多階段核酸擴增的制作方法
【專利說明】多階段核酸擴増
[0001] 相關專利申請
[0002] 本申請要求于2012年8月30日提交的美國臨時申請No. 61/695, 106;和于2013 年7月15日提交的美國臨時申請No. 61/846,538的權益。這些較早申請的全部公開內容 據(jù)此以引用方式并入。
技術領域
[0003] 本發(fā)明整體涉及分子生物學領域。更具體地講，本發(fā)明涉及核酸的多階段體外擴 增，所述擴增可用于增加單重反應和多重反應兩者中擴增的效率和精度，以允許更靈敏地 檢測核酸靶，該檢測具有改進的定量特性并且在多重反應中分析物之間的干擾更少。
【背景技術】
[0004] 核酸擴增提供產生相對稀少或未知的核酸序列的多個拷貝的方式，以用于鑒定核 酸來源或者用于制備足夠的核酸來提供易于檢測的量。擴增可用于多種應用，例如測序、 診斷、藥物開發(fā)、法醫(yī)學鑒定、環(huán)境分析和食品檢測。已知有多種用于體外擴增核酸序列的 方法，包括聚合酶鏈反應（PCR)、連接酶鏈式反應（LCR)、復制酶介導的擴增、鏈置換擴增 (SDA)、"滾環(huán)"型擴增，以及各種轉錄相關的擴增方法。這些已知方法使用不同技術來制備 擴增序列，所述擴增序列通常是使用各種方法來檢測的。
[0005] PCR擴增使用DNA聚合酶、寡核苷酸引物以及熱循環(huán)來合成雙鏈DNA(dsDNA)或 者從cDNA制備的dsDNA的兩條鏈的多個拷貝（美國專利No. 4, 683, 195、4, 683, 202和 4, 800, 159)。LCR擴增使用過量的單鏈探針的兩個互補對，所述單鏈探針雜交至鄰接靶序 列并且進行連接以形成與原始靶互補的融合探針，這允許所述融合探針在雜交、連接和變 性的多個循環(huán)中用作進一步融合的模板（美國專利No.5,516,663和EP 0320308 B1)。 復制酶介導的擴增使用連接到分析物序列的自復制RNA序列和復制酶（諸如Q0-復制 酶）來合成特異于所選復制酶的自復制序列（諸如，Q0病毒序列）的拷貝（美國專利 No. 4, 786, 600)。所述擴增序列作為分析物序列的替代物或報告分子而被檢測出。SDA使 用含有限制性核酸內切酶的識別位點的引物，這使得所述核酸內切酶在包括靶序列的半 甲基化（hemi-modified)dsDNA的一條鏈上打開缺口，然后進行一系列引物延伸和鏈置換 步驟（美國專利No. 5, 422, 252和5, 547, 861)。滾環(huán)型擴增依賴于用作模板的環(huán)狀或連 體（concatenated)核酸結構，以用于從所述模板酶法復制多個單鏈拷貝（例如，美國專 利No. 5, 714, 320和5, 834, 252)。轉錄-相關的擴增是指通過從核酸模板產生多個轉錄物 來擴增序列的方法。此類方法一般使用一種或多種寡核苷酸（其中一種寡核苷酸提供啟 動子序列）和具有RNA聚合酶和DNA聚合酶活性的酶以在靶序列附近形成功能性啟動子 序列，然后從啟動子轉錄靶序列（例如，美國專利No. 4, 868, 105、5, 124, 246、5, 130, 238、 5, 399, 491、5, 437, 990、5, 554, 516 和 7, 374, 885 ;以及 PCT 公布 No. W01988/010315)。
[0006] 核酸擴增方法可擴增特定的靶序列（例如，基因序列），一組相關靶序列，或可稱 為標簽序列的替代（surrogate)序列。此標簽序列可用于多種目的，諸如檢測、進一步擴 增、作為結合標簽以用于固定化、作為銜接子以用于測序反應（包括下一代測序）中的多種 功能等。僅當所述分析物靶序列存在于反應中的某一點時該標簽序列針對其預期目的發(fā)揮 作用。改進的核酸擴增方法可使用"通用"引物（一種或多種）或通用引物啟動（priming) 來擴增不止一個潛在的靶序列。一種形式的PCR擴增使用結合至保守序列的通用引物來 在 PCR 反應中擴增相關的序列（Okamoto et al.，1992, J. Gen. Virol. 73:673-679 (Okamoto 等人，1992 年，《普通病毒學》，第 73 卷，第 673-679 H)，Persingetal.，1992，J.Clin. Microbiol. 30:2097-2103 (Persing 等人，1992 年，《臨床微生物學》，第 30 卷，第 2097-2103 頁）。使用通用引物的方法通常與種特異性、基因特異性或類型特異性的一種或多種引 物的使用配對，從而產生對于種、遺傳性變型或者病毒類型唯一的擴增序列，所述擴增 序列可以通過測序或者檢測擴增核酸的一些其他特性來鑒定。錨定PCR是另一種改進 的PCR方法，該方法使用通用引物或"銜接子"引物來擴增僅部分已知的序列。錨定PCR 將"銜接子"或"通用"序列引入cDNA中并且隨后在后續(xù)的擴增步驟中使用結合至所引 入序列的引物。一般來講，錨定PCR使用指向已知序列的引物來制備cDNA，將已知序列 (例如，聚鳥嘌呤）添加到cDNA中或者使用cDNA中的共有序列（例如，聚胸腺嘧啶）， 并且使用結合至該cDNA中的添加序列或共有序列的通用引物和下游靶特異性引物來進 行 PCR(Loh et al.，1989，Science 243:217-220(Loh 等人，1989 年，《科學》，第 243 卷， 第 217-220 頁）；Lin et al.，1990, Mol. Cell. Biol. 10:1818-1821 (Lin 等人，1990 年，《分 子和細胞生物學》，第10卷，第1818-1821頁）。巢式PCR可使用包含與分析物靶序列無 關的通用序列的引物（一種或多種）來在反應中由未知的靶序列擴增核酸（Sullivan et al.，1991，Electrophoresis 12:17-21 (Sullivan 等人，1991 年，《電泳》，第 12 卷，第 17-21 頁）；Sugimoto et al.，1991，Agric. Biol. Chem. 55:2687-2692 (Sugimoto 等人，1991 年， 《農業(yè)與生物化學》，第55卷，第2687-2692頁））。
[0007] Chamberlain et al. (Nucleic Acid Res.,1988,16:11141-11156)(Chamberlain 等人，《核酸研宄》，1988年，第16卷，第11141-11156頁）首次展示了人類肌營養(yǎng)不良基 因的多重PCR分析。多重反應是通過對特異性引物的仔細篩選和優(yōu)化完成的。開發(fā)穩(wěn)健 的、靈敏的和特異性的多重反應需要大量特異性設計依據(jù)和經驗性優(yōu)化。這導致較長的開 發(fā)時間并且向降低測定靈敏度的反應條件妥協(xié)。繼而，新型診斷測試的開發(fā)變得代價非常 高。已確定有多個限制多重反應的具體問題。摻入針對不止一個靶的引物組需要仔細匹 配反應效率。如果一個引物以甚至稍好一點的效率擴增其靶，那么擴增將變得偏向該更有 效擴增的靶，從而導致低效率的擴增、變化的靈敏度并且可能造成多重反應中其他靶基因 的完全失敗。這被稱為"優(yōu)先擴增"。優(yōu)先擴增有時可以通過將所有的引物序列按類似長 度和GC含量仔細匹配并且優(yōu)化引物濃度（例如通過增加效率較低的靶的引物濃度）來校 正。也已經使用將肌苷摻入引物來試圖調整引物擴增效率（美國專利No. 5, 738, 995)。另 一種方法為設計嵌合引物，其中每個引物包含與序列特異性靶識別互補的3'區(qū)和由通用序 列組成的5'區(qū)。使用通用序列引物允許不同革E1的擴增效率歸一化（Shuber et al.，Genome Res.，1995, 5:488-493 (Shuber 等人，《基因組研宄》，1995 年，第 5 卷，第 488-493 頁）； 以及美國專利No. 5,882,856)。嵌合引物也已被用于多重等溫鏈置換擴增（美國專利 No. 5, 422, 252、5, 624, 825 和 5, 736, 365)。
[0008] 由于在多重擴增反應中存在多個引物組，多重擴增在很多情況下會因引物的交叉 反應性所產生的假象而復雜化。必須分析所有可能的組合，從而當靶數(shù)量增加時這種情況 變得極其復雜并且嚴重地限制了引物篩選。甚至仔細設計的引物組合往往會產生非特異性 擴增（spurious)產物，該非特異性擴增產物會導致假陰性或假陽性結果。當不止一個反應 同時發(fā)生時，反應動力學和效率發(fā)生改變。每種不同標本類型的每一多重反應必須針對以 下方面進行優(yōu)化:MgCl 2&度以及該濃度與脫氧核苷酸濃度的比率、KC1濃度、擴增酶濃度， 以及擴增反應時間和溫度。多重反應中的試劑之間存在競爭，使得所有的反應平臺提前。因 此，多重反應一般來講靈敏性較差并且通常傾向于比對應的單重反應更易變。
[0009] 同時擴增反應的另一考慮因素是必須有鑒別和檢測每個靶的方法。多重靶的數(shù)量 則進一步受限于反應中染料或其他可分辨標記物部分的數(shù)量。隨著待檢測的不同熒光部分 的數(shù)量增加，結果解釋所需的光學系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析程序的復雜性也增加。一種方法為將經 擴增的多重產物雜交成固相然后再檢測每個靶。這種方法可利用具有定義模式的捕獲探針 的平面雜交平臺（美國專利No. 5, 955, 268)，或者捕獲到可通過流式細胞術分類的微球集 (bead set)上（美國專利 No. 5, 981，180)。
[0010] 由于所討論的大量技術問題，用于多重基因檢測的當前技術是高代價的并且嚴重 受限于可分析的基因的數(shù)量和組合。一般來講，這些反應多重化僅兩個或三個靶，最多約十 個革巴。等溫擴增反應比PCR更復雜甚至更難以多重化（Van Deursen et al.，Nucleic Acid Res.，1999,27:el5(Van Deursen等人，《核酸研宄》，1999年，第27卷，第el5頁））。美國專 利No. 6, 605, 451公開了一種兩步PCR多重反應，其中將少量的每種引物對添加到第一 PCR 反應混合物中，并且進行第一指數(shù)級擴增來增加反應中靶核酸的量。該第一反應終止于對 數(shù)中期，然后分成多個第二反應，每個第二反應包含針對一種靶核酸的引物對。然后進行完 全的指數(shù)級擴增。盡管在第一反應中存在有限量的每種多重引物對，但是仍然存在上文討 論的多重擴增常見問題。此外，這些多種引物對種類可全部轉移到二級擴增反應中，仍然會 造成常見的多重擴增問題。
[0011] 因此，仍然需要允許多重擴增大量的靶而沒有過量設計和優(yōu)化約束、并且避免在 存在多個不同的擴增寡核苷酸對的情況下進行多重擴增的常見問題的方法。此外，持續(xù)需 要改善在多重擴增反應和單重擴增反應兩者的檢測限和/或定量限處的靈敏度和精度。本 發(fā)明滿足了這些和其他需要。

【發(fā)明內容】

[0012] 如在本領域中所實踐的，當開始擴增時，核酸擴增所需的所有組分存在于反應混 合物中（本文中稱為"單階段方法"）。這種單階段方法產生的問題是非所需的副反應通常 會伴隨所需的擴增反應而被引發(fā)。這些副反應往往與所需的擴增反應競爭并從而降低所需 的擴增反應的總體性能。此外，在多重擴增反應中，在該反應混合物中以較高量存在的分析 物或者其總體擴增效率高于其他分析物擴增效率的分析物的擴增與該混合物中其他分析 物的擴增過度競爭并從而使其他分析物的擴增減弱。
[0013] 本文公開的改進方法通過以多階段進行擴增反應解決了這些問題。使用這種方 法，所需的一個或多個反應被引發(fā)并且被允許進行到某一程度，而其他競爭反應的引發(fā)或 發(fā)展則不受反應條件的支持。以此種方式，所需反應實質上在競爭的各反應中領先一步，使 所需反應的總體性能得以改善。此外，通過進行分階段的總體擴增過程，可使多重擴增反應 彼此之間的競爭性變得較小。因此，類似于上文所述的情況，較低效率的反應和/或那些對 應于較低的初始靶分析物水平的反應被允許進行，而發(fā)展未受抑制并且在競爭中比這些反 應明顯占優(yōu)勢的其他反應則不被允許進行?？梢灶A期多階段擴增的一般原理廣泛適用于多 種擴增技術并且可以體現(xiàn)為各種不同的模式，如在本文中更詳細地描述。
[0014] 因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于擴增樣品中的靶核酸序列、包括至少兩 個步驟的方法。首先，在不支持靶核酸序列的指數(shù)級擴增的條件下，使該靶核酸序列經受第 一階段擴增反應。該第一階段擴增反應產生第一擴增產物，該第一擴增產物隨后在允許該 第一擴增產物的指數(shù)級擴增的條件下經受第二階段擴增反應，從而產生第二擴增產物。
[0015] 如上所述，在許多情況下希望檢測和定量同一樣品中的多個靶核酸序列。因此，在 第二方面，本發(fā)明提供了一種用于擴增樣品中的多個不同靶核酸序列、包括至少兩個步驟 的方法。首先，在不支持或者抑制任何靶核酸序列的指數(shù)級擴增的條件下，使所述靶核酸序 列經受第一階段擴增反應。該第一階段擴增反應產生多個第一擴增產物，該第一擴增產物 隨后在允許該第一擴增產物的指數(shù)級擴增的條件下經受第二階段擴增反應，從而產生多個 第二擴增產物。
[0016] 在第二方面的改進型式中，本發(fā)明提供了一種用于擴增樣品中的多個不同靶核酸 序列的方法，其中在該反應的至少一個階段中，一些而并非所有靶核酸序列經受線性擴增， 和/或一些而并非所有靶核酸序列經受指數(shù)級擴增。因此，第一階段擴增的至少四種可能 的變型被設想為：（1)靶序列中的一些經受線性擴增，而剩余的則保持為未擴增；（2)靶序 列中的一些經受指數(shù)級擴增，而剩余的則保持為未擴增；（3)靶序列中的一些經受線性擴 增，一些經受指數(shù)級擴增，而剩余的則保持為未擴增；以及（4)靶序列中的一些經受線性擴 增，而剩余的則經受指數(shù)級擴增。因此，在本發(fā)明的這個方面，第一階段擴增可導致所有靶 核酸序列的擴增（選項4)或者僅其子集的擴增（選項1-3)。該靶核酸序列的子集可表示 已知以相對較低的量存在的靶和/或相比于其他靶難以擴增的祀。第一階段擴增反應產生 一種或多種第一擴增產物。第一擴增產物（一種或多種）和該樣品中任何未擴增的靶核酸 序列（一種或多種）然后在允許該序列的指數(shù)級擴增的條件下經受第二階段擴增反應，從 而產生多個第二擴增產物?；蛘?，可以存在不止兩個階段，其中上述條件1-4可應用于除最 終階段以外的所有階段，并且其中對于最后階段，樣品中任何未擴增或者經線性擴增的靶 核酸序列（一種或多種）在允許該序列的指數(shù)級擴增的條件下經受擴增反應。
[0017] 在第三方面，本發(fā)明提供了一種用于擴增樣品中的靶核酸序列的組合物。該組合 物包含以下組分：(a)擴增寡核苷酸，該寡核苷酸雜交至該靶核酸序列的第一部分；(b)任 選的靶捕獲寡核苷酸，該寡核苷酸雜交至該靶核酸序列的第二部分；以及（c)擴增酶。本發(fā) 明組合物的一個關鍵特征是該組合物缺乏靶核酸序列的指數(shù)級擴增所需的至少一種組分。 如在本申請的其他地方詳細解釋的，本發(fā)明的組合物的一個優(yōu)點是該組合物幫助減少非特 異性的擴增，從而使擴增資源集中在靶序列上。
[0018] 在第四方面，本發(fā)明提供了一種用于擴增樣品中的多個不同靶核酸序列的替代性 組合物。該組合物包含以下組分：(a)多個不同的擴增寡核苷酸復合物，該復合物雜交至多 個不同的靶核酸序列，其中每種擴增寡核苷酸復合物包含具有第一靶特異性序列的第一擴 增寡核苷酸，該第一擴增寡核苷酸接合到具有第二靶特異性序列的第二擴增寡核苷酸；(b) 靶捕獲寡核苷酸，該靶捕獲寡核苷酸雜交至該靶核酸的第二部分，以及（c)擴增酶。再次 地，所述組合物缺乏靶核酸序列的指數(shù)級擴增所需的至少一種組分。
[0019] 在第五方面，本發(fā)明提供了一種用于定量樣品中的靶核酸序列的方法。根據(jù)所述 方法，首先是步驟（a)在允許第一擴增寡核苷酸雜交至靶核酸序列的第一部分的條件下， 使該樣品與特異于該靶核酸序列的第一部分的第一擴增寡核苷酸接觸，從而產生包含該第 一擴增寡核苷酸和該靶核酸序列的預擴增雜交體。接著是步驟（b)通過靶捕獲到固體載體 上，然后洗滌以移除任何未在步驟（a)中雜交至該靶核酸序列的第一部分的第一擴增寡核 苷酸來分離該預擴增雜交體。這個步驟之后是步驟（c)在支持在步驟（b)中分離的預擴增 雜交體的靶核酸序列的至少一部分的線性擴增但是不支持其指數(shù)級擴增的條件下，在第一 階段擴增反應混合物中，在第一階段的、基本上等溫的、轉錄相關的擴增反應中擴增該序列 的至少一部分，從而獲得包含第一擴增產物的反應混合物。一般來講，該第一階段擴增反應 混合物包含第二擴增寡核苷酸，該第二擴增寡核苷酸與第一擴增寡核苷酸的延伸產物的一 部分互補。同樣，第一擴增產物不是用于在第一階段的、基本上等溫的、轉錄相關的擴增反 應期間進行核酸合成的模板。接著是步驟（d)將包含第一擴增產物的反應混合物與參與第 一擴增產物的指數(shù)級擴增但是在包含該第一擴增產物的反應混合物中缺乏的至少一種組 分合并，以產生第二階段擴增反應混合物。一般來講，該第二階段擴增反應混合物另外包含 序列特異性雜交探針。接著是步驟（e)在第二階段的、基本上等溫的、轉錄相關的擴增反 應中在第二階段擴增反應混合物中進行第一擴增產物的指數(shù)級擴增，從而合成第二擴增產 物。這個步驟之后是步驟（f)用該序列特異性雜交探針以固定的時間間隔檢測該第二階段 擴增反應混合物中該第二擴增產物的合成；然后（g)使用從檢測步驟（f)獲得的結果來定 量該樣品中的靶核酸序列。在一個通常優(yōu)選的方法中，所述第一擴增寡核苷酸包含對于RNA 聚合酶的3'靶特異性序列和5