的合成。所述方法的每個步驟都在所述反應容器的不同反應區(qū)中進行。
[0131] 在接收生物序列信息后，組裝單元中的軟件指導寡核苷酸的合成，所述寡核苷酸 通過使用先前向系統(tǒng)中提供的生物構(gòu)件（在本例中為核苷亞磷酰胺構(gòu)件）來合成。該合成 在例如寡核苷酸合成器等子單元上進行。
[0132] 在合成后，通過添加濃縮的氫氧化銨并在55°C下孵育而從固體支持物切割寡核 苷酸，各步驟都以自動化方式來進行而無需在設置后進行進一步人為干預。構(gòu)成每個片段 的寡核苷酸被單獨匯集并通過包含P0LYPAK?填充物（Glen Research, Sterling, VA)的 柱子純化。還可使用在pH范圍1至13下穩(wěn)定的其他填充物。因此，將用水稀釋的氫氧 化銨溶液直接加載在填充物上。在洗脫失敗序列后，從支持物結(jié)合的寡核苷酸去除并洗 滌三苯甲基保護基。然后，可洗脫完全脫保護的產(chǎn)物并通過凍干分離。使用適于自動化 的脫保護程序，例如使用乙二胺（EDA)/甲苯溶液的柱上脫保護。還可使用基于順磁珠的 純化系統(tǒng)，其一個實例是 AGENCOURT? COSMCPREP? (Agencourt Bioscience Corp.，Beverly, MA)。在上述程序之后，生產(chǎn)了四個寡核苷酸池，構(gòu)成產(chǎn)生PhiX的重疊 dsDNA片段所需的四個片段的每一個。
[0133] 由于生產(chǎn)四個重疊PhiX子組件的GIBSONASSEMBLY?(Synthetic Genomics,SanDiego,CA)
[0134] 以下步驟也由可在需要和方便時具有許多子單元的組裝單元以自動化方式進行。 組裝單元的每個子單元預先裝有進行所有步驟所必需的試劑。在寡核苷酸組裝后，使用機 械臂將反應容器從寡核苷酸合成器轉(zhuǎn)移至具有熱循環(huán)能力的液體處理器。以完全自動化 的方式，將上述四個寡核苷酸池各10 y 1添加至l〇ul的PCR組裝試劑--可使用約10 yM 的稀釋液。PCR 試劑的方便形式是 2X HF PHUSION(?Mix(Thermo Fisher Scientific 0y，0y，F(xiàn)l)。下文提供了方案。
[0135] 組裝反應在50°C下進行30分鐘至60分鐘，然后反應溫度變化并保持在10°C。
[0136] 第一PCR和誤差校正
[0137] 1.對于每個組裝產(chǎn)物，以自動化方式進行PCR反應：
[0138] 25. 00u1 2XHFPHUSION?Mix(ThermoFisherScientific0y，0y，F(xiàn)1)
[0139] 0.25 4 1末端引物1(10〇1^)
[0140] 0.25yl末端引物2(100yM)
[0141] 22ul 水
[0142] 2. 5 y 1模板（來自上文的反應產(chǎn)物的 GIBSONASSEMBLY? (Synthetic Genomics,Inc.,SanDiego,CA))
[0143] 2.使用以下參數(shù)進行熱循環(huán)：
[0144] 98°C 1分鐘
[0145]循環(huán) 25X{98°C 10 秒，60°C 30 秒，72°C 1. 5 分鐘）
[0146] 72°C5 分鐘
[0147] 98°C2 分鐘
[0148] 2°C/秒增加至 85°C
[0149] 85°C2 分鐘
[0150] 0? 1°C / 秒降至 25°C
[0151] 25°C2 分鐘
[0152] 然后維持在10 °C
[0153] 3?將6. 25 y 1 S/E誤差校正混合物添加（以下方案）至各樣品
[0154] 4.在42°C下進行誤差校正反應1小時，然后反應溫度變化并維持在10°C。
[0155]第二 PCR
[0156] 1.還由組裝單元的熱循環(huán)子單元以自動化方式進行以下四個PCR反應：
[0157]每個反應 25. OOul 2XHOTSTART-IT? Taq Master Mix (Affymetrix, Inc.， Santa Clara, CA)或替代物（PHUSION?(Thermo Fisher Scientific 0y，0y, FI)
[0158] 0.25yl 引物 l(100yM)
[0159] 0? 25 y 1 引物 2(100 yM)
[0160] 22.00 yl MBG 水
[0161] 2. 50 yl來自上面的誤差校正模板。
[0162] 用于將四個子組件組合成PhiX基因組的GIBSON ASSEMBLYTM{Synthetic Genomics, San Diego, CA)
[0163] 以自動化方式進行以下程序：
[0164] 1.從上面的第二PCR中取出四種擴增子各2. 5 y 1，并匯集入96孔板的另一個位 置。
[0165] 2?添加2yl Notl限制酶，并在37°C下孵育1小時，然后65°C 20分鐘以使Notl 酶失活。
[0166] 3?添加 12 y 1 2X GIBSON ASSEMBLYTM (Synthetic Genomics, Inc.，San Diego, CA)主混合物，并在50°C下孵育1小時。
[0167] 活性PhiX病毒的生產(chǎn)
[0168] 在該步驟中，產(chǎn)生活性病毒顆粒。還可以自動化方式進行這些步驟。在如上文描 述進行DNA合成和組裝后，將組裝的0X174基因組與化學感受態(tài)大腸桿菌菌株C或另一 0X174敏感的大腸桿菌菌株（例如，DH10)合并。在42°C熱激后，在S0C培養(yǎng)基中恢復細 胞。
[0169] 1.在容器中將5 yl上面的組裝反應物與50 yl化學感受態(tài)DH10大腸桿菌細胞合 并。
[0170] 2?根據(jù)以下條件進行熱循環(huán)：
[0171] 4°C2 分鐘
[0172] 42°C30 秒
[0173] 4°C2 分鐘
[0174] 3.添加150yl S0C培養(yǎng)基，并在37°C下孵育細胞若干小時
[0175] 從大腸桿菌純化活性噬菌體顆粒，并測試其在涂布于包含大腸桿菌細胞的LB瓊 脂平板上時形成噬菌斑的能力（Smith等，PNAS2003)。
[0176] 作為轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞的替代方法，還可能測試在無細胞體系中形成活性噬菌體 顆粒的能力。在該實施方案中，將合成的基因組在上述無細胞的表達試劑盒之一中孵育2 小時。
[0177] 試劑組分成分
[0178]GIBSON ASSEMBLY? (Synthetic Genomics, Inc.，San Diego, CA)的組分。
[0179] 1. 5X 等溫（ISO)反應緩沖液（25% PEG-8000,500mM Tris-HCIpH 8. 0,50mM
[0180] MgCl2, 50mM DTT，4種dNTP各ImM，以及5mM NAD)。如下文描述的制備該緩沖液。
[0181] 2. T5核酸外切酶
[0182] 3. PHUSTON?高保真 DNA 聚合酶（Thermo Fisher Scientific 0y, 0y, F1)
[0183] 4.TaqDNA 連接酶
[0184] 方法程序
[0185] 1.制備5X ISO緩沖液?？赏ㄟ^合并以下物質(zhì)來制備6ml該緩沖液：
[0186] 3ml 1M Tris-HCI pH 8. 0
[0187] 300 y 1 1M MgCI2
[0188] 600 y 1 lOmM dNTP
[0189]300y1 1M DTT(1. 54g 溶解于 dH20 至 10ml)
[0190] 1. 5g PEG-8000
[0191] 300 y 1 lOOmM NAD(0. 66g溶解于dH20至10ml ;通過在50°C下、然后連續(xù)渦旋而 重懸）
[0192] 添加水至6mi。等分成1ml，并儲存于-20°C。
[0193] 2.制備足以用于80次反應的800 y 1組裝主混合物。這可通過合并以下物質(zhì)來制 備：
[0194] 320 yl 5X ISO 緩沖液
[0195] 6. 4 y 1 1U/ y 1 T5exo (將酶儲液以1:10稀釋于1 XT5exo緩沖液中）
[0196] 20ul 2U/ y 1 PHUSION? 高保真 DNA 聚合酶（Thermo Fisher Scientific 〇y, 〇y, FI)
[0197] 80yl 40U/yl Taq 連接酶
[0198] 374 y I dH20
[0199] 使混合物充分混合并儲存于-20°C，或者如果將立即使用則儲存于冰上。
[0200] 3.組裝混合物可以_20°C儲存至少一年。酶在至少10次凍融循環(huán)后仍保持活性。
[0201] 該混合物理想用于組裝具有20bp至150bp重疊的DNA分子。
[0202] 誤差校正混合物組分-SURVEYOR核酸酶+核酸外切酶III (S/E)
[0203] 250 y 1 SURVEYOR?核酸酶（Transgenomic Inc.，Omaha，NE)+0. 03125 y 1 核酸 外切酶111
[0204] PhiX基因組序列：
[0205] SEQ ID NO ：5
[0206] GAGTTTTATCGCTTCCATGACGCAGAAGTTAACACTTTCGGATATTTCTGATGAGTCGAAAAATTATCT TGATAAAGCAGGAATTACTACTGCTTGTTTACGAATTAAATCGAAGTGGACTGCTGGCGGAAAATGAGAAAATTCGA CCTATCCTTGCGCAGCTCGAGAAGCTCTTACTTTGCGACCTTTCGCCATCAACTAACGATTCTGTCAAAAACTGACG CGTTGGATGAGGAGAAGTGGCTTAATATGCTTGGCACGTTCGTCAAGGACTGGTTTAGATATGAGTCACATTTTGTT CATGGTAGAGATTCTCTTGTTGACATTTTAAAAGAGCGTGGATTACTATCTGAGTCCGATGCTGTTCAACCACTAAT AGGTAAGAAATCATGAGTCAAGTTACTGAACAATCCGTACGTTTCCAGACCGCTTTGGCCTCTATTAAGCTCATTCA GGCTTCTGCCGTTTTGGATTTAACCGAAGATGATTTCGATTTTCTGACGAGTAACAAAGTTTGGATTGCTACTGACC GCTCTCGTGCTCGTCGCTGCGTTGAGGCTTGCGTTTATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCT CCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGA AGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCT TGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCGGAAGGA GTGATGTAATGTCTAAAGGTAAAAAACGTTCTGGCGCTCGCCCTGGTCGTCCGCAGCCGTTGCGAGGTACTAAAGGC AAGCGTAAAGGCGCTCGTCTTTGGTATGTAGGTGGTCAACAATTTTAATTGCAGGGGCTTCGGCCCCTTACTTGAGG ATAAATTATGTCTAATATTCAAACTGGCGCCGAGCGTATGCCGCATGACCTTTCCCATCTTGGCTTCCTTGCTGGTC AGATTGGTCGTCTTATTACCATTTCAACTACTCCGGTTATCGCTGGCGACTCCTTCGAGATGGACGCCGTTGGCGCT CTCCGTCTTTCTCCATTGCGTCGTGGCCTTGCTATTGACTCTACTGTAGACATTTTTACTTTTTATGTCCCTCATCG TCACGTTTATGGTGAACAGTGGATTAAGTTCATGAAGGATGGTGTTAATGCCACTCCTCTCCCGACTGTTAACACTA CTGGTTATATTGACCATGCCGCTTTTCTTGGCACGATTAACCCTGATACCAATAAAATCCCTAAGCATTTGTTTCAG GGTTATTTGAATATCTATAACAACTATTTTAAAGCGCCGTGGATGCCTGACCGTACCGAGGCTAACCCTAATGAGCT TAATCAAGATGATGCTCGTTATGGTTTCCGTTGCTGCCATCTCAAAAACATTTGGACTGCTCCGCTTCCTCCTGAGA CTGAGCTTTCTCGCCAAATGACGACTTCTACCACATCTATTGACATTATGGGTCTGCAAGCTGCTTATGCTAATTTG CATACTGACCAAGAACGTGATTACTTCATGCAGCGTTACCATGATGTTATTTCTTCATTTGGAGGTAAAACCTCTTA TGACGCTGACAACCGTCCTTTACTTGTCATGCGCTCTAATCTCTGGGCATCTGGCTATGATGTTGATGGAACTGACC AAACGTCGTTAGGCCAGTTTTCTGGTCGTGTTCAACAGACCTATAAACATTCTGTGCCGCGTTTCTTTGTTCCTGAG CATGGCACTATGTTTACTCTTGCGCTTGTTCGTTTTCCGCCTACTGCGACTAAAGAGATTCAGTACCTTAACGCTAA AGGTGCTTTGACTTATACCGATATTGCTGGCGACCCTGTTTTGTATGGCAACTTGCCGCCGCGTGAAATTTCTATGA AGGATGTTTTCCGTTCTGGTGATTCGTCTAAGAAGTTTAAGATTGCTGAGGGTCAGTGGTATCGTTATGCGCCTTCG TATGTTTCTCCTGCTTATCACCTTCTTGAAGGCTTCCCATTCATTCAGGAACCGCCTTCTGGTGATTTGCAAGAACG CGTACTTATTCGCCACCATGATTATGACCAGTGTTTCCAGTCCGTTCAGTTGTTGCAGTGGAATAGTCAGGTTAAAT TTAATGTGACCGTTTATCGCAATCTGCCGACCACTCGCGATTCAATCATGACTTCGTGATAAAAGATTGAGTGTGAG GTTATAACGCCGAAGCGGTAAAAATTTTAATTTTTGCCGCTGAGGGGTTGACCAAGCGAAGCGCGGTAGGTTTTCTG CTTAGGAGTTTAATCATGTTTCAGACTTTTATTTCTCGCCATAATTCAAACTTTTTTTCTGATAAGCTGGTTCTCAC TTCTGTTACTCCAGCTTCTTCGGCACCTGTTTTACAGACACCTAAAGCTACATCGTCAACGTTATATTTTGATAGTT TGACGGTTAATGCTGGTAATGGTGGTTTTCTTCATTGCATTCAGATGGATACATCTGTCAACGCCGCTAATCAGGTT GTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCTTTTGATGCCGACCCTAAATTTTTTGCCTGTTTGGTTCGCTTTGAGTCTTCTTC GGTTCCGACTACCCTCCCGACTGCCTATGATGTTTATCCTTTGAATGGTCGCCATGATGGTGGTTATTATACCGTCA AGGACTGTGTGACTATTGACGTCCTTCCCCGTACGCCGGGCAATAACGTTTATGTTGGTTTCATGGTTTGGTCTAA CTTTACCGCTACTAAATGCCGCGGATTGGTTTCGCTGAATCAGGTTATTAAAGAGATTATTTGTCTCCAGCCACTT AAGTGAGGTGATTTATGTTTGGTGCTATTGCTGGCGGTATTGCTTCTGCTCTTGCTGGTGGCGCCATGTCTAAATT GTTTGGAGGCGGTCAAAAAGCCGCCTCCGGTGGCATTCAAGGTGATGTGCTTGCTACCGATAACAATACTGTAGGCA TGGGTGATGCTGGTATTAAATCTGCCATTCAAGGCTCTAATGTTCCTAACCCTGATGAGGCCGCCCCTAGTTTTGTT TCTGGTGCTATGGCTAAAGCTGGTAAAGGACTTCTTGAAGGTACGTTGCAGGCTGGCACTTCTGCCGTTTCTGATAA GTTGCTTGATTTGGTTGGACTTGGTGGCAAGTCTGCCGCTGATAAAGGAAAGGATACTCGTGATTATCTTGCTGCTG CATTTCCTGAGCTTAATGCTTGGGAGCGTGCTGGTGCTGATGCTTCCTCTGCTGGTATGGTTGACGCCGGATTTGAG AATCAAAAAGAGCTTACTAAAATGCAACTGGACAATCAGAAAGAGATTGCCGAGATGCAAA