一種乳酸菌的固定化膠囊及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種乳酸菌的固定化膠囊及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]亞硝酸鹽是廣泛存在于自然環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)，是強(qiáng)致癌物亞硝胺的前體物質(zhì)，其在胃部可與食品中蛋白質(zhì)分解的中間產(chǎn)物仲胺反應(yīng)形成亞硝胺，進(jìn)而誘發(fā)多種癌癥如胃癌、肝癌、大腸癌和食道癌等。雖然國家對食品中亞硝酸鹽的添加量有著嚴(yán)格的限制，但由于食物中亞硝酸鹽過量而引起食物中毒的事件時有發(fā)生。目前，由于氮肥的大量使用以及一些地區(qū)使用生活污水和工業(yè)廢水灌溉，導(dǎo)致地下水亞硝酸鹽污染嚴(yán)重，糧食蔬菜中亞硝酸鹽含量超標(biāo)也較為普遍。此外，傳統(tǒng)腌制泡菜及各種加工肉制品中也一直存在亞硝酸鹽超標(biāo)問題。另外，根據(jù)一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，癌癥高發(fā)區(qū)居民飲水中亞硝酸鹽含量高于低發(fā)區(qū)。
[0003]鑒于食品中亞硝酸鹽超標(biāo)引起的嚴(yán)重危害，人們正在努力地尋找有效的控制或降解亞硝酸鹽的方法，生物法降解食品中過量的亞硝酸鹽是一條可行的途徑。目前，人們已經(jīng)從自然界中分離獲得了一些亞硝酸鹽降解菌，其中，乳酸菌作為一種益生菌也能有效地降解亞硝酸鹽。
[0004]但目前尚沒有乳酸菌的固定化膠囊用于降解亞硝酸鹽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種乳酸菌的固定化膠囊，該乳酸菌的固定化膠囊采用海藻酸鈉和殼聚糖作為固定化材料。
[0006]本發(fā)明的目的之二在于提供上述一種乳酸菌的固定化膠囊的制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的之三在于將上述乳酸菌的固定化膠囊用于降解食品中的亞硝酸鹽。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)原理
對于生物降解亞硝酸鹽，固定化細(xì)胞是一種有效的方法，它不僅可以提高細(xì)胞對苯酚的耐受性，而且可以重復(fù)使用。包埋法是應(yīng)用最廣泛的固定化方法。海藻酸鈉、殼聚糖由于價格低廉、對細(xì)胞無毒性而成為廣泛使用的包埋材料，因此，可用其作為固定化細(xì)胞的載體。
[0009]采用檸檬酸鈉將微膠囊固芯液化，可以減小細(xì)胞生長的空間位阻和微膠囊的傳質(zhì)阻力，有助于微囊化細(xì)胞的生長和生產(chǎn)。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案
一種乳酸菌的固定化膠囊，通過包括如下步驟的方法制備而成:
(I)、濕乳酸菌菌體的制備
挑取一環(huán)斜面保存的乳酸菌于5 ml的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)20h，得第一代菌種；
將第一代菌種，按體積百分比計(jì)算，以10%的接種量接種到MR液體S培養(yǎng)基，37°C靜止培養(yǎng)20h，得第二代菌種；
將第二代菌種，按體積百分比計(jì)算，以10%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)12h，即得培養(yǎng)液I ;
向所得的培養(yǎng)液I中加入為培養(yǎng)液I體積0.01倍的濃度為0.8-lmol/L亞硝酸鹽水溶液進(jìn)行培養(yǎng)8h，即得培養(yǎng)液2 ;
將所得的培養(yǎng)液2于4 °C、4000rpm離心lOmin，收集菌體，用無菌水振蕩洗滌后4000rpm離心lOmin，重復(fù)無菌水振蕩洗滌、離心步驟一次，得到的沉淀即為濕乳酸菌菌體；
(2)、將濕乳酸菌菌體與質(zhì)量百分比濃度為2%的海藻酸鈉水溶液混合均勻，靜止
15-20min后，得到混合液；
上述濕乳酸菌菌體與質(zhì)量百分比濃度為2%的海藻酸鈉水溶液的用量，按濕乳酸菌菌體:質(zhì)量百分比濃度為2%的海藻酸鈉水溶液為lg:1Oml的比例計(jì)算；
(3)、將步驟(2)所得的混合液吸入到無菌注射器中，以1.5-2ml/min的速度的垂直滴入到質(zhì)量百分比濃度為1.5%的氯化鈣水溶液中，以150r/min轉(zhuǎn)速攪拌，固化20_30min，通過過濾方法除去氯化鈣水溶液，得到凝膠珠；
(4)、將步驟(3)所得的凝膠珠用無菌蒸餾水洗滌三次，然后加入凝膠珠體積10倍的質(zhì)量百分比濃度為2%的殼聚糖醋酸水溶液進(jìn)行成膜反應(yīng)15min，所得的反應(yīng)液中加入為其體積10倍的質(zhì)量百分比濃度為0.15%的海藻酸鈉水溶液進(jìn)行固定lOmin，然后用普通濾紙過濾，所得沉淀I用PH5.0、濃度為0.055mol/L的檸檬酸鈉水溶液作用lOmin，然后用100目的篩網(wǎng)過濾，所得沉淀2即為乳酸菌的固定化膠囊，乳酸菌的固定化膠囊的直徑為1.0-2.5mm0
[0011]上述所得的乳酸菌的固定化膠囊在降解亞硝酸鹽中的應(yīng)用，即將所述的乳酸菌的固定化膠囊加入到亞硝酸鹽水溶液中，靜止放置72h，即完成亞硝酸鹽的降解處理，亞硝酸鹽降解率達(dá)96-98%，并且乳酸菌的固定化膠囊重復(fù)使用五次后，效果不降低，亞硝酸鹽降解率仍均在96-98% ；
所述的乳酸菌的固定化膠囊的加入量，按乳酸菌的固定化膠囊:亞硝酸鹽水溶液中的亞硝酸鹽為lg:10-15ymol的比例計(jì)算；
所述的亞硝酸鹽水溶液為質(zhì)量百分比濃度為0.2g/L的亞硝酸鹽水溶液，優(yōu)選為質(zhì)量百分比濃度為0.2g/L的亞硝酸鈉水溶液。
[0012]本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的乳酸菌的固定化膠囊，由于采用海藻酸鈉和殼聚糖作為固定化材料包埋乳酸菌，其可用于降解食品中過量亞硝酸鹽。
[0013]進(jìn)一步，本發(fā)明的乳酸菌的固定化膠囊，由于制備過程中采用檸檬酸鈉將微膠囊固芯液化，從而可以減小細(xì)胞生長的空間位阻和微膠囊的傳質(zhì)阻力，因此所得的乳酸菌固定化膠囊具有生物相容性好、易于小分子擴(kuò)散、耐酸堿等特點(diǎn)，因此該乳酸菌固定化膠囊多次應(yīng)用于水中亞硝酸鹽的處理，降解率較高，穩(wěn)定性較好。乳酸菌的固定化膠囊重復(fù)使用五次，在72h內(nèi)對質(zhì)量百分比濃度為0.2g/L的亞硝酸鹽的降解率在96-98%，因此乳酸菌的固定化膠囊用于生物法處理食品中過量亞硝酸鹽具有高效性。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明。
[0015]亞硝酸鹽含量的測定方法采用GB 5009.33-2010中的鹽酸萘乙二胺法。
[0016]本發(fā)明的實(shí)施例中所用的MRS液體培養(yǎng)基，按每升計(jì)算，含5.0 g葡萄糖、10.0 g牛肉膏、5.0 g酵母膏、10.0 g大豆蛋白胨、5.0 g無水乙酸鈉、2.0 g梓檬酸三錢、1.0 g磷酸氫二鉀、0.2 g硫酸鎂、0.05 g硫酸猛，余量為去離子水，pH值7.0。
[0017]本發(fā)明的實(shí)施例中所用的乳酸菌，為植物乳桿菌h2，由上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生物工程室分離鑒定與保存，可對外商業(yè)提供。
[0018]實(shí)施例1
一種乳酸菌的固定化膠囊，通過包括如下步驟的方法制備而成:
(1)、濕乳酸菌菌體的制備
挑取一環(huán)斜面保存的乳酸菌于5ml的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)20h，得第一代菌種；
將第一代菌種，按體積百分比計(jì)算，以10%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基，37°C靜止培養(yǎng)20h，得第二代菌種；
將第二代菌種，按體積百分比計(jì)算，以10%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)12h，即得培養(yǎng)液I ;
向所得的培養(yǎng)液I中加入為培養(yǎng)液I體積0.01倍的濃度為0.8-lmol/L亞硝酸鹽水溶液進(jìn)行培養(yǎng)8h，即得培養(yǎng)液2 ;
將所得的培養(yǎng)液2于4 °C、4000rpm離心lOmin，收集菌體，用無菌水振蕩洗滌后4000rpm離心lOmin，重復(fù)無菌水振蕩洗滌、離心步驟一次，得到的沉淀即為濕乳酸菌菌體；
(2)、將28濕乳酸菌菌體與20mL質(zhì)量百分比濃度為2%的海藻酸鈉水溶液混合均勻，靜止10-15min后，得到混合液；
(3)、將步驟(2)所得的混合液吸入到5mL的無菌注射器中，以1.5-2.0ml/min的速度的垂直滴入到質(zhì)量百分比濃度為1.5%的氯化鈣水溶液中，以150r/min轉(zhuǎn)速攪拌，固化20-30min，通過過濾方法除去氯化鈣水溶液，得到凝膠珠；
(4)、將步驟(3)所得的凝膠珠用無菌蒸餾水洗滌三次，然后加入凝膠珠體積10倍的質(zhì)量百分比濃度為2%的殼聚糖醋酸水溶液進(jìn)行成膜反應(yīng)15min，所得的反應(yīng)液中加入為其體積10倍的質(zhì)量百分比濃度為0.15%的海藻酸鈉水溶液進(jìn)行固定lOmin，然后用普通濾紙過濾，所得沉淀I用PH5.0、濃度為0.055mol/L的檸檬酸鈉水溶液作用lOmin，然后用100目的篩網(wǎng)過濾，所得沉淀2即為乳酸菌的固定化膠囊，乳酸菌的固定化膠囊的直徑經(jīng)檢測為1.0-2.5mm0
[0019]對照實(shí)施例1
一種乳酸菌的固定化膠囊，通過包括如下步驟的方法制備而成:
(I)、濕乳酸菌菌體的制備
挑取一環(huán)斜面保存的乳酸菌于5ml的MRS液體