'啟動子序列。在優(yōu)選的情形中，該RNA聚合酶是17 RNA聚 合酶。在另一通常優(yōu)選的方法中，該第二擴增寡核苷酸是在該第一階段的、等溫的、轉(zhuǎn)錄相 關的擴增反應中酶促延伸的。在另一通常優(yōu)選的方法中，該固體載體包含經(jīng)固定的捕獲探 針。在另一通常優(yōu)選的方法中，步驟（a)還包括使該樣品與雜交至該靶核酸序列的靶捕獲 寡核苷酸接觸；并且該預擴增雜交體包含雜交至靶捕獲寡核苷酸和第一擴增寡核苷酸中的 每一者的靶核酸序列。在另一通常優(yōu)選的方法中，該固體載體包括磁性吸引的粒子。在另 一通常優(yōu)選的方法中，第一階段的、等溫的、轉(zhuǎn)錄相關的擴增反應和第二階段的、等溫的、轉(zhuǎn) 錄相關的擴增反應中的每一者包含RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，并且該逆轉(zhuǎn)錄酶包含內(nèi)源性的 RNaseH活性。在另一通常優(yōu)選的方法中，所述至少一種組分包括第一擴增寡核苷酸。在另 一通常優(yōu)選的方法中，步驟（c)的第一擴增產(chǎn)物是與該樣品中的靶核酸序列具有相同極性 的cDNA分子，并且步驟（e)的第二擴增產(chǎn)物是RNA分子。在另一通常優(yōu)選的方法中，步驟 (d)中的序列特異性雜交探針是構(gòu)象敏感的探針，該探針在雜交至第二擴增產(chǎn)物時產(chǎn)生可 檢測的信號。在另一通常優(yōu)選的方法中，步驟（d)中的序列特異性雜交探針是熒光標記的 序列特異性雜交探針。在另一通常優(yōu)選的方法中，步驟（g)包括使用線性校正曲線和從步 驟（f)獲得的結(jié)果來定量樣品中的靶核酸序列。在另一通常優(yōu)選的方法中，步驟（c)包括 在第一階段擴增反應混合物中擴增10倍至10, 〇〇〇倍。
【附圖說明】
[0020] 圖1示出雙階段正向轉(zhuǎn)錄介導的擴增（TMA)的實施例。在該實施例中，包含17啟 動子（"17引物"）的擴增引物在靶捕獲期間雜交至靶核酸序列，然后移除過量的17引物。 該擴增過程被分成至少兩個不同的階段。在第一階段期間，將非17引物與所有必需的擴增 試劑和酶試劑（分別為AR和ER) -起引入，額外的17引物除外（RT :逆轉(zhuǎn)錄酶；T7 :I7RNA 聚合酶）。在存在逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下，延伸雜交至該靶的17引物，構(gòu)建cDNA拷貝，并且通 過RT的RNase H活性使靶RNA模板降解。非17引物隨后雜交至該cDNA然后被延伸，從而 填充該17引物的啟動子區(qū)并且構(gòu)建有活性的雙鏈模板。17聚合酶隨后從該模板產(chǎn)生多個 RNA轉(zhuǎn)錄物。非17引物隨后雜交至所述RNA轉(zhuǎn)錄物并且被延伸，從而產(chǎn)生靶RNA模板的無 啟動子cDNA拷貝。RNA鏈隨后通過RT的RNase活性而降解。因為在第1階段的擴增混合 物中沒有T7引物可用，所以該反應無法進一步進行。然后用T7引物的添加起始第二階段， 從而引發(fā)在第1階段中產(chǎn)生的cDNA庫的指數(shù)級擴增。
[0021] 圖2A-圖2B示出在標準單階段正向TMA (圖2A)和在本文所述的一些操作實例中 用作對照的改進的單階段正向TMA(圖2B)之間的比較。標準單階段正向TMA方案是本領 域熟知的并且在本申請的其他地方詳細地描述。在改進的單階段TMA方案中，T7引物在靶 捕獲期間雜交至靶核酸序列，從而消除在靶捕獲之后常用的60°C下17引物退火步驟。隨 后，將非17引物與額外的17引物以及所有必需的擴增試劑和酶試劑一起添加，從而允許指 數(shù)級擴增進行。如從圖2A和圖2B可見，這兩種單階段TMA方案看起來在低端具有類似的 靈敏度，可靠地檢測人免疫缺陷病毒l(HIV-l)靶模板的100個或更多個拷貝，但是在靶模 板的10個拷貝時表現(xiàn)不佳。
[0022] 圖3A-圖3C示出改進的單階段正向TMA和雙階段正向TMA之間的比較。在圖3A 中，如上文所述的改進的單階段TMA被用于擴增HIV-1靶模板。在圖3B中，該相同的HIV-1 模板使用在圖1中描述的雙階段TMA技術(shù)擴增，即，該17引物起初從該擴增混合物中被扣 留并且在該第二階段中被提供以起始指數(shù)級擴增。圖3C描繪校正曲線線性擬合，示出單階 段擴增反應和雙階段擴增反應之間敏感性的顯著偏移。
[0023] 圖4A-圖4D示出在擴增的第二階段中添加的17引物的濃度優(yōu)化。在圖4A中，該 改進的單階段正向TMA被用于擴增HIV-1靶模板。在圖4B-圖4D中，該17引物從第1階段 的擴增混合物中被扣留，并且在該第二階段中提供不同濃度的17引物以引發(fā)指數(shù)級擴增。 在lpmol/rxn、5pmol/rxn和10pmol/rxn的17引物處觀察到了單階段擴增反應和雙階段擴 增反應之間敏感性和穩(wěn)健性的相當顯著的偏移。
[0024] 圖5A-圖?示出在擴增的第一階段中添加的非17引物的濃度優(yōu)化。在圖5A中， 該改進的單階段正向TMA被用于擴增HIV-1靶模板。在圖5B-圖?中，17引物從第1階 段的擴增混合物中被扣留，并且在該第二階段中被提供以引發(fā)指數(shù)級擴增。在1Opmo1/rxn 和15pm〇l/rXn的非17引物處觀察到了單階段擴增反應和雙階段擴增反應之間敏感性和穩(wěn) 健性的相當顯著的偏移。在存在2pm〇l/rxn的非17引物的情況下，該偏移一定程度上較不 顯著。
[0025] 圖6A-圖6C示出第二階段擴增中酶試劑（RT和T7 RNA聚合酶）對總體測定性能 的影響。在圖6A中，該改進的單階段正向TMA被用于擴增HIV-1靶模板。如前所述，在圖 6B-圖6C中，該17引物從第1階段的擴增混合物中被扣留，并且在該第二階段中被提供以 引發(fā)指數(shù)級擴增。在圖6B中，在擴增反應的第一階段和第二階段中添加等量的酶試劑。在 圖6C中，在第一階段擴增中添加相同總量的酶試劑，而在第二階段中不添加酶試劑。在兩 個實驗中都觀察到了單階段擴增反應和雙階段擴增反應之間敏感性和穩(wěn)健性的相當顯著 的偏移。
[0026] 圖7A-圖7C示出使用人乳頭瘤病毒亞型16(HPV16)靶模板進行的標準單階段正 向TMA (圖7A)和雙階段正向TMA (圖7B)之間的比較。如上文參照HIV-1靶模板所討論的， 在雙階段形式中，該17引物從第1階段的擴增混合物中被扣留并且在第二階段中被提供以 引發(fā)指數(shù)級擴增。圖7C描繪校正曲線線性擬合，示出單階段擴增反應和雙階段擴增反應之 間敏感性的顯著偏移。
[0027] 圖8A-圖8C示出使用前列腺癌抗原3(PCA3)靶模板進行的標準單階段正向 TMA(圖8A)與雙階段正向TMA(圖8B)之間的比較。如上文參照HIV-1靶模板和HPV16靶 模板所討論的，在雙階段形式中，該17引物從第1階段的擴增混合物中被扣留并且在第二 階段中被提供以引發(fā)指數(shù)級擴增。圖8C描繪校正曲線線性擬合，類似地示出單階段擴增反 應和雙階段擴增反應之間敏感性的顯著偏移。
[0028] 圖9A-圖9F示出用于PCA3和T2-ERG的雙重擴增的標準單階段正向TMA(圖9A 和圖9D)和雙階段正向TMA(圖9B和圖9E)之間的比較，T2-ERG是一種通過雄性激素調(diào)節(jié) 的跨膜絲氨酸蛋白酶（TMPRSS2)與ETS轉(zhuǎn)錄因子（ERG)的基因融合形成的前列腺癌標記 物。圖9A和圖9B示出在存在T2-ERG的情況下對PCA3的檢測，而圖9D和圖9E示出在存 在PCA3的情況下對T2-ERG的檢測。圖9C和圖9F描繪校正曲線線性擬合，示出針對雙重 擴增情形中的兩種靶，單階段擴增反應和雙階段擴增反應之間敏感性的顯著偏移。
[0029] 圖10A-圖101示出用于PCA3、T2-ERG和前列腺特異性抗原（PSA)的三重擴增的 標準單階段正向TMA (圖10A、圖10D和圖10G)和雙階段正向TMA (圖10B、圖10E和圖10H) 之間的比較。圖10A和圖10B示出在存在T2-ERG和PSA的情況下對PCA3的檢測；圖10D 和圖10E示出在存在PCA3和PSA的情況下對T2-ERG的檢測；以及圖10G和圖10H示出在 存在PCA3和T2-ERG的情況下對PSA的檢測。圖10C、圖10F和圖101描繪校正曲線線性擬 合，示出針對三重擴增情形中的所有三個靶，單階段擴增反應和雙階段擴增反應之間敏感 性的顯著偏差。
[0030] 圖11A-圖11C示出改進的單階段反向TMA和雙階段反向TMA之間的比較。在圖 11A中，改進的單階段反向TMA被用于擴增T2-ERG靶模板。在改進的單階段反向TMA中， 非17引物在靶捕獲期間雜交至靶核酸序列，從而消除在靶捕獲之后常用的60°C下非17引 物退火步驟。隨后，將17引物與額外的非17引物以及所有必需的擴增試劑、檢測試劑和酶 試劑一起添加，從而允許指數(shù)級擴增進行。在圖11B中，使用雙階段反向TMA方案擴增相同 的T2-ERG模板，其中該非17引物從第1階段的擴增混合物中被扣留并且在該第二階段中 被提供以引發(fā)指數(shù)級擴增。圖11C描繪校正曲線線性擬合，示出單階段擴增反應和雙階段 擴增反應之間敏感性的顯著偏移。
[0031] 圖12A-圖12C示出用于T2-ERG、PCA3、PSA和內(nèi)部對照（CAP)的四重擴增的改進 的單階段反向TMA(圖12A)、圖11中描述的雙階段形式反向TMA(圖12B)和不同的雙階段 形式反向TMA(圖12C)之間的比較。圖12A、圖12B和圖12C示出在存在PCA3、PSA和CAP 的情況下對T2-ERG的檢測。在圖12B中，所有的四個靶經(jīng)受如上文結(jié)合圖11B所描述的相 同的雙階段反向TMA。在圖12C中，在反應的第一階段中PCA3、PSA和CAP(或者僅CAP)經(jīng) 受線性擴增，而T2-ERG經(jīng)受指數(shù)級擴增，并且在第二階段中PCA3、PSA和CAP經(jīng)受指數(shù)級擴 增，而T2-ERG繼續(xù)指數(shù)級地擴增（所有的這些擴增反應在相同的容器中進行）。
[0032] 圖13A-圖13C示出用于T2-ERG、PCA3、PSA和內(nèi)部對照（CAP)的四重擴增的改進 的單階段反向TMA(圖13A)、雙階段反向TMA(圖13B)和三階段反向TMA(圖13C)之間的比 較。圖13A、圖13B和圖13C示出在存在PCA3、PSA和CAP的情況下對T2-ERG的檢測。在圖 13B中，所有的四個靶經(jīng)受如上文結(jié)合圖11B所描述的相同的雙階段反向TMA。在圖13C中， 在第1階段中T2-ERG經(jīng)受線性擴增而其他3種分析物不擴增，在第2階段中T2-ERG經(jīng)受 指數(shù)級擴增而其他3種分析物不擴增，以及在第3階段中PCA3、PSA和CAP (或者僅CAP)經(jīng) 受指數(shù)級擴增而T2-ERG繼續(xù)指數(shù)級地擴增（所有的這些擴增反應在相同的容器中進行）。
【具體實施方式】
[0033] 為了本發(fā)明的清楚性并且不以限制性方式，本發(fā)明的【具體實施方式】被劃分為以下 的子部分。
[0034]A.宙義
[0035] 除非另有說明，否則本文所使用的科學和技術(shù)術(shù)語具有與分子生物學領域內(nèi)的那 些技術(shù)人員基于技術(shù)文獻或者與分子生物學相關的其他熟知的技術(shù)出版物通常所理解的 相同含義，所述技術(shù)文獻例如，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed. (Singleton et al.，1994, John Wiley&Sons, New York, NY) (Singleton 等人，《微生物 學和分子生物學詞典》，第2版，1994年，紐約州紐約市約翰威立父子出版公司）。除非另有 說明，否則本文中使用或考慮的技術(shù)是分子生物學領域中熟知的標準方法。為了幫助理解 所公開方法和組合物的各方面，通過本文所述的實施例更詳細地描述或解釋一些術(shù)語。
[0036] 本文提及的所有專利、專利申請、已公布專利申請和其他出版物全文以引用方式 并入。如果此部分示出的定義與以引用方式并入本文的專利、專利申請、已公布專利申請和 其他出版物示出的定義相反或者不一致，則此部分示出的定義優(yōu)于以引用方式并入本文的 定義。
[0037] 如本文所用，"一個"或"一種"意指"至少一個/至少一種"或"一個或多個/ 一種 或多種"。
[0038] 如本文在整個說明書和權(quán)利要求書中所使用的近似表述可應用于修飾任何定量 或定性表示，這些定量或定性表示可獲許可地變化而不會導致與其相關的基本功能的變 化。因此，由術(shù)語諸如"約"或"大約"修飾的值并不限于所指定的精確值，而是可包括與該 指定值不同的值。
[0039] 如本文所用，術(shù)語"樣品"是指可包含所關注的分析物的標本，例如，微生物、病毒、 核酸諸如基因，或者它們的組分，所述組分包含分析物中或者從分析物取得的核酸序列。樣 品可來自任何來源，諸如生物標本或者環(huán)境來源。生物標本包括從活生物體或死亡生物體 取得的任何組織或材料，該組織或材料可包含分析物或者分析物中或從分析物取得的核 酸。生物樣品的例子包括呼吸組織、滲出物（例如，支氣管肺泡灌洗液）、活組織標本、痰、 外周血、血漿、血清、淋巴結(jié)、胃腸組織、糞便、尿液或者其他流體、組織或材料。環(huán)境樣品的 例子包括水、冰、土壤、混懸液、殘渣、生物膜、大氣塵粒子以及氣溶膠。樣品可為經(jīng)處理的標 本或材料，諸如通過使用過濾、離心、沉淀或者吸附至介質(zhì)（諸如，基體或載體）處理樣品而 獲得。樣品的其他處理可包括物理或機械地破碎組織、細胞凝聚體或細胞的處理，從而將包 括核酸在內(nèi)的細胞內(nèi)組分釋放到可包含其他組分的溶液中，所述其他組分諸如酶、緩沖液、 鹽、洗滌劑等等。
[0040] 如本文所用，術(shù)語"接觸"意味使兩種或更多種組分合并在一起?？梢酝ㄟ^在流體 或半流體混合物中混合所有的組分來實現(xiàn)接觸。當一種或多種組分在固體表面上與一種或 多種其他組分發(fā)生物理接觸時也可實現(xiàn)接觸，該固體表面諸如固體組織切片或者底物。 [0041] 如本文所用，術(shù)語"核酸"是指包括寡核苷酸的多核苷酸化合物，所述寡核苷酸包 含核苷或者核苷類似物，所述核苷或者核苷類似物具有通過標準的磷酸二酯鍵或者其他鍵 而共價連接的含氮雜環(huán)堿基或堿基類似物。核酸包括RNA、DNA、嵌合的DNA-RNA聚合物或 其類似物。在核酸中，主鏈可由多種鍵組成，包括糖磷酸二酯鍵、肽核酸（PNA)鍵（PCT公布 No. WO 95/32305)、硫代磷酸酯鍵、甲基磷酸酯鍵或其組合中的一者或多者。核酸中的糖基 部分可為核糖、脫氧核糖或者具有取代基的類似化合物，所述取代基例如，2'甲氧基和2'鹵 離子（例如，2'-F)取代基。含氮堿基可為常規(guī)的堿基（A、G、C、T、U)、其類似物（例如，肌苷； The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al. , ed. , 11th ed.,1992(《核 酸的生物化學》，第5-36頁，Adams等人編輯，第11版，1992年））、嘌呤或嘧啶堿基的衍生物 (例如，N4-甲基脫氧鳥苷、脫氮或者氮雜嘌呤、脫氮或者氮雜嘧啶、在多個化學位置的任一 者處具有改變的或者置換的取代基的嘧啶或嘌呤（例如，2-氨基-6-甲胺基嘌呤、06-甲基 鳥嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶，以及04-烷基-嘧啶），或者吡 唑化合物，諸如未取代的或者3-取代的吡唑[3, 4-d]嘧啶（例如，美國專利No. 5, 378, 825、 6, 949, 367和PCT公布No. W0 93/13121))。核酸可包括"脫堿基"位置，其中主鏈在一個或 多個位置處不具有含氮堿基（美國專利No. 5, 585, 481)，例如，一個或多個脫堿基位置可形 成接頭區(qū)，該接頭區(qū)將單獨的寡核苷酸序列接合到一起。核酸可僅包含如存在于常規(guī)RNA 和DNA中的常規(guī)糖基、堿基和鍵，或可包括常規(guī)組分和取代物（例如由2'甲氧基主鏈連接 的常規(guī)堿基，或包含常規(guī)堿基與一種或多種堿基類似物的混合物的聚合物）。所述術(shù)語包括 "鎖核酸"（LNA)，該"鎖核酸"包含一種或多種LNA核苷酸單體，該單體具有鎖定為RNA模擬 糖構(gòu)象的雙環(huán)呋喃糖單元，該構(gòu)象增強了 ssRNA、ssDNA或者dsDNA中互補序列的雜交親和 力（Vester et al.，2004, Biochemistry 43 (42): 13233-41 (Vester 等人，2004 年，《生物化 學》，第43卷，第42期，第13233-13241頁））。
[0042] 如本文所用，可互換的術(shù)語"寡核苷酸"和"低聚物"是指一般由少于1，000個核苷 酸（nt)構(gòu)成的核酸聚合物，包括尺寸范圍具有約2至5nt的下限和約500至900nt的上限 的那些聚合物。優(yōu)選的寡核苷酸的尺寸范圍具有5至15nt的下限和50至500nt的上限， 并且特別優(yōu)選的實施例的尺寸范圍具有10至20nt的下限和25至150nt的上限。優(yōu)選的 寡核苷酸是通過使用任何熟知的體外化學或酶促方法合成制備的，并且可在合成之后通過 使用標準方法而純化，所述標準方法例如高效液相色譜（HPLC)。本文討論的代表性的寡核 苷酸舉例來說包括啟動寡核苷酸引物（例如，引物、非17引物、17啟動子-引物等）、啟動 子提供者（是包含阻斷的3'端的啟動子引物）、檢測探針寡核苷酸、靶捕獲寡核苷酸，以及 阻斷劑。啟動寡核苷酸引物和啟動子提供者一般被稱為"擴增寡核苷酸"。
[0043] "啟動寡核苷酸引物"（或者更簡潔地"引物"）是寡核苷酸，該寡核苷酸的至少3' 端與核酸模板互補，并且該寡核苷酸與模板復合（通過氫鍵或雜交）以得到引物：模板復合 物，該復合物適合于通過RNA或DNA依賴性的DNA聚合酶引發(fā)合成。啟動寡核苷酸引物是 通過將共價鍵合的核苷酸堿基添加到該引物的3'端而延伸的，該堿基與所述模板互補。所 獲得的是引物延伸產(chǎn)物。本發(fā)明的啟動寡核苷酸引物通常