擴(kuò)增；以及（3)靶序列中的一些經(jīng)受線性擴(kuò)增，而剩余的則經(jīng)受指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。因 此，第一階段擴(kuò)增可導(dǎo)致所有靶核酸序列的擴(kuò)增（選項(xiàng)3)或者僅其子集的擴(kuò)增（選項(xiàng)1和 2)。該靶核酸序列的子集可表示已知以相對(duì)較低的量存在的靶和/或相比于其他靶難以擴(kuò) 增的靶。第一階段擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生一種或多種第一擴(kuò)增產(chǎn)物。第一擴(kuò)增產(chǎn)物（一種或多種） 和該樣品中任何未擴(kuò)增的靶核酸序列（一種或多種）然后在允許該序列的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增的條 件下經(jīng)受第二階段擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生多個(gè)第二擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0080] 應(yīng)當(dāng)理解的是上文結(jié)合多階段單重（即，單個(gè)靶）擴(kuò)增討論的各種任選的要素和 參數(shù)也適用于本文所述的多階段多重?cái)U(kuò)增模式。
[0081] C.用于多階段擴(kuò)增的組合物
[0082] 如上所述在第三方面中，本發(fā)明提供用于擴(kuò)增樣品中的靶核酸序列的組合物，該 組合物包括以下組分：(a)擴(kuò)增寡核苷酸，該寡核苷酸雜交至該靶核酸序列的第一部分； (b)任選的靶捕獲寡核苷酸，該寡核苷酸雜交至該靶核酸序列的第二部分；以及（c)擴(kuò)增 酶。本發(fā)明組合物的一個(gè)關(guān)鍵特征是該組合物缺乏靶核酸序列的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增所需的至少一 種組分。如在本申請(qǐng)的其他地方詳細(xì)解釋的，本發(fā)明的組合物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是該組合物幫助 減少非特異性的擴(kuò)增，從而使擴(kuò)增資源集中在靶序列上。
[0083] 在這個(gè)方面，該靶核酸序列可為任何RNA或者DNA序列。在一些實(shí)施例中，該靶序 列的由第一擴(kuò)增寡核苷酸靶定的部分可與由靶捕獲寡核苷酸（如果使用的話）靶定的部分 完全不同（例如，不重疊）。或者，該靶序列的由第一擴(kuò)增寡核苷酸靶定的部分可與由靶捕 獲寡核苷酸靶定的部分完全或者部分重疊，或者甚至相同。在一些特殊情況中，該靶捕獲寡 核苷酸還可與該擴(kuò)增寡核苷酸在結(jié)構(gòu)上相同，并且除了靶捕獲之外還執(zhí)行擴(kuò)增功能。該靶 捕獲寡核苷酸可直接偶聯(lián)至固體載體（例如，通過(guò)共價(jià)鍵合）；或者，該組合物還可包括偶 聯(lián)至固體載體的捕獲探針，使得該捕獲探針雜交至該靶捕獲寡核苷酸的一部分。該固體載 體優(yōu)選地包括多個(gè)磁性或者可磁化的粒子或珠粒，所述粒子或珠?？墒褂么艌?chǎng)來(lái)操縱。
[0084] 如上所述，本發(fā)明組合物的擴(kuò)增寡核苷酸可包含靶特異性序列和由RNA聚合酶 (諸如，17 RNA聚合酶）識(shí)別的5'啟動(dòng)子序列。在一些實(shí)施例中，該組合物可包括至少兩 種擴(kuò)增寡核苷酸，其中一種可包含RNA聚合酶（例如，17 RNA聚合酶）的5'啟動(dòng)子序列。 包含啟動(dòng)子的擴(kuò)增寡核苷酸還可包括阻斷的3'端，該阻斷的3'端阻止該寡核苷酸的酶促 延伸。在那些其中所述組合物包括兩種或更多種擴(kuò)增寡核苷酸的情況中，所述寡核苷酸可 形成復(fù)合物，例如，DH復(fù)合物。該DH復(fù)合物可包括非啟動(dòng)子的擴(kuò)增寡核苷酸，該非啟動(dòng)子的 擴(kuò)增寡核苷酸包括在其5'端處接合至連接成員的靶特異性序列，該連接成員用于將該非啟 動(dòng)子的擴(kuò)增寡核苷酸連接至該DH復(fù)合物中的第二擴(kuò)增寡核苷酸。第二擴(kuò)增寡核苷酸通常 包含RNA聚合酶（諸如17 RNA聚合酶）的5'啟動(dòng)子序列。如在上文結(jié)合單引物擴(kuò)增更詳 細(xì)解釋的，該第二擴(kuò)增寡核苷酸有時(shí)可包括阻斷的3'端，該阻斷的3'端阻止該寡核苷酸的 酶促延伸。該非啟動(dòng)子的擴(kuò)增寡核苷酸的連接成員通常包括與第二擴(kuò)增寡核苷酸的一部分 互補(bǔ)的核苷酸序列。在其中第二擴(kuò)增寡核苷酸包括啟動(dòng)子序列的情況中，第一擴(kuò)增寡核苷 酸的連接成員優(yōu)選地包括與第二擴(kuò)增寡核苷酸的啟動(dòng)子序列的一部分互補(bǔ)的核苷酸序列。 在一些實(shí)施例中，所述擴(kuò)增寡核苷酸中的至少一者可包括位于靶特異性序列的5'處的標(biāo)簽 序列（例如，通用標(biāo)簽）。此外，本發(fā)明組合物可包括阻斷劑寡核苷酸以阻止該靶核酸序列 酶促延伸超出所需的終點(diǎn)。
[0085] 本發(fā)明組合物的擴(kuò)增酶可為以下形式：逆轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶，或者它們的組合。聚合 酶可選自RNA依賴性的DNA聚合酶、DNA依賴性的DNA聚合酶、DNA依賴性的RNA聚合酶，以 及它們的組合。該組合物優(yōu)選地還包括RNase，諸如RNase H或者具有RNase H活性的逆轉(zhuǎn) 錄酶。在一些情況下，該組合物還可包括檢測(cè)探針以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，該檢測(cè)探針可 選自分子信標(biāo)、分子火炬、雜交開(kāi)關(guān)探針，以及它們的組合。
[0086] 如上所述，本發(fā)明組合物的一個(gè)關(guān)鍵特征是該組合物缺乏靶核酸序列的指數(shù)級(jí)擴(kuò) 增所需的至少一種組分。缺乏的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增所需組分可為擴(kuò)增寡核苷酸（例如，啟動(dòng)子引 物或者非啟動(dòng)子引物）、聚合酶（例如，RNA聚合酶）、核酸酶、磷酸化酶、酶輔因子、螯合劑、 一種或多種核糖核苷三磷酸（rNTP)、Mg 2+、最佳pH、最佳溫度、鹽、最佳鹽濃度，或者它們的 組合。應(yīng)當(dāng)理解的是，該羅列并非為窮舉性的并且可包括進(jìn)行指數(shù)級(jí)擴(kuò)增反應(yīng)所必需的其 他組分。
[0087] 在希望達(dá)成多重?cái)U(kuò)增的情況下，本發(fā)明組合物可包括多個(gè)不同的靶捕獲寡核苷酸 和多個(gè)不同的擴(kuò)增寡核苷酸，所述寡核苷酸雜交至多個(gè)不同的靶核酸序列。
[0088] 如上所述，本發(fā)明還提供了一種用于擴(kuò)增樣品中的多個(gè)不同靶核酸序列的替代性 組合物。這種替代性組合物包括以下組分：(a)多個(gè)不同的擴(kuò)增寡核苷酸復(fù)合物，該復(fù)合物 雜交至多個(gè)不同的靶核酸序列，其中每種擴(kuò)增寡核苷酸復(fù)合物包括具有第一靶特異性序列 的第一擴(kuò)增寡核苷酸，該第一擴(kuò)增寡核苷酸直接或間接地接合到具有第二靶特異性序列的 第二擴(kuò)增寡核苷酸；以及（b)擴(kuò)增酶。再次地，所述組合物缺乏靶核酸序列的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增所 需的至少一種組分。
[0089] 第一擴(kuò)增寡核苷酸和第二擴(kuò)增寡核苷酸中的一者通常包含RNA聚合酶（諸如17 RNA聚合酶）的5'啟動(dòng)子序列。如在上文結(jié)合單引物擴(kuò)增更詳細(xì)解釋的，該包含啟動(dòng)子的 擴(kuò)增寡核苷酸可包括阻斷的3'端，該阻斷的3'端阻止該寡核苷酸的酶促延伸。在一些實(shí) 施例中，第一擴(kuò)增寡核苷酸和第二擴(kuò)增寡核苷酸中的至少一者還可包括位于靶特異性序列 的5'處的標(biāo)簽序列（例如，通用標(biāo)簽）。該組合物還可包括阻斷劑寡核苷酸以阻止該靶核 酸序列酶促延伸超出所需的終點(diǎn)。
[0090] 在一些實(shí)施例中，該組合物還可包括雜交至該靶核酸序列的多個(gè)不同的靶捕獲寡 核苷酸。該靶捕獲寡核苷酸可直接偶聯(lián)至固體載體（例如，通過(guò)共價(jià)鍵合）；或者，該組合 物還可包括偶聯(lián)至固體載體的捕獲探針，使得該捕獲探針雜交至該靶捕獲寡核苷酸的一部 分。該固體載體優(yōu)選地包括多個(gè)磁性或者可磁化的粒子或珠粒，所述粒子或珠?？墒褂么?場(chǎng)來(lái)操縱。
[0091] 如上所述，本文公開(kāi)的方法和組合物可用于體外擴(kuò)增靶核酸序列，從而產(chǎn)生可檢 測(cè)的擴(kuò)增序列來(lái)指示樣品中靶核酸的存在。所述方法和組合物可用于合成擴(kuò)增核酸，從而 提供可用的信息來(lái)進(jìn)行醫(yī)療病癥的診斷和/或預(yù)后、檢測(cè)環(huán)境和/或食物樣品的純度或質(zhì) 量，或者探索法醫(yī)證據(jù)。所述方法和組合物是有利的，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S合成各種核酸以提供相 對(duì)迅速且進(jìn)行成本低的、寬動(dòng)態(tài)范圍的高靈敏度測(cè)定，這使得它們適用于高通量和/或自 動(dòng)化體系。所述方法和組合物可用于分析單一靶序列即單重?cái)U(kuò)增體系的測(cè)定，并且特別可 用于同時(shí)分析多個(gè)不同的靶序列，即多重?cái)U(kuò)增體系的測(cè)定。優(yōu)選的組合物和反應(yīng)混合物被 提供于包括所定義的可用測(cè)定組分的試劑盒中，因?yàn)樗鲈噭┖性试S使用者在測(cè)定中有效 地執(zhí)行一起使用所述組分的方法，從而擴(kuò)增所需的靶。
[0092] 本文所述的組合物和方法的實(shí)施例可通過(guò)以下例子來(lái)進(jìn)一步了解。本文已經(jīng)描述 了在所述例子中使用的方法步驟，并且以下信息描述了在具有更多特殊性的方法中使用的 典型試劑和條件。核酸擴(kuò)增領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，也可使用將不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響過(guò) 程或結(jié)果的其他試劑和條件，只要遵循以上說(shuō)明中所提供的指導(dǎo)即可。例如，盡管轉(zhuǎn)錄介導(dǎo) 的擴(kuò)增（TMA)方法在以下例子中有所描述，但是受權(quán)利要求書(shū)保護(hù)的方法不限于基于TMA 的實(shí)施例。此外，分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員還將了解到，所公開(kāi)的方法和組合物可手動(dòng) 進(jìn)行或者以在自動(dòng)化裝置中執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)步驟（例如，移液、混合、溫育等）的系統(tǒng)進(jìn)行， 或者可用于任何類型的已知裝置（例如，試管、多管單元裝置、多孔裝置諸如96孔微孔板等 等）。
[0093] 實(shí)M
[0094] 在所述實(shí)例所描述的方法中使用的示例性試劑包括以下物質(zhì)。
[0095]"樣品運(yùn)送培養(yǎng)基"或者"STM"是磷酸鹽緩沖液（pH 6. 7)，該緩沖液包括EDTA、 EGTA，以及十二烷基硫酸鋰（LLS)。
[0096]"靶捕獲試劑"或者"TCR"是HEPES緩沖液（pH 6. 4)，該緩沖液包括氯化鋰和EDTA， 以及250 y g/mL的磁性粒子（1微米的SERA-MAG?MG-CM粒子，印第安納州印第安納波利斯 的Seradyn公司（Seradyn, Inc. Indianapolis, IN))，其中（dT)14寡核苷酸共價(jià)地結(jié)合至所 述磁性粒子。
[0097]"靶捕獲洗滌液"或者" TC洗滌液"是HEPES緩沖液（pH 7. 5)，該緩沖液包括氯化 鈉、EDTA、0.3% (v/v)的無(wú)水乙醇、0.02% (w/v)的對(duì)羥基苯甲酸甲醋、0.01% (w/v)的對(duì) 羥基苯甲酸丙酯，以及0.1% (w/v)的月桂基硫酸鈉。
[0098]"擴(kuò)增試劑"或者"AR"是HEPES緩沖液（pH 7. 7)，該緩沖液包括氯化鎂、氯化鉀、四 種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、四種核糖核苷三磷酸（rATP、rCTP、rGTP和 rUTP)?？蓪⒁锖?或探針在擴(kuò)增試劑中添加到反應(yīng)混合物，或者該引物和/或探針可與 試劑分開(kāi)添加（無(wú)引物的擴(kuò)增試劑）。
[0099] 如在擴(kuò)增或者預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)混合物中所使用的"酶試劑"或者"ER"是HEPES緩沖液 (pH 7. 0)，該緩沖液包括MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（RT)、I7 RNA聚合酶、鹽和輔因子。
[0100]實(shí)例 1
[0101] 標(biāo)準(zhǔn)單階段擴(kuò)增方案
[0102] 用于實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)單階段TMA反應(yīng)的示例性方案如下所述。該測(cè)定包括在 擴(kuò)增前純化靶核酸、擴(kuò)增，以及在擴(kuò)增期間檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0103] 靶捕獲是基本上如此前所詳細(xì)描述地進(jìn)行的（美國(guó)專利No. 6, 110, 678、 6, 280, 952和6, 534, 273)。簡(jiǎn)而言之，樣品被制備為包含已知量的靶RNA(體外轉(zhuǎn)錄物 ("IVT"），該轉(zhuǎn)錄物在總體積為400mL的水和樣品運(yùn)送培養(yǎng)基的l:l( v:v)混合物中以每 單位樣品預(yù)定的拷貝水平存在）。將每一樣品與l〇〇mL的TCR混合，該TCR通常包含5pmol 的、特異于待捕獲的分析物核酸（即，3'靶特異性結(jié)合區(qū)域）和5'尾部區(qū)域（例如，dT3A 3Q 序列）的靶捕獲寡核苷酸（TCO)，該靶捕獲寡核苷酸用于結(jié)合至經(jīng)固定的探針（例如，連 接到順磁性粒子的聚胸腺嘧啶寡核苷酸；每一反應(yīng)中有12. 5 y g的、連接有寡核苷酸的粒 子）。將所述混合物在60±1°C下溫育25至30分鐘，然后在室溫下（20至25°C )放置25 至30分鐘以形成雜交復(fù)合物，靶核酸通過(guò)該雜交復(fù)合物結(jié)合至通過(guò)磁性分離裝置（例如， KingFisher96? 磁性粒子處理器（KingFisher96? magnetic particle processor)，馬薩諸 塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.，Waltham，MA))而 分離的順磁性粒子，并且使用TC洗滌液洗滌一次。
[0104] 將粒子在0. 〇75mL的擴(kuò)增試劑中重懸，并且該粒子帶有在擴(kuò)增中所使用的擴(kuò)增寡 核苷酸。檢測(cè)探針（例如，用熒光標(biāo)記物化合物標(biāo)記的分子信標(biāo)或者分子火炬探針）可與 擴(kuò)增寡核苷酸一起添加，或者與酶一起添加，或者在此之后添加酶。反應(yīng)混合物經(jīng)遮蓋以防 止蒸發(fā)，并且在42±0. 5°C下溫育1至2分鐘。在使所述混合物保持在42±0. 5°C的同時(shí)， 對(duì)其去除遮蓋并與每單位混合物0. 〇25mL的酶試劑混合，再次遮蓋并且在42±0. 5°C下溫 育30至40分鐘，在該溫育期間以固定的時(shí)間間隔測(cè)量熒光（例如，每分鐘測(cè)量一次或者每 分鐘讀取若干次），所述時(shí)間間隔被稱為用于數(shù)據(jù)采集和顯示的"循環(huán)"，所述數(shù)據(jù)采集和顯 示通常為檢測(cè)到的熒光單位對(duì)時(shí)間的曲線圖，從該曲線圖可以確定信號(hào)出現(xiàn)的時(shí)間（"T時(shí) 間"，即樣品的熒光信號(hào)變得高于預(yù)定的背景水平的時(shí)間）。
[0105]實(shí)例 2
[0106] iH向TMA形式的雙階段HIV-1擴(kuò)增的評(píng)估
[0107] 在該實(shí)例中，雙階段正向TMA使用人類免疫缺陷病毒1 (HIV-1)、包含pol區(qū)的亞型 B靶模板進(jìn)行評(píng)估。
[0108] 在此處所使用的雙階段擴(kuò)增方法（該方法在圖1中簡(jiǎn)要概述）中，17引物在靶捕 獲期間雜交至靶HIV-1序列，然后移除過(guò)量的17引物。該擴(kuò)增過(guò)程被分成兩個(gè)不同的階 段。在第一階段期間，將非T7引物與所有必需的擴(kuò)增試劑、檢測(cè)試劑和酶試劑一起引入，額 外的17引物除外。在存在逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下，延伸雜交至該靶的17引物，構(gòu)建cDNA拷貝， 并且通過(guò)該逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性使靶RNA模板降解。非17引物隨后雜交至該cDNA然 后被延伸，從而填充該17引物的啟動(dòng)子區(qū)并且構(gòu)建有活性的雙鏈模板。17聚合酶隨后從 該模板產(chǎn)生多個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄物。非17引物隨后雜交至所述RNA轉(zhuǎn)錄物并且被延伸，從而產(chǎn)生 靶RNA模板的無(wú)啟動(dòng)子cDNA拷貝。該RNA鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase活性降解的。因?yàn)?在第1階段的擴(kuò)增混合物中沒(méi)有T7引物可用，所以該反應(yīng)無(wú)法進(jìn)一步進(jìn)行。然后用T7引 物的添加起始第二階段，從而引發(fā)在第1階段中產(chǎn)生的cDNA庫(kù)的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。
[0109] 從該雙階段方法的初始評(píng)估獲得的結(jié)果示出于圖3A-圖3C中。圖3A示出經(jīng)改進(jìn) 以模擬該雙階段形式的單階段擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。更具體地講，在靶捕獲步驟期間添加該17 引物（使得從該方案中消除標(biāo)準(zhǔn)的60°C退火步驟）；在第一階段中未添加引物或酶試劑； 并且將非17引物和17引物以及酶試劑添加至第二階段以引發(fā)指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。為了解決用于 標(biāo)準(zhǔn)單階段對(duì)照的此改進(jìn)方案可能已在一定程度上危害了該標(biāo)準(zhǔn)單階段對(duì)照的性能的問(wèn) 題，我們將改進(jìn)的單階段正向方案與標(biāo)準(zhǔn)單階段正向TMA(圖2A-圖2B)作比較。如從圖2A 和圖2B可見(jiàn)，這兩種方案得到高度相似水平的檢測(cè)精度和靈敏度。相反地，與標(biāo)準(zhǔn)單階段 形式相比，在這些條件下雙階段方案在分析物濃度低端（約20拷貝/反應(yīng)）處獲得顯著改 善的靈敏度和精度（圖3B)。要注意的是，該雙階段形式獲得了在精度和較短檢測(cè)時(shí)間方面 的優(yōu)越性能（圖3C)。
[0110]實(shí)例 3
[0111] 雙階段HIV-1擴(kuò)增參數(shù)的優(yōu)化
[0112] 在優(yōu)化過(guò)程中需優(yōu)先考慮的是減緩出現(xiàn)時(shí)間并且分離各個(gè)靶輸入水平，從而允許 準(zhǔn)確和精確的定量，以及減少對(duì)非17引物的任何推定性干擾。該優(yōu)先考慮是通過(guò)在第二 階段中通過(guò)滴定降低17引物濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)的（在圖3B中所示出的雙階段反應(yīng)中的用量為 10pmol/rxn)。該測(cè)定顯示為在最低量的所測(cè)試的17提供者（1. Opmol/rxn ;圖4A-圖4D) 時(shí)保持10拷貝/反應(yīng)的靈敏度和高精度。
[0113] 同樣，非17引物也通過(guò)滴定降低（在圖3B中所示出的雙階段反應(yīng)中的用量為 15pmol/rxn)，同時(shí)保持17引物恒定于lpmol/rxn。已發(fā)現(xiàn)10pmol/rxn的水平足以在不損 失精度的情況下進(jìn)行靈敏的擴(kuò)增（圖5A)。在2pmol/rxn的非T7引物水平時(shí)，10拷貝/反 應(yīng)時(shí)的精度不如l〇pmol/rxn的非T7引物水平時(shí)那樣好（圖3B)，但是測(cè)定的性能仍然優(yōu)于 單階段對(duì)照的性能（圖3A)。
[0114] 因此，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)該雙階段擴(kuò)增形式允許實(shí)質(zhì)上降低引物濃度并仍 然獲得比單階段形式優(yōu)越的性能，同時(shí)減少副產(chǎn)物形成和多重干擾。
[0115] 還檢驗(yàn)了在第二階段中對(duì)額外大劑量的酶的需要（圖6A-圖6C)。對(duì)第一階段的 酶添加的限制得到在所測(cè)試的分析物濃度低端處精度的適度改善（圖6B和圖6C)。此外， 相對(duì)于其中在兩個(gè)階段中皆存在酶試劑的雙階段形式，每一拷貝水平遲大約五分鐘出現(xiàn)。 然而，此前觀察到的靈敏度改善得到保持。
[0116]實(shí)例 4
[0117] HPV16的雙階段擴(kuò)增
[0118] 為了確定該雙階段擴(kuò)增形式是否具有超出HIV-1檢測(cè)的廣泛適用性，用人乳頭瘤 病毒亞型16 (HPV16)測(cè)試該雙階段擴(kuò)增形式。
[0119] 該雙階段擴(kuò)增方案與上文在實(shí)例2中所描述的方案基本上相同。簡(jiǎn)而言之，T7引 物在靶捕獲期間雜交至靶HPV16序列，然后移除過(guò)量的17引物。在擴(kuò)增的第一階段期間， 將非17引物與所有必需的擴(kuò)增試劑、檢測(cè)試劑和酶試劑一起添加，額外的17引物除外。在 42°C下靜置